Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ SV tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn acetobacter xylinum BHN2

Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A... Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy với tỷ lệ S/V=0,8 đến khả năn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài này là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận tốt nghiệp là trung thực nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà nội, tháng 05 năm 2011

Tác giả

Nguyễn Duy Khanh

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phương Phú Công đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này

Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô và các bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu

Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, nhưng người thân, bạn bè

đã quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn !

Hà nội, tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Nuyễn Duy Khanh

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU……… 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

PHẦN NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về vi khuẩn A xylinum và màng BC 3

1.1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái của A xylinum 3

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A xylinum 3

1.1.3 Màng BC của vi khuẩn A xylinum 4

1.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn A xylinum 5

1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose 5

1.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4 ) 2 SO 4 5

1.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 7H 2 O 5

1.2.4 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 6

1.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi

khuẩn A xylinum 6

1.3.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống 6

1.3.2 Độ thông khí 7

1.3.3 Nhiệt độ……… … 7

1.3.4 Độ pH 7

1.4 Ứng dụng của màng BC 8

1.4.1 Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực 8

1.4.2 Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng 8

1.5 Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới 9

1.5.1 Trên thế giới……… 9

1.5.2 Ở Việt Nam 9

1.6 Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài 10

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Vật liệu 12

2.1.1 Vật liệu chính 12

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 12

2.1.2.1 Hoá chất……….12

2.1.2.2 Thiết bị 12

2.1.3 Môi trường 13

2.1.3.1 Môi trường phân lập giống (MT1) 13

2.1.3.2 Môi trường nhân giống cơ bản (MT2) 13

2.1.3.3 Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Phương pháp hoạt hóa giống A xylinum BHN2 14

2.2.2.Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn A xylinum BHN2 14

2.2.3 Phương pháp bảo quản chủng giống A xylinum BHN2trên môi trường thạch nghiêng 14

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ chủng A xylinum BHN2 15

2.2.4.1 Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng A xylinum BHN2 15

2.2.4.2 Phương pháp xác định dai (độ bền cơ học) của màng BC 16

2.2.4.3 Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A xylinum BHN2……… 17

2.2.4.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A xylinum BHN2 17

2.2.5 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả……… 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn A

xylinum BHN2 19

3.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC của chủng A xylinum BHN2với tỷ lệ S/V=0,8 24

3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC của chủng A xylinum BHN2với tỷ lệ S/V=0,8 29

PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

1 Kết luận 33

2 Đề nghị………33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH ẢNH

Hình 3.1: Thể hiện mối quan hệ giữa S/V với khối lượng màng………21

Hình 3.2: Thể hiện mối quan hệ giữa S/V với độ bền kéo màng………21

Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC……… 23

Hình 3.4: Thể hiện mối quan hệ giữa thời gian với khối lượng màng…… 26

Hình 3.5: Thể hiện mối quan hệ giữa thời gian với độ bền kéo màng………26

Hình 3.6: Hình ảnh khối lượng màng sau 5 ngày nuôi cấy……….…28

Hình 3.7: Thể hiện mối quan hệ giữa nhiệt độ với khối lượng màng……….31

Hình 3.8: Thể hiện mối quan hệ giữa nhiệt độ với độ bền kéo màng…… 31

Bảng 2.1: Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu ……….16

Bảng 3.1: Nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ vi

khuẩn A xylinum BHN2 ……….…… 20

Bảng 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng

BC từ chủng A xylinum BHN2với tỷ lệ S/V=0,8……….…… 25 Bảng 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy với tỷ lệ S/V=0,8 đến

khả năng tạo màng BC từ chủng A xylinum BHN2……….………30

)

 V : Thể tích dịch lên men tạo màng ( cm3

)

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Màng sinh học ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến…do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bề chắc [14]

Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều

trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người [10]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học

Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A xylinum BHN2 có khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ

chủng A xylinum BHN2 có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở

để tạo ra màng trị bỏng cho người

Với mục đích tìm hiểu diện tích và thể tích liên quan đến độ thoáng khí trong

quá trình tạo màng BC trong điều kiện nuôi tĩnh tôi chọn đề tài:

“ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi

khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 ”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn

A xylinum BHN2 phân lập từ nguồn nguyên liệu từ phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất

đến khả năng tạo màng BC của chủng A xylinum BHN2

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất

đến khả năng tạo màng BC của chủng A xylinum BHN2

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn

A xylinum BHN2

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất

đến khả năng tạo màng BC của chủng A xylinum BHN2

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất

đến khả năng tạo màng BC của chủng A xylinum BHN2

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Bổ sung thêm các kiến thức về vi khuẩn A xylinum nhằm tạo màng BC

được tốt nhất có triển vọng ứng dụng vào một số lĩnh vực trong cuộc sống,

đặc biệt là lĩnh vực y học

PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về vi khuẩn A xylinum và màng BC

