Tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho việc tạo màng BC từ chủng vi khuẩn acetobacter xylimun BHN2

Nghiên cứu khả năng tạo màng của chủng A.xylinum BHN2 trên các môi trường khác nhau .... TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Acetobacter xylinum là loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp

VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM BHN2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Vi sinh vật

GVHD: TS Dương Minh Lam

PGS TS Đinh Thị Kim Nhung

Hà Nội, 2012

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Dương Minh Lam và

PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Khắc Thanh đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và tạo điều kiện cho để

em thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, khoa Sinh-KTNN, phòng thí nghiệm vi sinh vật, cùng các thầy cô trong tổ bộ môn vi sinh, ban bảo vệ đã tạo điều kiện giúp đỡ em

Em xin cảm ơn sự giúp đỡ quan tâm động viên của bạn bè, gia đình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Đỗ Thị Nga

LỜI CAM ĐOAN

Để đảm bảo tính trung thực của đề tài, tôi xin cam đoan:

1 Đề tài của tôi không sao chép bất cứ tài liệu sẵn có nào

2 Đề tài của tôi không trùng lặp với một đề tài nào khác

3 Kết quả thu được trong đề tài là do tự bản thân tôi nghiên cứu thực tiễn đảm bảo tính chính xác và trung thực

Hà Nội, tháng 05 năm 2012

Tác giả

Đỗ Thị Nga

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Danh mục các từ viết tắt

Danh mục hình và bảng biểu

MỞ ĐẦU 2

1 Lý do chọn đề tài 2

2 Nội dung của đề tài 3

3 Ý nghĩa của đề tài 3

4 Mục tiêu của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Vị trí và đặc điểm phân loại của A.xylinum trong sinh giới 4

1.1.1 Vị trí phân loại của A.xylinum 4

1.1.2 Đặc điểm phân loại của A.xylinum 5

1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A.xylinum 7

1.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 7

1.2.2 Nhu cầu nitơ của vi sinh vật 8

1.2.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng 8

1.2.4 Các chất kích thích sinh trưởng 9

1.3 Đặc điểm và cơ chế hình thành màng Bacterial cellulose 10

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc của Bacterial cellulose 10

1.3.2 Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulose 11

1.3.3 Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn A.xylinum 12

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay 12

1.4.1 Trên thế giới 12

1.4.2 Tại Việt Nam 13

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu và hóa chất 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Hóa chất 14

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 14

2.1.4 Môi trường nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phương pháp vi sinh 15

2.2.1.1 Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng 15

2.2.1.2 Phương pháp hoạt hoá giống 16

2.2.1.3 Phương pháp lên men tạo màng 16

2.2.2 Phương pháp hoá sinh 16

2.2.2.1 Phát hiện hoạt tính catalase 16

2.2.2.2 Phát hiện khả năng oxy hoá rượu êtylic thành acid acetic 17

2.2.2.3 Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic 17

2.2.2.4 Phát hiện khả năng chuyển hoá glucose thành acid 18

2.2.2.5 Phát hiện khả năng chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton 18

2.2.2.6 Sinh trưởng trên môi trường Hoyer 18

2.2.2.7 Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose 19

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu khả năng tạo màng BC của môi trường tuyển chọn 19

2.2.4 Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC 19

2.2.5 Phương pháp quy hoạch hóa toán học thực nghiệm (phương pháp Box – Wilson) 19

2.2.5.1 Thiết lập mô hình toán học 19

2.2.5.2 Tối ưu hóa 23

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Nghiên cứu khả năng tạo màng của chủng A.xylinum BHN2 trên các môi trường khác nhau 25

3.2 Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 26

3.3 Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 29

3.3.1 Thiết lập mô hình toán học tối ưu môi trường nuôi cấy 30

3.3.2 Tối ưu 39

3.4 Xây dựng quy trình đóng gói và bảo quản màng BC ở quy mô phòng thí nghiệm 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CÁC TƢ̀ VIẾT TẮT

A.xylinum : Acetobacter xylinum

MC : Microbial cellulose

BC : Bacterial cellulose

PC : Plant cellulose CFU : Colony Forming Unit

OD : Optical Density

cs : Cộng sƣ̣

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur

(1950)

