cô lập và nhận danh các hợp chất từ cao ethyl acetate của địa y roccella sinensis (nyl ) hale thu hái ở bình thuận

Các loại hợp chất khác nhau và các dẫn suất của depside được chiết từ các chi Evernia, Parmelia và Ramalina, một số có mùi hương hấp dẫn được dùng trong xà phòng và nước hoa.. Với những

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HCM

ROCCELLA SINENSIS (NYL.) HALE

THU HÁI Ở BÌNH THUẬN

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2013

L ỜI CẢM ƠN

- -

Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền

với những sự hổ trợ,giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác

 Thầy Hồ Xuân Đậu, người mà đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức chuyên môn, hướng dẫn và truyền đạt nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quý báu trong suốt thời gian em học tập, thực hiện và hoàn thành đề tài

 Thầy Dương Thúc Huy đã tận tình truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn, tạo

mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện

y Cetraria islandica bán rộng rãi trong các tiệm bào chế thuốc ở Thụy Điển và dùng để

điều trị bệnh đái tháo đường, bệnh phổi và bệnh viêm mũi Peltigera canina được sử

dụng ở Ấn Độ như một dược phẩm làm giảm các cơn đau gan[1]

Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa Các loại hợp chất khác nhau và các dẫn suất của depside được chiết từ

các chi Evernia, Parmelia và Ramalina, một số có mùi hương hấp dẫn được dùng trong

xà phòng và nước hoa Đặc biệt, địa y được xem như là các chất chỉ thị sinh học cho ô nhiễm môi trường

Với những công dụng đó, địa y được nhiều nhà hóa dược nghiên cứu, nhiều hợp

chất tự nhiên được cô lập và một số được xác định có hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng virut, giảm đau, hạ sốt[3,4] , …

Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm Nhờ dạng

sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây, trong những điều

kiện khác nghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm

thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân bố phong phú và đa

dạng Để góp phần vào sự phát triển của khoa học Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn

loại địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale thuộc chi Rocellaceae thu hái ở tỉnh Bình

Thuận, Việt Nam để nghiên cứu

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

MỤC LỤC 2

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỀU 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 5

1.1 KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y 5

1.1.1 Định nghĩa và phân loại địa y 5

1.1.2 Vai trò của các hợp chất tự nhiên trong địa y [9] 5

1.1.3 Một số ứng dụng của địa y 6

1.2 HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y 6

1.2.1 Hoạt tính kháng virus của các hợp chất địa y[5] 6

1.2.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao[5] 7

1.2.3 Hoạt tính kháng ung thư và kháng đột biến của các hợp chất địa y[5] 7

1.2.4 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y[5] 8

1.2.5 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y[5] 8

1.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG ĐỊA Y 9

1.4 MÔ TẢ THỰC VẬT ROCCELLA SINESIS (NYL.) HALE 10

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU HÓA HỌC TRONG CHI ROCCELLA 10

1.5.1 Các acid béo 10

1.5.2 Các hợp chất aliphatic vòng 10

1.5.3 Các carbohydrat 10

1.5.4 Các hợp chất carotenoid 11

1.5.5 Các hợp chất Chromane và Chromone 11

1.5.6 Các hợp chất depside 11

1.5.7 Các hợp chất dibenzofurane 11

1.5.8 Các hợp chất chứa N 11

1.5.10 Công thức hóa học các hợp chất 12

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 14

2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 14

2.1.1 Hóa chất 14

2.1.2 Thiết bị 14

2.2 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 14

2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 15

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất C0A 17

3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất RS-A4 17

3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất RS-A3 19

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) Heteronuclear Single Quantum Correlation

Heteronuclear Multiple Bond Coherence Proton Nuclear Magnetic Resonance Carbon Nuclear Magnetic Resonance High-Perfo Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

Hằng số tương tác spin-spin Part per million

Tia cực tím (Ultra violet) Hight Resolution- Electro Spray Ionization -Mass Spectrometry Ether dầu

Ethyl acetate Chloroform Methanol Acid Acetic

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỀU

Hình 1 Ba dạng chính của địa y 5

Hình 2 Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y 9

Hình 3 Địa y Roccella sinensis 10

Hình 4 Tương quan trong hợp chất RS-A3 20

Sơ đồ Sơ đồ 1 Sơ đồ điều chế các cao của địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale 15

Sơ đồ 2 Quy trình sắc kí cột trên cao etyl acetat EA3 16

Bảng biểu Bảng 1 Số liệu phổ NMR của hợp chất RS-A4 và C 0 A 18

Bảng 2 Số liệu phổ NMR của hợp chất RS-A3 20

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y

1.1.1 Định nghĩa và phân loại địa y

Địa y là một dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, nó là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay

vi khuẩn lam (cyanobacterium) Hiện nay có khoảng 17000 loài địa y đã được tìm

thấy Địa y thường được chia làm ba dạng chính: dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (frucose)

Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu

bọ và các loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước và khoáng chất Kết quả từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt,

chủ yếu ở vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên

đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh [6]

− Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao

− Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại

− Các carboxylic acid từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate)

− Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng

1.1.3 Một số ứng dụng của địa y

Địa y đã được sử dụng làm thực phẩm, làm phẩm nhuộm, nguyên liệu thô trong

sản xuất nước hoa và trong y học cổ truyền

1.2 HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y

Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh

học và nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên Tuy vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa y phát triển rất chậm Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10% địa y được nuôi cấy thành công, tuy nhiên chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất

có trong cùng loại địa y tự nhiên [5].Lê Hoàng Duy [6] đã nghiên cứu nuôi cấy thành công 10 % trên khoảng 50 loài địa y lấy từ Việt Nam Tuy đạt thành công về mặt cô

lập hợp chất mới nhưng hầu như các hợp chất cô lập từ địa y nuôi cấy đều khác so với các hợp chất địa y tự nhiên

Khoảng gần 1000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay Nghiên cứu về

hoạt tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống

kê đầy đủ của Boustie (2007) [9], Huneck (1999) [10], Muller (2001) [11] về kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme …

Depsidone: virensic acid và dẫn xuất Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực

khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV Butyrolactone acid:

protolichesterinic acid

Sao chép ngược HIV

(+)-Usnic acid và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV)

Emodin, 7-Cloroemodin,

7-Chloro-1-O-methylemodin,

5,7-Dichloroemodin, Hypericin

HIV, cytomegalovirus và các virus khác

1.2.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao [5]

Barbatic acid,

4-O-demethylbarbatic acid, diffractaic

acid, evernic acid, lecanoric acid,

β-orcinolcarboxylic acid, orsellinic

acid

Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp

Ergochrome AA (secalonic acid A) Gây độc cho thực vật

Evernic acid Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau

bina Lecanoric acid Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây

(-)-Usnic acid Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu

P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại

tế bào sừng hóa HaCaT Protolichesterinic acid Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu

K-562 và khối u rắn Ehrlich Pannarin, 1-Chloropannarin,

Sphaerophorin

Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào

Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa Scabrosin ester và dẫn xuất,

Euplectin

Gây độc chống lại tế bào murine P815 mastocytoma và các dòng tế bào khác Hydrocarpone, Salazinic acid, Stitic

acid

Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan

chuột Psoromic acid, Chrysophanol,

Emodin và dẫn xuất

Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu

1.2.4 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y [5]

Usnic acid và các dẫn xuất Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp.,

Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum

Protolichesterinic acid Helicobacter pylori

Methyl orsellinate, Ethyl orsellinate,

Methyl β-orsellinate, Methyl

haematommate

Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M gypseum, Trichophyton rubrum, T mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida

albicans

Alectosarmentin Staphylococcus aureus, Mycobacterium

smegmatitis

Atranorin Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase

Bis-(2,4-dihydroxy-6-n-propylphenyl)methane, Divarinol,

cao chiết từ Cetraria juniperina,

Hypogymnia physodes và Letharia

vulpina

Tyrosinase

Confluentic acid,

2β-O-Methylperlatolic acid

Monoaminoxidase B

4-O-Methylcryptochlorophaeic acid Prostataglandinsynthetase

(+)-Protolichesterinic acid 5-Lipoxygenase (Sao chép ngược HIV)

1.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG ĐỊA Y

Có nhiều hệ thống phân loại các hợp chất hóa học từ địa y, trong đó hệ thống phân loại được sử dụng nhiều nhất là hệ thống phân loại do Shibata và cộng sự đề nghị[3]

• Ngu ồn gốc shikimic acid: terphenylquinone và dẫn xuất của tetronic acid

• Ngu ồn gốc mevalonic acid: terpenoid, steroid

T ảo

N ấm

1.4 MÔ TẢ THỰC VẬT ROCCELLA SINESIS (NYL.) HALE

Tên khoa học: Roccella sinensis (Nyl.) Hale

Họ: Rocellaceae

Mô tả thực vật: là loại địa y dạng sợi thường mọc trên các thân cây cao, sợi dài, mảnh, có màu xanh xám

Năm 1970, Ferguson G., Mackey I R tìm ra acetylportentol (3) từ Roccella

lập được prortentol (4) từ Roccella galapagones[15]

1.5.3 Các carbohydrat

Năm 1969, C F Culberson đã cô lập được hợp chất meso-erythitol (5) từ

Năm 1945, Anker R M., Cook A H đã cô lập được ethyl orsellinate (7) từ

A., Marcuccio S M.,Whitton A A (1987); Gavin J., Tabacchi R (1975); Hase T A.,

Suokas E,, McCoy K (1978)

Năm 1969, C.F Culberson và các cộng sự đã cô lập được (+)-montagnetol (8) từ

Năm 1988, Czeczuga đã cô lập được các β-carotene (9) từ Roccella fuciformis[18]

và γ-carotene (10) từ Roccella montagnei Bell[18]

Năm 1972, Hucneck S., Follmann G đã tìm được lobodirin (12) từ Roccella

2-methyl-5-hidroxy-6hidroxymethyl-7-methoxychromone (13) từ Roccella fuciformis[20]