1.1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái của A xylinum

Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.xylinum thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp

Schizommycetes Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số

tác giả coi A xylinum như một loài phụ của A Aceti [12]

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay

không di động, không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi

Khuẩn lạc của A xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt

2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn

và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn [18]

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A xylinum

Vi khuẩn A xylinum phát triển ở nhiệt độ 25-350C, pH = 4-6 Nhiệt độ

và pH tối ưu tùy thuộc vào giống Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay

cả trong môi trường tối ưu

A xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm

acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [8]

Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A xylinum bao gồm: Oxy

Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid; Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp cellulose [8]

1.1.3 Màng BC của vi khuẩn A xylinum

Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A xylinum

hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những

bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose hay màng BC

* Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:

Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch thẳng Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau

Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo

thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi

lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó

và cuối cùng tạo dải ribbon Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy [13]

Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học cao, khả năng hấp thụ nước lớn

Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn A xylinum được nghiên cứu đầu

tiên bởi Brown Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, những

nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và đặc tính của cellulose [13]

1.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC

từ vi khuẩn A xylinum

1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose

Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng

hợp cellulose của A xylinum Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng A xylinum HN5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của A xylinum là glucose Để tạo màng phục vụ

mục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã quyết định sử dụng hàm

lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu trên chủng A xylinum BHN2[10]

[11]

1.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4 ) 2 SO 4

Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào Nhân tố (NH4)2SO4 là một trong những nhân tố có ảnh

hưởng lớn đến sự phát triển của A xylinum, là nhân tố quan trọng cung cấp

nguồn nitơ cho tế bào phát triển Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất [5] [7]

1.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 7H 2 O

MgSO4 ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS-TS Đinh Thị Kim Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những

enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình thành màng BC [9]

1.2.4 Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2 PO 4

Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn có

vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A xylinum Sử

dụng nồng độ 2g/l KH2PO4 sẽ cho sản lượng BC cao nhất [6]

1.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi

khuẩn A.xylinum

1.3.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống

Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn

Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng

Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính chất cơ học của màng BC Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh dưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào

Đối với loài A xylinum, trong quá trình lên men, phần lơn các tế bào

liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt nuôi cấy Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dich thể Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho phù hợp có ý nghĩa quan trọng để thu được màng BC với năng suất cao nhất Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ giống và thời

gian lên men [5]

1.3.2 Độ thông khí

Vi khuẩn A xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Điều kiện tiên

quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí Trong cơ chế của quá trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn Trong thực tế độ thông khí quyết định năng suất BC Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và

sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao trong lên men chìm Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng, thoáng và lớp môi trường mỏng [11]

Wan phát hiện ra áp suất oxy cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuẩn Cellulose hình thành dưới áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất oxy cao Do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp màng BC [19]

1.3.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn A xylinum từ 25-350C Ở nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [15]

1.3.4 Độ pH

Vi khuẩn A xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp

Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá môi trường Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn

sự phát triển của vi sinh vật có hại [16]

1.4 Ứng dụng của màng BC

1.4.1 Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực

Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề dày của vi sợi dưới 100nm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh học, tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng Màng BC có các ứng dụng đa dạng trong nhiều lãnh vực như y học, thực phẩm, mỹ phẩm, bảo

vệ môi trường, công nghiệp [5] [7] [10]

1.4.2 Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng

Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại

di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh

Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận khoảng hơn 400 ca bỏng Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng

Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng làm giảm đau ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho quá trình tái tạo phục hồi Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm khuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức hoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biểu mô hóa hình

thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật [7] [11]

1.5 Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới

1.5.1 Trên thế giới

Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A.xylinum và những ứng dụng của

nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Tác giả Brown, dùng màng

BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào Brown, Jonas và Farad, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm Đặc biệt Brown đã dùng BC làm vải đặc biệt, Jonas và Farad dùng màng BC

để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protêin hay cho sắc kí [13] [17]

Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm Các tác giả Wan và Millon sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt Đặc biệt tác giả Wan đã đượng đăng kí bản quyền về làm màng BC từ

A.xylinum dùng trị bỏng Các tác giả Jonas và Farad, đã dùng màng BC làm

da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [17] [19]

1.5.2 Ở Việt Nam

Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải tiến Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng … Từ năm 2000 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã có

một số công trình nghiên cứu về màng BC từ A xylinum và bước đầu nghiên

cứu về các đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [7]

Điều trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên đã được áp dụng

từ rất lâu và phổ biến ở tất cả các nước Các thuốc này có sẵn trong thiên nhiên và có nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vết thương, vết loét…

Màng BC có nhiều ưu điểm để trở thành chất mang các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên sử dụng trong điều trị bỏng [7] [11]