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC Bảng 1.3 Thành phần hóa học của nước dừa

Bảng 1.4 Các vitamin có trong nước dừa

Bảng 1.5 Các acid amin có trong nước dừa

Bảng 2.1 Ma trận thực nghiệm

Bảng 3.1 Khảo sát khả năng tạo màng của A.xylinum BHN2

Bảng 3.2 Động thái sinh trưởng và tổng hợp cellulose của chủng A.xylinum

Bảng 3.8 Bảng kiểm tra sự thích ứng của mô hình

Bảng 3.9 Tối ưu hóa thành phần môi trường dinh dưỡng

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn A.xylinum BHN2

Hình 1.2 Khuẩn lạc của A.xylinum BHN2

Hình 1.3 Sợi cellulose của màng BC

Hình 1.4 Sợi cellulose của thực vật

Hình 1.5 Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum

Hình 2.1 A.xylinum BHN2 trên môi trường thạch nghiêng

Hình 2.2 Hoạt tính calatase của A.xylinum BHN2

Hình 3.6 Màng BC thu được sau lên men chưa xử lý

Hình 3.7 Màng BC sau khi xử lý đem sấy khô

TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Acetobacter xylinum là loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp màng

BC trên môi trường dịch thể trong điều kiện nuôi cấy tĩnh hiệu quả nhất trong

tự nhiên Màng BC có bản chất là sự kết hợp giữa cellulose và tế bào vi khuẩn

A.xylinum Màng BC có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học giống với

cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng polymer hóa rất lớn Ngoài ra, màng BC còn là một hàng rào c ản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của tia UV… Nhờ những thuộc tính đặc biệt trên mà màng BC được sử dụng ở rất nhiều các nước phát triển, ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực: công nghệ thực phẩm sản xuất thạch dừa, công nghiệp giấy sản xuất giấy chất lượng cao, lĩnh vực mỹ phẩm dùng làm mặt nạ dưỡng da Trong lĩnh vực y học, màng BC bước đầu được nghiên cứu làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay thế da tạm thời, mạch máu nhân tạo Một trong các ứng dụng đã và đang được quan tâm hiện nay là sản xuất màng BC điều trị bỏng và tổn thương da [6].Đặc biệt, hiện nay nhu cầu về màng trị bỏng rất cao nhưng đều phải nhập ngoại với giá thành rất lớn và chất lượng không như mong muốn

Công trình tập trung nghiên cứu môi trường tối ưu cho chủng

A.xylinum lên men tạo màng BC, xử lí và bảo quản màng BC

So với các nghiên cứu về A.xylinum trước đó thì công trình của tôi đã tìm ra được một số kết quả mới là: môi trường tối ưu cho chủng A.xylinum

cho màng dày, dai, nhẵn là glucose 19,347g; KH2PO4 1g; (NH4)2SO4 2,549g; tiến hành xử lý, bảo quản màng trên quy mô phòng thí nghiệm

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay công nghệ sinh học đang trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh với những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công nghiệp,

y học Khó có thể tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học mà lại không liên quan tới vi sinh vật

Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae Vi khuẩn A.xylinum

tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng Bacterial cellulose (màng BC) Đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer--1,4 glucopyranose không phân nhánh được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn khi nuôi cấy chúng trên môi trường dịch lỏng Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra

rằng A.xylinum là loài vi khuẩn tổng hợp màng BC có hiệu quả cao nhất

Màng BC do A.xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học

giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn Vì vậy BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ

Với mong muốn tìm ra môi trường dinh dưỡng tối ưu cho chủng vi

khuẩn A.xylinum và những ứng dụng hữu ích của màng BC trên cơ sở kế thừa

những kết quả thu được của các tác giả đã nghiên cứu trước tôi quyết định

chọn đề tài: “Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng cho việc tạo màng BC từ

chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2”

