Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 potx

BÁO CÁO TỐT NGHIỆPĐề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2... LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Màng sinh học Bacterial cellulose; Bi

BÁO CÁO TỐT NGHIỆP

Đề tài

Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn

Acetobacter xylinum BHN2

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU 1

PHẦN NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về vi khuẩn A Xylinum và màng BC 3

1.1.3 Màng BC của vi khuẩn A xylinum 4

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Vật liệu 12

2.1.1 Vật liệu chính 12

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 12

2.1.2.1 Hoá chất 12

2.1.2.2 Thiết bị 12

2.1.3 Môi trường 13

2.1.3.1 Môi trường phân lập giống (MT1) 13

2.1.3.2 Môi trường nhân giống cơ bản (MT2) 13

2.1.3.3 Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.2.Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum BHN2 .14

2.2.3 Phương pháp bảo quản chủng giống A.xylinum BHN2 trên môi trường thạch nghiêng 14

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ chủng A xylinum BHN2 14

2.2.4.1 Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng

BC tốt nhất từ chủng A xylinum BHN2 15

KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Màng sinh học ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và đặctính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết vớinhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thựcvật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose,peptin và sáp nến…do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai,

bề chắc.[17]

Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các

lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình

xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làmchất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơchất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm Đặc biệt trong lĩnhvực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quátrình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh timmạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người.[13]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêmtốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu Các kếtquả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm.Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường Đại

học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A xylinum BHN2 cókhả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ

chủng A xylinum BHN2 có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở

để tạo ra màng trị bỏng cho người

Với mục đích tìm hiểu diện tích và thể tích liên quan đến độ thoáng khí trongquá trình tạo màng BC trong điều kiện nuôi tĩnh chúng tôi chọn đề tài:

“ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 ”

2 Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn

A xylinum BHN2 phân lập từ nguồn nguyên liệu từ phòng thí nghiệm

- Khảo sát khả năng tạo màng BC của vi khuẩn A xylinum BHN 2

- Bổ sung thêm các kiến thức về vi khuẩn A.xylinum nhằm ứng dụng tạo

màng BC được tốt nhất

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn

A xylinum BHN 2 .

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất

đến khả năng tạo màng BC của chủng A xylinum BHN2

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất

đến khả năng tạo màng BC của chủng A xylinum BHN2

- Nghiên cứu một số tính chất vật lý của màng BC được tạo ra từ chủng

A xylinum BHN2 từ đó định hướng cho ứng dụng trong trị bỏng

PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về vi khuẩn A Xylinum và màng BC

1.1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái của A Xylinum

Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.xylinum thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp

Schizommycetes Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số

tác giả coi A xylinum như một loài phụ của A Aceti.[21]

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay

không di động, không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặcđiểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môitrường Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi

Hình 1: Kết quả nhuộm Gram của A xylinum BHN2

Khuẩn lạc của A.xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt

2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn

và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.[18]

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A Xylinum

Vi khuẩn A xylinum phát triển ở nhiệt độ 25-350C, pH = 4-6 Nhiệt độ

và pH tối ưu tùy thuộc vào giống Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay

cả trong môi trường tối ưu

A xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm

acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.[12]

Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A xylinum bao gồm: Oxy

hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính;Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid;Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổnghợp cellulose.[12]

1.1.3 Màng BC của vi khuẩn A xylinum

Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A xylinum

hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những

bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose hay màng BC

* Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:

Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch thẳng Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau

Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo

thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi

lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), những sợi này kết

hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al

2000) Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.[15]

Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học cao, khả năng hấp thụ nước lớn

Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn A xylinum được nghiên cứu đầu

tiên bởi Brown năm 1886 Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và đặc tính của cellulose.[22]