1.6 Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài

Luận văn thạc sĩ vi sinh học 2009 : “Nghiên cứu một số đặc tính vật lý của

màng BC từ Acetobacter xylinum, ứng dụng trong trị bỏng” của Trần như

Quỳnh- ĐHSP Hà Nội đã làm được một số vấn đề sau:

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn A xylinum

BHN2

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men tạo màng

BC của chủng A xylinum BHN2, qua đó lựa chọn được môi trường thích hợp

cho chủng A xylinum BHN2 lên men tĩnh

+ Điều kiện nuôi cấy: hàm lượng giống bổ sung ban đầu cho lên men tạo màng là 10% thể tích lên men, với PH ban đầu của môi trường lên men từ 4,5-5,5

+ Môi trường dinh dưỡng: hàm lượng đường glucose 20g/l; (NH4)2SO4: 2 g/l; KH2PO4: 2 g/l; MgSO4.7H2O: 2 g/l

- Nghiên cứu được tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên men cho chủng

A xylinum BHN2 tạo màng tốt nhất là S/V = 0,8

- Xử lý màng BC ứng dụng trong điều trị bỏng và khảo sát các đặc tính của

màng: khả năng kháng khuẩn cao, độ bền cơ học 3,62 kN/m, độ thấu khí 120ml/phút, khả năng hút nước 6,82g/100cm2/24 giờ; màng không có triệu chứng kích ứng

- Màng BC tẩm dầu mù u và kem nghệ làm lành vết thương sau 19 ngày điều trị

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu chính

Đối tượng nghiên cứu là các chủng A xylinum BHN2 từ phòng thí

nghiệm Vi Sinh - Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư pham Hà Nội 2 cung cấp

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

2.1.2.1 Hoá chất

- Nguồn Cacbon: Ethanol, Glucose, Acid acetic, Agar

- Nguồn Nitơ: Pepton, (NH4)2SO4

- Các muối khoáng: KH4PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O

- Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol

- Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol

- Ngoài ra còn sử dụng : nước dừa

2.1.2.2 Thiết bị

- Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

- Nồi hấp Tommy (Nhật)

- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

- Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

- Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20l – 10ml

- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40

- Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ)

- Khay nhựa có kích thước 15 x 10 x 4 cm

- Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn…

Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Ethanol: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Ethanol: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Ethanol: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Nước dừa: 1000ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp hoạt hóa giống A.xylinum BHN2

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sử dụng phải hoạt hóa giống “làm thức tỉnh giống”, nhân giống đảm bảo đủ số lượng

tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút Sau đó đem xử lí trong đèn tím 15 phút để khử khuẩn, sau đó cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong

24 giờ

2.2.2.Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum BHN2

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C trong 20 phút để tránh phân dã đường Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong

15 phút Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách bổ sung vào môi trường lên men 5% giống đã hoạt hóa Nuôi cấy ở điêu kiện tĩnh trong 7-10

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ

chủng A xylinum BHN2

2.2.4.1 Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC

tốt nhất từ chủng A xylinum BHN2

S: diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm2)

V: thể tích dịch lên men tạo màng ( cm3)

Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể tích

dịch lên men để tìm tỷ lệ S/V thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ

chủng A.xylinum BHN2 , chúng tôi tiến hành theo các bước sau:

- Bước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC Quy đổi thể tích từ đơn

vị ml sang đơn vị cm3 Sau đó tính tỷ lệ S/V

+ Dụng cụ lên men tạo màng là khay nhựa hình chữ nhật có kích thước 15 x

10 x 4 cm, từ đó ta tính được diện tích bề mặt lên men tạo màng BC là S= 15 x 10= 150 (cm2)

+ Thể tích dịch lên men được đo bằng ml nhưng để tính được tỷ lệ S/V thì ta

phải quy đổi ml sang cm3 Ta đã biết 1ml=1cm3 Ta có bảng sau:

Bảng 2.1: Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu

- Bước 2: Tiến hành lên men bề mặt tạo màng BC từ chủng A.xylinum BHN2

với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, khối lượng tươi, khối lượng khô để tìm S/V thích hợp tạo màng BC tốt nhất

2.2.4.2 Phương pháp xác định dai (độ bền cơ học) của màng BC

Độ chịu kéo (độ dai): Lực kéo lớn nhất mà mẫu thử chịu được trước khi đứt trong điều kiện xác định của phương pháp thử tiêu chuẩn

Độ bền kéo (độ dai) có thể được hiểu như là khi một lực tác động tăng dần đến khi vật liệu dạng sợi hay trụ bị đứt Ở giá trị lực kéo giới hạn cho sự đứt của vật liệu được ghi lại được ký hiệu σk Độ bền kéo được ứng dụng rất nhiều cho các vật liệu trong các lĩnh vực như thiết kế chế tạo máy, xây dựng, khoa học vật liệu