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu chọn lựa môi trường tối ưu cho việc tạo màng BC của

chủng A.xylinum BHN2

3 Nội dung của đề tài

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất dinh dưỡng (hàm lượng đường, hàm lượng (NH4)2SO4, hàm lượng KH2PO4) đến khả năng

tạo màng BC của chủng A.xylinum BHN2 Từ đó tối ưu môi trường tạo màng

BC của chủng đã chọn

3.2 Nghiên cứu một số phương pháp xử lý và bảo quản màng BC

4 Ý nghĩa thực tiễn

Công trình cho phép lựa chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp cho

chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tạo màng BC có chất lượng tốt nhất

Tìm mô hình xử lý và bảo quản màng thu được sau lên men trên quy

mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vị trí và đặc điểm phân loại của A.xylinum trong sinh giới

1.1.1 Vị trí phân loại của A.xylinum

Tên gọi: Acetobacter xylinum là một tên gọi chính thức theo hệ thống

danh pháp quốc tế 1990

Vi khuẩn acetic nói chung, A.xylinum nói riêng đã và đang thu hút được

sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới từ xưa tới nay Ngay từ thế kỷ XIX các nhà khoa học đã tiến hành phân lập và phân loại chúng Tuy nhiên cho đến nay việc phân loại vi khuẩn này vẫn còn nhiều tranh cãi

Năm 1950, Frateur đã xếp A.xylinum vào nhóm Meroxydans

Năm 1957, theo “Bergey‟s manual of determinative bacteriology” ông

đã xếp A.xylinum vào chi Acetobacter, thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ

Pseudomonadales, lớp Schizomycetes

Đến năm 1974, theo “Bergey‟s manual of determinative bacteriology”

A.xylinum lại được coi như là một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi

Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc

Cùng với thời gian loài vi khuẩn này lại được sắp xếp vào những vị trí

khác nhau Theo “Applied and Envitromene microbiology” và “Bergey‟s

manual of systematic bacteriology” thì họ Acetobacteraceae gồm hai chi vi

khuẩn acetic quan trọng là Acetobacter và Gluconobacter Vi khuẩn

A.xylinum được xếp vào chi Acetobacter

Tới nay, đã tồn tại nhiều quan điểm khác nhau trong việc phân loại vi

khuẩn acetic nói chung và A.xylinum nói riêng Vấn đề này vẫn đang gây

nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những nghiên cứu tiếp theo

1.1.2 Đặc điểm phân loại của A.xylinum

* Đặc điểm hình thái - tế bào học

(actaorl.com.br)

Hình 1.1 Vi khuẩn A.xylinum BHN2

A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng

2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá

giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn Vi khuẩn A.xylinum

thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hoá dị dưỡng Tế bào của

chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất

* Đặc điểm nuôi cấy

Hình 1.2 Khuẩn lạc của A.xylinum BHN2

Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc

nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc

trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường Vi

khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng

sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [14]

* Đặc điểm sinh lý – sinh hoá

Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350

C, pH = 4 – 6 [4] Vì

A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ sung thêm

acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [11]

Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A.xylinum bao gồm: oxy

hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; phản ứng catalase dương tính; không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; chuyển hoá glucose thành acid; chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; không sinh sắc tố nâu; tổng hợp cellulose [11]

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur

(1950)

1 Oxy hoá ethanol

thành acid acetic

Chuyển hoá môi trường chứa Bromphenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng +

2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí +

3 Sinh trưởng trên môi

trường Hoyer Sinh khối không phát triển _

4

Chuyển hoá

glycerol thành

dihydroxyaceton

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên men +

5 Chuyển hoá glucose

thành acid

Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc

trên môi trường chứa CaCO 3

+

6 Kiểm tra khả năng

sinh sắc tố nâu Không hình thành sắc tố nâu _

7 Kiểm tra khả năng

tổng hợp cellulose Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam +

1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A.xylinum

1.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô

cơ hay hữu cơ Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật

Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzim, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Chính vì vậy, những hợp chất hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh vật Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC:

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC

Nguồn cacbon

Monosaccharide

Năng suất tổng hợp cellulose

Nguồn cacbon Disaccharide

Năng suất tổng hợp cellulose

16

7

33 7-11

1.2.2 Nhu cầu nitơ của vi sinh vật

Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho cơ thể sinh vật nguyên liệu để hình thành các nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất [4] Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+

Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ

Do đó khi nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum người ta thường sử dụng nguồn nitơ

vô cơ là (NH4)2SO4 , NH4NO3; nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao

nấm men [4] Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về BC là môi trường do Hestrin và Scharamm thiết lập [29]

1.2.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng

Phospho bao giờ cũng chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật Phospho có mặt ở trong hầu hết các thành phần của tế bào Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta sử dụng các loại phospho vô cơ như KH2PO4, K2HPO4,…[4] Việc bổ sung phosphat (nhất là phosphat kali) vào các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường [4] Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai

trò ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn A.xylinum và quá trình hình thành

màng BC như Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các

nguyên tố vi lượng thì vi khuẩn A.xylinum không thể sinh trưởng và phát triển

bình thường được

Đối với A.xylinum nguyên liệu chủ yếu hiện nay được sử dụng là nước

dừa già, dịch hoa quả, rỉ đường… thì khi nuôi cấy không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng nữa [4]

1.2.4 Các chất kích thích sinh trưởng

Các vitamin pyridoxine, acid nicotinic, p–aminobenzoic acid (pABA), biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp

cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại [23]

Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy

A.xylinum thu màng BC Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành

phần hoá học trong nước dừa có khác nhau Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau

đó giảm dần) Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol Ngoài ra, nước dừa có nhiều khoáng chất, vitamin, acid amin… phù hợp cho

quá trình sinh trưởng và hình thành màng BC của vi khuẩn A.xylinum [14]

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của nước dừa

Bảng 1.5 Các acid amin có trong nước dừa

Acid glutamic 14.5 Tyrosine 2.83 Arginine 12.75 Alamine 2.41 Leucine 4.18 Histidine 2.05 Lysine 4.51 Phenyl alanin 1.23 Proline 4.12 Senine 0.91 Aspartic 3.6 Cystein 1.17

1.3 Đặc điểm và cơ chế hình thành màng Bacterial cellulose

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc của Bacterial cellulose

Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mạch thẳng Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau

Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau

tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo

sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải lớn Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc vandesvan tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng

Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc

tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A.xylinum: Glucokinase (GK),

Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS) Trong đó UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [13]

Hình 1.5 Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum

1.3.3 Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn A.xylinum

Màng BC nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác dụng như

một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn A.xylinum trước các nhân tố có hại

của môi trường Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn

bảo vệ chúng khỏi tia cực tím Khoảng 23% số tế bào A.xylinum được bao bọc

bởi BC sống sót sau 1 giờ xử lí bằng tia cực tím Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3% [29]

Ngoài ra, màng BC còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi khuẩn đồng thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dưỡng từ môi trường một cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose [21]

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay

1.4.1 Trên thế giới

Vi khuẩn A.xylinum BHN2và màng BC đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghệ môi trường, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm…[31] Các nghiên cứu hiện nay về màng BC trên thế giới đã tập trung vào vấn đề sản xuất trên quy mô công nghiệp và ứng dụng các sản phẩm từ màng BC vào các lĩnh vực khác nhau

Mở đầu là S Hestrin; M Scharmn và cs [21], [26], [25], sau là một loạt các nghiên cứu tương tự về khả năng tổng hợp cellulose của các chủng

A.xylinum; ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến

quá trình sinh tổng hợp cellulose [18], [20], [22] Nghiên cứu của R.M Brown và cs, K.Zaar cơ chế tổng hợp màng BC, con đường chuyển hóa

cacbon trong vi khuẩn A.xylinum [17]

Từ nửa sau thế kỷ XIX đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của màng BC trong các lĩnh vực khác nhau Đặc biệt là màng trị

bỏng, sử dụng màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng và đã thu được kết quả tốt như Wan và Millon đã được đăng ký bản quyền về làm màng BC từ

A.xylinum dùng trị bỏng [27]

1.4.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu và ứng dụng về A.xylinum và

màng BC Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc của màng Về ứng dụng thực tiễn, mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng và được ứng dụng

trong sản xuất thạch dừa [7], [11], [15], [16]