1.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC

từ vi khuẩn A.xylinum

1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose

Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng

hợp cellulose của Acetobacter xylinum Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng Acetobacter xylinum HN5 thì nguồn cacbon

có ảnh hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của Acetobacter xylinum là

glucose Để tạo màng phục vụ mục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần NhưQuỳnh đã quyết định sử dụng hàm lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu

trên chủng A xylinum BHN2.[14]

1.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4 ) 2 SO 4

Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình sống đểxây dựng tế bào Nhân tố (NH4)2SO4 là một trong những nhân tố có ảnh

hưởng lớn đến sự phát triển của Acetobacter xylinum, là nhân tố quan trọng

cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môitrường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởngđến quá trình tạo màng BC Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng

BC cao nhất.[14]

1.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 7H 2 O

MgSO4 ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS-TS Đinh ThịKim Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, nhữngenzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hìnhthành màng BC.[14]

1.2.4 Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2 PO 4

Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn có

vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Acetobacter

xylinum ( Ross et.al, 1991) Sử dụng nồng độ 2g/l KH2PO4 sẽ cho sản lượng

BC cao nhất.[14]

1.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum

1.3.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống.

Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởngtrong quá trình lên men cellulose vi khuẩn

Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độkết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng.

Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tínhchất cơ học của màng BC Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinhdưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượngcung cấp cho hoạt động sống của tế bào

Đối với loài Actobacte xylinum, trong quá trình lên men, phần lơn các

tế bào liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặtnuôi cấy Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dichthể Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu chophù hợp có ý nghĩa quan trọng để thu được màng BC với năng suất cao nhất.Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệgiống và thời gian lên men.[14]

1.3.2 Độ thông khí

Vi khuẩn A xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Điều kiện tiên

quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí Trong cơ chế của quátrình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn Trong thực tế độthông khí quyết định năng suất BC Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và

sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC caotrong lên men chìm Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng,thoáng và lớp môi trường mỏng.[19]

Wanatabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy cũng ảnhhưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuẩn Cellulose hình thành dưới

áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất

oxy cao Do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớpmàng BC.[20]

1.3.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn A xylinum từ 25-300C Ở nhiệt độ thấpquá trình lên men xảy ra chậm Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đếnmức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm.[21]

1.3.4 Độ PH

Vi khuẩn A xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp.

Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoámôi trường Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn

sự phát triển của vi sinh vật có hại.[21]

1.4 Ứng dụng của màng BC

1.4.1 Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực

Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độbền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khảnăng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bềdày của vi sợi dưới 100nm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinhhọc, tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng Màng BC có cácứng dụng đa dạng trong nhiều lãnh vực như y học, thực phẩm, mỹ phẩm, bảo

vệ môi trường, công nghiệp.[22]

1.4.2 Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng

Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày

Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại

di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh

Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhậnkhoảng hơn 400 ca bỏng Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi.Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng.[6]

Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặcbiệt quan trọng Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụnglàm giảm đau ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt choquá trình tái tạo phục hồi Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tạichỗ có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễmkhuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước vàdịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chứchoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biểu mô hóa hìnhthành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật.[6]

1.5 Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới

1.5.1 Trên thế giới

Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A.xylinum và những ứng dụng của

nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Tác giả Brown, 1989, dùngmàng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chấtmang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào Brown (1989), Jonas vàFarad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra cácsợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặcthay thế thực phẩm Đặc biệt Brown (1989) đã dùng BC làm vải đặc biệt,Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự (2006)

dùng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố địnhprotêin hay cho sắc kí.[5]

Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC làdùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm Các tác giả: Hamlyn và cs (1997),Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs,(2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kếtquả tốt Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã đượng đăng kí bản quyền về làm

màng BC từ A.xylinum dùng trị bỏng Các tác giả Jonas và Farad (1998),

Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng dacho phụ nữ.[5]

1.5.2 Ở Việt Nam

Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải tiến Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màngtrị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng cácchất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng … Từ năm 2000nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã có một số

công trình nghiên cứu về màng BC từ A xylinum và bước đầu nghiên cứu về

các đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trongtrị bỏng ở Việt Nam.[9]