Năm 1992, Huneck S., Jakupovic J., Follmann G đã cô lập được mollin (14) và

roccellin (15) từ Roccellaria mollis[21]

Năm 1992, Huneck S., Jakupovic J., Follmann

G đã công bố hợp chất galapagin (16) từ Roccella galapagoensis Follm[21]

1.5.6 Các hợp chất depside

Năm 1980, Sundholm E G và Huneck S đã cô lập được erythrin (17) từ

Năm 1991, Huneck S.và cộng sự đã cô lập được 9-methyl pannarate (18) từ

Năm 1993, Huneck S và cộng sự của mình đã tìm thấy 3-O-demethylschizopeltic

acid (19) từ Roccella hypomecha Bory[24]

1.5.10 Công thức hóa học các hợp chất

O Me

Me HOOC

O

Roccellic acid (2) Roccellaric acid (1)

OH

OH

CH2OH OH

H H OH

H H

D-tagatose (6)

Me COOC2H5OH HO

Ethyl orsellinate (7) (+)- Montagnetol (8)

Me O

OAc

OAc AcO

O

CH3HOOC

2-methyl-5-hidroxy-6-methoxychromone (13)

O

O OH HOH2C

O OAc

O OAc

Me HO

OH

COOMe

Me COO

Me

OH

COO CH2

OH H

OH H

OMe O

Me

N

HO

NH O

OMe O Me

Roccanin (21)

HN N

3-O-Demethylschizopeltic acid (19)

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất

Dung môi dung trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm ether

dầu hỏa (60-90oC), ether dầu hỏa thắp sáng (40-60oC), ethyl acetate, acid acetic, chloroform, acetone, methanol điều là hóa chất của hãng Chemsol-Việt Nam và được làm khan bằng Na2SO4 nếu sử dụng lại và nước cất

Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung

dịch acid sulfuric 30%, vanillin/H2SO4, soi UV

Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột 70- 30, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm, Ấn Độ

2.1.2 Thiết bị

− Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, bình lóng)

− Máy cô quay chân không kèm bếp cách thủy

− Cột sắc ký: cột cổ điển

− Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F254 Merck

− Các thiết bị ghi phổ: Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1

H-NMR và

125 MHz cho phổ 13C-NMR

Tất cả phổ được ghi tại: Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

Tên khoa học: Roccella sinensis (Nyl.) Hale

Họ: Rocellaceae

Địa y mọc trên thân cây chín tầng ở chùa Hang, ở độ cao 300 mét so với mực nước biển, huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận

Mẫu ký hiệu US-B028, được lưu trong quyển tiêu bản thực vật, bộ môn Hóa hữu

cơ, khoa Hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM

Tên khoa học của địa y được xác định bởi tiến sĩ Harrie J M Sipman, Khoa

Thực vật học, Đại Học Freie, Berlin, Đức

Từ địa y khô và sạch tiến hành ngâm dầm trong dung môi methanol ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Lấy dịch chiết cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp

Trong khi dịch methanol bay hơi một kết tủa tách ra và được lọc ra khỏi dịch

Dịch còn lại được tiếp tục làm khô thu được cao methanol thô Sử dụng phương pháp sắc ký cột trên cao methanol thô, giải ly bằng dung môi hexan 100% thu được Cao He

và một phần còn lại

Phần còn lại cũng sử dụng sắc ký cột với dung môi giải ly H:EA lần lượt từ 9:1 đến 0:10 thu được 4 phân đoạn từ cao EA1 đến EA4 và phần còn lại, phần này dùng sắc ký cột giải ly bằng dung môi methanol 100% thu được cao Me

Sơ đồ 1: Sơ đồ điều chế các cao của địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale

 Sắc ký cột phân đoạn EA3

Phân đoạn EA3 (30g) chọn khảo sát được sắc kí cột giải ly với hệ dung môi

ED:EA có độ phân cực tăng dần Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào bình tam

giác 500ml Sau đó dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào

các hủ bi Dùng sắc kí bảng mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống

nhau gôm lại thành một phân đoạn Kết quả được 4 phân đoạn ( EA3.1-EA3.4 )

Từ phân đoạn EA3.1 ( 21g ) sắc kí cột và giải ly bằng hỗn hợp dung môi ED:EA

( 8:2 ) thu được tủa C 0 A và phần dịch

Từ phân đoạn EA3.2 (3,55 g ) tiếp tục sắc kí và giải ly bằng hỗn hợp dung môi

có độ phân cực tăng dần Kết quả thu được 180 mg hỗn hợp chất, nếu kiểm tra bằng

sắc kí lớp mỏng với hỗn hợp dung môi C:Me:AcOH ( 9:1:0,12 ),xuất hiện hai vết xanh

tím và đỏ.Tiến hành sắc kí lớp mỏng điều chế với hỗn hợp dung môi C:Me:AcOH

( 9:1:0,12 ), tách được hai chất RS-A3 và RS-A4

Tất cả cấu trúc của hợp chất được xác định bằng phổ MS, NMR và so sánh với

các dữ liệu đã được công bố

Sơ đồ 2: Quy trình sắc kí cột trên cao etyl acetat EA3