Theo tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ Vi sinh – Ký sinh, Đại học

Y Dược, Thành phố Hồ Chí Minh cho biết nhóm nghiên cứu của ông chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên men Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên

nó có vai trò như màng sinh học có thể thay thế da tạm thời [29]

Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan,

nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose của A.xylinum và hoạt

chất tái sinh mô của dầu mù u Ngoài ra, có nghiên cứu về hiệu ứng làm lành vết thương của hỗn hợp Chistosan tan trong nước – Bacterial cellulose – Nano bạc của nhóm tác giả Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị

Mỹ Phước và Nguyễn Quốc Hiển [10]

Tại phòng Vi sinh vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs đang tiến hành nghiên cứu quy trình sản xuất màng BC với chất lượng tốt và ứng dụng vào trị bỏng bước đầu đã đạt được thành công [14]

Hiện nay mới chỉ có một số công trình nghiên cứu ảnh hưởng của môi

trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC của chủng Acetobacter

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu và hóa chất

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 được phân lập từ màng của các

nguồn nguyên liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên men theo phương pháp cổ truyền, chủng giống nhận từ phòng Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2

2.1.2 Hóa chất

Nguồn đường: glucose, saccarose, ethanol, fructose, sorbitol

Nguồn nitơ: Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4

Nguồn nitơ hữu cơ: pepton, cao thịt

Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH

Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch lugol Nước dừa, agar…

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm tôi đã sử dụng những dụng cụ thiết bị như: nồi hấp khử trùng, tủ sấy (Haraeus, Đức), box cấy vô trùng (Haraeus, Đức), cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ), micropipep (Gilson, Pháp), tủ lạnh (Tawasi, Nhật), kính hiển vi quang học (olympus CX41, Nhật), hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, bình tam giác, lam kính, la men, đèn cồn… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

2.1.4 Môi trường nghiên cứu

Chú ý: Axit axetic và rượu etylic được bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường

Trong đó: MT1 là môi trường phân lập

MT2 là môi trường nhân giống cơ bản

MT3…MT6 là môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng

(cung cấp bởi phòng thí nghiệm Vi sinh , Khoa Sinh – KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi phân lập, được sơ bộ xác định là A.xylinum

được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4 - 5 ngày trong tủ ấm ở 300C Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 40C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo Cấy truyền và giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần [3], [6]

Hình 2.1 A.xylinum BHN2 trên môi trường thạch nghiêng

2.2.1.2 Phương pháp hoạt hoá giống

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210

trong 20 phút Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào

và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [4], [5]

2.2.1.3 Phương pháp lên men tạo màng

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100

C trong 20 phút để tránh phân rã đường Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong

15 phút Bổ sung vào môi trường 5% giống hoạt hoá Nuôi cấy ở điều kiện

tĩnh trong 4 - 8 ngày

2.2.2 Phương pháp hoá sinh

2.2.2.1 Phát hiện hoạt tính catalase

Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +) Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -) Ngoài

ra có thể nhỏ trực tiếp H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu đã được tách từ dịch nuôi cấy bằng cách đem li tâm 5000 vòng/10phút, quan sát hiện tượng như trên [3]

Hình 2.2 Hoạt tính calatase của A.xylinum BHN2

2.2.2.2 Phát hiện khả năng oxy hoá rượu êtylic thành acid acetic

Nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường bao gồm:

Cao nấm men: 10 g Rượu êtylic: 10% - 15% (vol/vol)

Nước máy : 1000 ml pH : 6,8-7,0

Blue Bromophenol (BPB) 0,04%: 20 ml

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 - 5ml), khử trùng ở 1210

C trong 20 phút, để nguội khoảng 30oC cấy vi khuẩn nghiên cứu mới hoạt hoá, nuôi 7 ngày trong điều kiện thích hợp Quan sát thấy môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính, không đổi màu là âm tính

Pha dung dịch BPB 0,04%: cân 0,1g BPB nghiền nhỏ trong cốc sứ, sau

đó bổ sung 14,9 ml NaOH 0,001N hoà tan cho đều Đổ tất cả vào bình định mức thêm nước cho đến khi thể tích đạt 250 ml [4]