Điều trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên đã được áp dụng

từ rất lâu và phổ biến ở tất cả các nước Các thuốc này có sẵn trong thiênnhiên và có nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vếtthương, vết loét…

Màng BC có nhiều ưu điểm để trở thành chất mang các hợp chất cónguồn gốc từ thiên nhiên sử dụng trong điều trị bỏng.[14]

1.6 Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài

Luận văn thạc sĩ vi sinh học 2009 : “Nghiên cứu một số đặc tính vật lý của

màng BC từ Acetobacter xylinum, ứng dụng trong trị bỏng” của Trần như

Quỳnh- ĐHSP Hà Nội đã làm được một số vấn đề sau:

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum

BHN2

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men tạo màng

BC của chủng A.xylinum BHN2, qua đó lựa chọn được môi trường thích hợp

cho chủng A.xylinum BHN2 lên men tĩnh

+ Điều kiện nuôi cấy: hàm lượng giống bổ sung ban đầu cho lên men tạomàng là 10% thể tích lên men, với PH ban đầu của môi trường lên men từ4,5-5,5

+ Môi trường dinh dưỡng: hàm lượng đường glucose 20g/l; (NH4)2SO4: 2 g/l; KH2PO4: 2 g/l; MgSO4.7H2O: 2 g/l

- Nghiên cứu được tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên men cho chủng

A.xylinum BHN2 tạo màng tốt nhất

- Xử lý màng BC ứng dụng trong điều trị bỏng và khảo sát các đặc tính của

màng: khả năng kháng khuẩn cao, độ bền cơ học 3,62 kN/m, độ thấu khí120ml/phút, khả năng hút nước 6,82g/100cm2/24 giờ; màng không có triệuchứng kích ứng

- Màng BC tẩm dầu mù u và kem nghệ làm lành vết thương sau 19 ngày điềutrị

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu chính

Đối tượng nghiên cứu là các chủng A xylinum BHN2 được phòng thí nghiệm Thực vật - Vi Sinh Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư pham Hà Nội 2 cung cấp

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

2.1.2.1 Hoá chất

- Nguồn Cacbon: Rượu etylic, Glucose, Sacrose, Manitol, Lactose, Fructose, Dihyroxyaceton, Axit acetic

- Nguồn Nitơ: Cao nấm men, Pepton, (NH4)2SO4

- Các muối khoáng: KH4PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH, CuSO4

- Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nấm men, cao ngô

- Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol

- Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol

- Ngoài ra còn sử dụng : Các loại bia, nước dừa, các loại nước chiết quả

2.1.2.2 Thiết bị

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

Nồi hấp Tommy (Nhật)

Máy so màu UV – vis ( Nhật)

Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20l – 10ml

Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40.Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ).

Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn…

Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Nước máy: 1000ml

2.1.3.3 Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng

Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g

KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g

Cao nấm men: 3g Pepton: 4g

Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Nước dừa: 1000ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp hoạt hóa giống A.xylinum BHN2

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sử dụngphải hoạt hóa giống “làm thức tỉnh giống”, nhân giống đảm bảo đủ số lượng

tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hóa giống sử dụngmôi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút Sau đó đem xử lí trong đèn tím 15 phút để khử khuẩn, sau đó cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong

24 giờ

2.2.2.Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum BHN2

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100Ctrong 20 phút để tránh phân dã đường Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong

15 phút Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách bổ sung vào môitrường lên men 5% giống đã hoạt hóa Nuôi cấy ở điêu kiện tĩnh trong 7-10ngày

2.2.3 Phương pháp bảo quản chủng giống A.xylinum BHN2 trên môi trường thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3 –

4 ngày ở 300C Sau đó, giữ lạnh ở tủ 40C để bảo quản giống Cấy truyền giữ giống trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần.[4]

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ

chủng A xylinum BHN2