2.2.2.3 Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic

Sử dụng môi trường sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn

Thành phần: Cao nấm men: 10 g Canxi acetat: 10 g

Thạch agar : 20 g Nước máy: 1000 ml

pH : 7,0-7,2 Phân môi trường vào bình tam giác đem khử trùng ở 121o

C trong 20 phút, để nguội khoảng 40 - 45oC đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới hoạt hoá (18 - 24 giờ) nuôi 6 - 7 ngày ở điều kiện thích hợp Quan sát hiện

tượng: nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính

2.2.2.4 Phát hiện khả năng chuyển hoá glucose thành acid

Để xác định khả năng hình thành acid của chủng vi khuẩn tuyển chọn tôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch GCP Nếu xung quanh chuẩn lạc tạo

vòng phân giải canxi, chứng tỏ chủng tuyển chọn có khả năng hình thành acid

từ glucose [14]

2.2.2.5 Phát hiện khả năng chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton

Để thử khả năng hình thành dihydroxyaceton từ glycerol Tôi tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường bao gồm thành phần sau:

Glycerol: 4% CaCO3: 0,3% (NH4)2SO4 : 0,1%

Thạch : 2 g pH: 5,3 H2O : 1000 ml

Hấp thanh trùng 120oC trong 10 phút Để môi trường nguội cấy giống

vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/phút ở nhiệt độ 30o

C trong vòng 48h Nhỏ dung dịch Fehling vào 1ml dịch nuôi cấy trong ống eppendorf để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyaceton (có sự xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ gạch)

Cách pha dung dịch Fehling [3], [6]

Fehling 1: CuSO4.5H2O: 34,6 g Nước cất : 500 ml

Fehling 2: Na.K.Tartrat: 173 g NaOH: 70g Nước cất: 500 ml

Trộn Fehling 1 và Fehling 2 theo tỷ lệ 1:1 ta được dung dịch Fehling màu xanh thẫm

2.2.2.6 Sinh trưởng trên môi trường Hoyer

Thành phần môi trường: (g/l)

(NH4)2SO4: 1 g KH2PO4: 0,9 g FeCl3.6H2O: 0,02 g

MgSO4.7H2O: 0,25 g K2HPO4: 0,1 g Rượu êtylic 99,5%: 20 ml

Hấp thanh trùng 121oC trong 15 phút Để môi trường nguội bổ sung giống nghiên cứu nuôi ở nhiệt độ khoảng 30oC trong 0, 12, 24, 48 giờ sau đó

hút 1mml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf ly tâm ở 5000 vòng trong 10 phút

và xác định giá trị OD ở λ = 610 nm [10]

2.2.2.7 Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose

Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28-30o

C trong vòng 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá thành màu xanh lam

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu khả năng tạo màng BC của môi trường tuyển chọn

Sau khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC và chọn ra được các nguồn dinh dưỡng và hàm lượng thích hợp của chúng cho quá trình tạo màng BC Tôi tiến hành xây dựng công thức môi trường tuyển chọn cho quá trình tạo màng BC của vi khuẩn

A.xylinum BHN2 Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường tuyển chọn tiến hành

thu màng và đánh giá chất lượng màng thu được, so sánh với kết quả màng thu được ở môi trường cơ bản (MT3)

2.2.4 Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC

Sau khi nuôi cấy, màng được lấy ra, để màng ráo nước khoảng 4 - 5 giờ, trên khay nhựa của nhiệt độ phòng thí nghiệm Tiến hành cân màng trên cân điện tử Trọng lượng tươi của màng được tính bằng hiệu số của trọng lượng khay nhựa lúc có và chưa có màng

2.2.5 Phương pháp quy hoạch hóa toán học thực nghiệm (phương pháp Box – Wilson)

2.2.5.1 Thiết lập mô hình toán học

Thiết lập mô hình toán học cho phép ta thấy được mối liên hệ giữa hàm

mục tiêu với các biến dưới dạng mặt đồng mức

Mặt đồng mức được biểu diễn theo phương trình hồi quy: