Ảnh hưởng của (NH4)2SO4, KNO3 tới khả năng tạo màng BC cho vi khuẩn gluconacetobacter

... men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter 3.2 Ảnh hƣởng KNO3 tới khả lên men tạo màng BC chủng vi khuẩnGluconacetobacter 3.3 Ảnh hƣởng (NH4)2SO 4tới khả lên men tạo màng BC chủng vi khuẩn Gluconacetobacter. .. sát khả lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 25 3.2 Ảnh hƣởng KNO3 tới khả lên men tạo màng BC chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 28 3.3 Ảnh hƣởng (NH4)2SO4 tới. .. KNO 3tới khả tạo màng BCcho vi khuẩnGluconacetobacter" Mục đích nghiên cứu Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho lên men tạo màng BC chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Nội dung nghiên cứu 3.1 Lên men tạo

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ---------- BÙI THỊ HUẾ ẢNH HƢỞNG CỦA (NH4)2SO4, KNO3 TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BC CHO VI KHUẨN GLUCONACETOBACTER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. PHƢƠNG PHÚ CÔNG HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tổ Thực vật – Vi sinh, Trƣờng Đại hoc Sƣ phạm Hà Nội 2, và thầy TS. Phƣơng Phú Công, Cục Khảo thí - Bộ Giáo dục và Đào tạo ngƣời đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu đề này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thƣ viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em, hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân, những ngƣời luôn quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài. Em xin trân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Huế LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật.Đây là kết quả của riêng tôi. Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dƣới sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và TS. Phƣơng Phú Công Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình. Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Huế DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LUẬN Bảng Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ KNO3 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter ............................................................. 30 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter....................................................... 32 Bảng 3.3. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng nƣớc dừa và môi trƣờng nƣớc gạo thay thế nƣớc dừa ..... 35 Hình Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của Gluconacetobacter .............................. 23 Hình 3.2. Gluconacetobacter trên môi trƣờng thạch đĩa ............................... 24 Hình 3.3. Gluconacetobacter trong môi trƣờng dịch lỏng ............................ 24 Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter ........... 25 Hình 3.5. Vòng phân giải CaCO3 ................................................................. 25 Hình 3.6. Vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trƣờng thạch nghiêng ........ 26 Hình 3.7. Vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trƣờng nhân giống cấp 1 ..... 27 Hình 3.8. Màng BC từ chủng Gluconacetobacter......................................... 28 Hình 3.9. Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lƣợng KNO3 ..... 29 Hình 3.10. Sau 4 ngày lên men tạo màng BC trên MT3 có sự thay đổi hàm lƣợng KNO3 ........................................................................ 30 Hình 3.11. Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lƣợng (NH4)2SO4 .................................................................................. 31 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng .................................................................................... 33 Hình 3.13. Khối lƣợng màng BC thu đƣợc trên môi trƣờng nƣớc dừa và môi trƣờng nƣớc gạo .................................................................. 35 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BC: Bacterial cellulose cs: Cộng sự MT: Môi trƣờng STT: Số thứ tự MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ..................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 2 4. Ý nghĩa của đề tài .................................................................................... 2 5. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... 2 6. Điểm mới của đề tài ................................................................................ 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconecetobacter trong sinh giới ........... 3 1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới .................. 3 1.1.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter ................................... 3 1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter.......................... 6 1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ........................................................ 6 1.2.2. Nhu cầu nitơcủa vi sinh vật ............................................................ 6 1.2.3. Hàm lượng ethanol trong dịch lên men........................................... 7 1.3. Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter .... 7 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng Bacterial cellulocse .......................... 7 1.3.2. Một số tính chất của màng Bacterial cellulocse.............................. 8 1.3.3. Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulocse ............................................. 9 1.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter trên thế giới và ở Việt Nam................................................................................................ 12 1.4.1. Trên thế giới ................................................................................. 12 1.4.2. Tại Việt Nam ................................................................................ 14 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16 2.1. Đối tƣợng ngiên cứu và hóa chất ........................................................ 16 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 16 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................... 16 2.1.3. Hóa chất ....................................................................................... 16 2.1.4. Môi trường ................................................................................... 17 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 17 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật ............................................................... 17 2.2.2. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC ................. 19 2.2.3. Phương pháp hóa sinh .................................................................. 19 2.2.3.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase .................................. 19 2.2.4. Phương pháp toán học ................................................................. 19 2.2.5. Quá trình xử lí màng BC từ chủng Gluconacetobacter ................. 20 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 23 3.1. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter .......................... 23 3.1.1. Quan sát hình hình thái tế bào của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter .................................................................................. 23 3.1.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa ......................................... 23 3.1.3 Sinh trưởng trên môi trường dịch lỏng .......................................... 24 3.1.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Gluconacetobacter ...................... 24 3.1.5. Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter ................................................................................. 25 3.2. Ảnh hƣởng của KNO3 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter .......................................................... 28 3.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter ........................................................... 31 3.4. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng dinh dƣỡng từ nƣớc gạo ................................................... 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 37 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Màng sinh học (Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit). Cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ không chứa các hợp chất cao phân tử nhƣ: ligin, peptin, hemicellulose, và sáp nến... Do vậy chúng có những đặc tính vƣợt trội với độ dẻo dai, độ bền, chắc khỏe, độ đàn hồi. Với những đặc tính hóa, lí ƣu việt trên nên màng BC đƣợc xem nhƣ là một nguồn polymer sinh học mới, nó thu hút đƣợc sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỉ XIX và đƣợc ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau nhƣ: trong công nghiệp sản xuất giấy, màng BC đƣợc dùng để sản xuất giấy điện tử chất lƣợng cao; Trong công nghệ môi trƣờng, màng BC làm màng phân tách để xử lý nƣớc và biến đổi độ nhớt của nƣớc (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998). Trong y học, màng BC đã đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời; Ngoài ra, màng BC còn đƣợc dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lƣợng (Brown, 1989), làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm... Nhận thấy rằng nitơ là nguồn dinh dƣỡng quan trọng ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật. Để tìm hiểu rõ hơn ảnh hƣởng của nitơ tới quá trình tạo màng BC mỏng, dai, có thời gian nuôi cấy ngắn nhất tôi đi đến quyết định chọn đề tài: "Ảnh hưởng của (NH4)2SO4, KNO3tới khả năng tạo màng BCcho vi khuẩnGluconacetobacter". 1 2. Mục đích nghiên cứu Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter. 3.2. Ảnh hƣởng của KNO3 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩnGluconacetobacter. 3.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter. 3.4. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng dinh dƣỡng từ nƣớc gạo. 4. Ý nghĩa của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Tìm đƣợc nguồn nitơ thích hợp nhất đối với khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tạo màng BC trong thời gian ngắn nhất và tốt nhất có triển vọng ứng dụng vào một số lĩnh vực trong cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực y học. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1. Phƣơng pháp vi sinh vật 5.2. Phƣơng pháp hóa sinh 5.3. Phƣơng pháp toán học 6. Điểm mới của đề tài Đã lựa chọn đƣợc hàm lƣợng (NH4)2SO4 là 3g/l thích hợp cho lên men tạo màng BC cho vi khuẩn Gluconacetobacter. 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconecetobacter trong sinh giới 1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới Theo hệ thống Gluconacetobacterthuộc phân chi loại của Acetobacter, nhà họ khoa học Bergey thì Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes.Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn acetic, là loài vi khuẩn tạo đƣợc nhiều BC nhất trong tự nhiên. Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tửglucose thành cellulose trong 1 giờ. Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy, đòi hỏi cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về loại vi khuẩn này. 1.1.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái, tế bào học Gluconacetobacter là trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc khoảng 2µm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử.Các tế bào đƣợc bao bọc bởi màng nhày có bản chất là hemicellulose, màng này bắt màu xanh khi nhuộm axit H2SO4, bắt màu hồng khi nhuộm fucshin.Gluconacetobacter có khả năng tích lũy 4,5% acid acetic trong môi trƣờng, khi nồng độ acid trong môi trƣờng khá cao sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [4]. Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thƣớc lớn (đƣờng kính khuẩn lạc đạt 2 - 5 mm), tròn, bề mặt nhày và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. 3 Hình 1.1.Vi khuẩn Gluconacetobacter 1.1.2.2. Đặc điểm nuôi cấy Trên môi trƣờng thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc lồi lên dễ tách khỏi môi trƣờng. Ở điều kiên nuôi tĩnh, trong môi trƣờng dịch thể chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trƣờng môt lớp màng cellulose, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đổi oxy và các chất dinh dƣỡng. Ngƣợc lại, khi nuôi cấy trong điều kiện lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thƣớc không đều nhau và phân tán trong môi trƣơng dinh dƣỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi tĩnh [6]. 1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa + Đặc điểm sinh lí: Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 35oC, pH: 4 - 6. Nhiệt độ và pH tối ƣu tùy thuộc vào giống.Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trƣờng tối ƣu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối ƣu cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trƣởng và tạo màng. 4 Gluconacetobacter có khả năng chịu đƣợc pH thấp nên ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm acid acetic vào môi trƣờng nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ. + Đặc điểm sinh hóa: Năm 1950, Frateur đã chính thức đƣa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hoa acid acetic thành CO2và H2O; hoạt tính catalase; khả năng tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer... Theo quan điểm này Gluconacetobacterlà chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi đƣợc trình bày ở bảng 1.1 dƣới đây: Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter theo Frateur (1950) STT Đặc điểm Hiện tƣợng Kết quả -Oxy hóa ethanol thành -Chuyển hóa môi trƣờng chứa 1 acid acetic Bromphenol Blue 0,04% từ màu + xanh sang màu vàng 2 3 4 -Hoạt tính catalase -Sinh trƣởng trên môi -Sinh khối không phát triển trƣờng Hoyer -Chuyển hóa glycerol -Tạo kết tử đỏ gạch trong dịch thành dihydroxyaceton -Chuyển 5 -Hiện tƣợng sủi bọt khí hóa thành acid sau lên men + - + glucose -Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng + chứa CaCO3 6 7 -Kiểm tra khả năng sinh -Không hình thành sắc tố nâu sắc tố nâu -Kiểm tra khả năng tổng -Váng vi khuẩn xuất hiện màu hợp cellulose xanh lam 5 - + 1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Để vi khuẩn sinh trƣởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon đƣợc cung cấp là vô cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dƣỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hóa học và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lí của từng loại vi sinh vật. Ngƣời ta sử dụng đƣờng làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dƣỡng. Đƣờng đơn ở nhiệt độ cao có thể chuyển hóa thành loại hợp chất cố màu tối khó hấp thụ. Trong môi trƣờng kiềm sau khử trùng, đƣờng còn dễ bị chuyển hóa làm biến đổi pH môi trƣờng. Để tránh hiện tƣờng này khi khử trùng môi trƣờng có chứa đƣờng ngƣời ta thƣờng chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm ở 110oC trong 30 phút. Từ các loại đƣờng đơn tốt nhất nên sử dụng phƣơng pháp hấp gián đoạn (phƣơng pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác ngƣời ta sử dụng các nồng độ đƣờng không giống nhau, với vi khuẩn thƣờng dùng 0,2 - 0,5% đƣờng. Gluconacetobacter sinh trƣng chính trong môi trƣờng có ethanol, glucose, glycerol.Có thể sinh trƣởng trong môi trƣờng chỉ có D - mantolse.Hầu hết các chủng không sử dụng sucrose [7]. Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nƣớc thịt, nƣớc chết ngô, nƣớc chiết nấm men, nƣớc chiết đại mạch...) có thể vừa dụng làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với sinh vật [7]. 1.2.2. Nhu cầu nitơcủa vi sinh vật Môi trƣờng cơ bản cho nghiên cứu về cellulose vi khuẩn là môi trƣờng do Hestrin và Schramm thiết lập [7], có chứa cao nấm men và peptone là nguồn hữu cơ, (NH4)2SO4 là nguồn nitơ vô cơ. Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. 6 Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trƣờng có sử dụng NH4+ trong môi trƣờng sẽ tích lũy anion vô cơ (SO42-, Cl-...) làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trƣờng. Muối anion của các acid hữu cơ ít làm chua môi trƣờng hơn do đó có lúc đƣợc sử dụng nhiều hơn (mặc dù dù đắt hơn). Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi, xạ khuẩn nhƣng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trƣờng [7]. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ, các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid không chƣa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [7]. 1.2.3. Hàm lượng ethanol trong dịch lên men Ethanol đƣợc sử dụng nhƣ một cơ chất.Hàm lƣợng ethanol có thể thay đổi từ 2 - 10% V. Hàm lƣợng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo Hong - Joo Son lại công bố hàm lƣợng ethanol có thể thay đổi từ 0,2 - 1% tốt nhất là ở 0,6% [4]. Theo Nodes, lƣợng ethanol duy trì trong môi trƣờng luôn giữ ở 3 - 3,5%. Các tác giả Ebner và Heirich, cho lƣợng ethanol dùng từ 7 10% V. Để tránh hiện tƣợng oxy hóa hoàn toàn acid acetic cần có mooti lƣợng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2 - 0,5% để ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối acetate [7]. Ngoài việc oxy hóa ethanol, vi khuẩn acetic còn có khả năng oxy hóa các rƣợu khác thành acid tƣơng ứng. 1.3. Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng Bacterial cellulocse BC có đƣờng kính bằng 1/100 đƣờng kính của cellulose thực vật (PCPlant Cellulose). Màng BC đƣợc cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật nhƣng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau [16]. 7 Chuỗi polyme β-1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thƣớc 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn-sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000). Dải ribbol có chiều dài trong khoảng từ 1-9 nm. Những dải ribbol đƣợc kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbol của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lƣới hay một lớp màn mỏng trên bề mặt môi trƣờng nuôi cấy. Hình 1.2. Sợi cellulose của màng BC Hình 1.3. Sợi cellulose của thực vật 1.3.2. Một số tính chất của màng Bacterial cellulocse Brown A. J (1886), đã nghiên cứu các lớp màng đặc đo vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra trên môi nuôi cấy và thấy có bản chất là hemicellulose. Hemicellulose là những polysaccarid không tan trong nƣớc nhƣng tan trong dng dịch kiềm tính. Một số tính chất của màng BC: độ tinh sạch: màng BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn; Độ bền cơ học: màng BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lƣợng lớn, ổn định về kích thƣớc; Tính hút nƣớc: màng BC có khả năng giữ nƣớc đáng kể (lên đến 99%), có tính tơi xốp, độ ẩm cao. 8 1.3.3. Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulocse Quá trình tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bƣớc đƣợc điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [13]. Theo tác giả Alina Krystynowics và cs có 4 enzyme tham gia xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter: Glucokinase, Phosphoglucomutase, Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UPG), Cellulose synthase (CS). Trong đó UPG là enzyme có vai trò quan trọng nhất. Hình 1.4.Con đƣờng sinh tổng hợp cenlulose ở Gluconacetobacter Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Giai đoạn polymer hóa Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose thành glucose-6-phosphate.Enzyme phosphoglucomutase tiếp 9 tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate thông qua phản ứng isome hóa.Glucose-1-phosphate nhờ enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase chuyển hóa thành UDP-glucose.Cuối cùng, UDP-glucose đƣợc tổng hợp nên sẽ đƣợc chuyển hóa thành cellulosevà cellulose đƣợc tiết ra mội trƣờng ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase.Enzym này đƣợc hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng là cyclic-di-GMP. Một số chủng vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sử dụng đƣờng fructose hiệu quả hơn. Hệthống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành fructose-1-phosphate.Sau đó fructose-1-phosphate sẽ chuyển hóa thành fructose-bi-phosphate nhờ enzym fructose-1- phosphatekinase.Enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa thành fructose-6-phosphate.Glucose-1-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tƣơng tự nhƣ trên để tạo ra cellulose. Giai đoạn kết tinh Các chuỗi glucan đƣợc nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan. Trong đó các chuỗi glucan kết hợp tạo thành chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals.Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hidro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi [12]. Ý nghĩa của quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter Phần lớn tế bào trong môi trƣờng tĩnh, Gluconacetobacter khôngdi động do chúng nằm bên trong lớp màng cellulose. Điều này làm cản trở nghiên cứu về quá trình chuyển hóa, vận chuyển chất dinh dƣỡng và oxy đến tế bào. 10 Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung quanh môi trƣờng hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trƣờng, điều này ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khác, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. Màng cellulose có khả năng giữ nƣớc nên nên giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất dinh dƣỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại ảnh hƣởng của tia UV (tia tử ngoại). Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nƣớc của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại đƣợc những thay đổi không thuận lợi trong môi trƣờng sống nhƣ: giảm độ ẩm, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc hại. Các vi khuẩn Gluconacetobacter có thể tăng trƣởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao. Thực nghiệm chỉ ra rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter đƣợc bao bọc bởi BC sống sót sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống sót của tế bào giảm chỉ còn khoảng 3% [6]. Mạng lƣới BC là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn Gluconacetobacter luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trƣờng lỏng và không khí. Chính mạng lƣới này làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trƣờng và làm tế bào thâu nhận chất dinh dƣỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trƣờng lỏng không có mạng lƣới cellulose [10]. Trong môi trƣờng tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào và màng BC là một điển hình. Một vài nghiên cứu còn cho thấy, cellulose đƣợc tổng hợp bởi Gluconacetobacter còn đóng vai trò tích trữ và có thể sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu dinh dƣỡng. Sự phân hủy cellulose đƣợc xúc tác bởi enzyme exo gluconase hay endo glucanase. Các enzyme exo gluconase hay endo glucanase phân hủy cellulose đƣợc phát hiện trong dịch nuôi cấy ở một và chủng Gluconacetobacter sản xuất cellulose [10]. 11 1.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1. Trên thế giới Vi khuẩn Gluconacetobacter và màng BC đã thu hút đƣợc sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghệ môi trƣờng, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, y học... Các nghiên cứu hiện nay về màng Bc trên thế giới đã tập trung vào vấn đề đề sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ màng BC vào các lĩnh vực khác nhau. Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter và những ứng dụng của nó đã đƣợc hành ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tác giả Brown, 1999, dùng màng BC làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng tế bào. Brown, Jonas và Farad, dùng màng nhƣ một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Jay shah, Brown. M. R. (2005) đã dùng BC làm vải đặc biệt, Barbara Surma và cộng sự (2008), Jonas và Farad (1998) dùng màng BC để sản xuất giấy chất lƣợng cao, làm cơ chất để cố định pritein thay co sắc kí. Đặc biệt, trong y học, ngƣời ta đã chế tạo các phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan, hoặc cellulose và polyvinul, các phức chất này đƣợc sử dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm sạch máu điều trị các bệnh tim mạch. Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng đƣợc ứng dụng trong phẫu thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng BC còn đƣợc sử dụng làm mặt nạ dƣỡng da cho phụ nữa, làm giấy chất lƣợng cao, microbial cellulose đƣợc dùng chế tạo màn hình điện tử, vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phẩm phụ gia,... 12 Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh hƣởng của nguồn cacbon dến khả năng hình thành màng cellulose; nghiên cứu chế tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy điện tử chất lƣợng cao từ màng vi khuẩn (Jay shah, Brown. M. R., 2005); nghiên cứu của Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) về con đƣờng hình thành cellulose ở vi khuẩn, cấu trúc sợi cellulose và đặc tính của màng cellulose, mối quan hệ giữa khả năng hình thành cellulose và khả năng sinh axit acetic [15]; trong khi đó Alina Krystynowicz và cộng sự (2005) đã so sánh đặc điểm sinh học phân tử của chủng Gluconacetobacter dại (có khả năng tổng hợp cellulose) và chủng đột biến (không có khả năng tổng hợp cellulose) [16]; năm 2006 đã có các nghiên cứu về cấu trúc của màng BC sử dụng làm monocomposit; Czafa, W. Young; Elvie Escoro Brown đã nghiên cứu và đi đến kết luận có sự tƣơng đồng vầ cấu trúc giữa màng BC với colagen. Năm 2007, Neelobon và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng hình thành màng trong điều kiện cụ thể là nuôi tĩnh, nuôi lắc và nuôi trong bioreactor; Sirlene M. Costa và cộng sự nghiên cứu đặc tính vật lý của màng, cấu trúc sợi cellulose của màng trong điều kiện nuôi cấy, ứng dụng trong sản xuất giấy; Wojciech K. và cộng sự nghiên cứu đặc tính, cấu trúc màng cellulose ứng dụng làm da nhân tạo. Năm 2008, Barbara Surma-S'lusarska và cộng sự [17] đã đƣa ra phƣơng pháp chế tạo màng và nghiên cứu đặc điểm màng, ảnh hƣởng của nguồn cacbon, đƣờng glucose, manitol và xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi cellulose của màng và ứng dụng trong sản xuất giấy. Hầu hết các tác giả nƣớc ngoài nghiên cứu theo hƣớng sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn, ứng dụng của màng BC trong y học, công nghiệp giấy, trong chế biến thực phẩm. Tuy nhiên những ứng dụng thƣờng thấy trên thế giới của màng BC là trong ngành dƣợc phẩm và mỹ phẩm. Czajt và cs (2006), sử dụng màng Bc 13 đắp lên vết thƣơng hở, vết bỏng đã thu đƣợc kết quả tốt. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dƣỡng da cho phụ nữ. 1.4.2. Tại Việt Nam Ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về Gluconacetobacter và màng BC còn khá mới mẻ. Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc của màng. Về ứng dụng thực tiễn, mới chỉ đƣợc ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng và đƣợc ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [3], [5], [6], [9], [10]. Hiện nay việc nghiên cứu tìm môi trƣờng tối ƣu cho quá trình tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter chƣa đƣợc thực hiện. Hầu nhƣ có rất ít các nghiên cứu liên quan đến sự hình thành BC và ứng dụng màng BC. Năm 1997, có công trình của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Mùi nghiên cứu môi trƣờng nƣớc giá đỗ thay thế nƣớc dừa trong sản xuất thạch dừa từ vi khuẩn Gluconacetobacter. Năm 1995 – 2000, các công trình nghiên cứu về vi khuẩn Gluconacetobacter và khả năng lên men sinh axit acetic của nhóm tác giả Lê Văn Nhƣơng, Nguyễn Thị Ngọt, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Văn Cách. Các công trình mới chỉ bƣớc đầu nghiên cứu quá trình sinh axit acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC [4]; gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm nên và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn. Năm 2000, nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hƣơng, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hƣng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện lên men cho vi khuẩn Gluconacetobacter ứng dụng vào làm thạch dừa. Năm 2003, có nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thúy Hƣờng, Phạm Thành Hổ về chọn lọc dòng Gluconacetobacterthích hợp cho các loại môi trƣờng dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn [11]. Năm 2006, nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Văn 14 Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan và cộng sự về màng BC từ Gluconacetobacter tẩm dầu mù u dùng trong điều trị bỏng [6]. Năm 2008, có nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung đã chọn đƣợc một chủng Gluconacetobacter NH1, khảo sát khả năng tạo màng của chủng này. Ngoài nguồn nguyên liệu nƣớc hoa quả dùng cho lên men giấm, còn có thể sử dụng nhiều nguồn nguyên lệu khác nhƣ các loại bia, rƣợu nhạt, các nguyên liệu có chứa đƣờng, tinh bột, axit hữu cơ, giàu vitamin... từ các vùng miền khác nhau ở Việt Nam. Việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng Gluconacetobacter ngày càng đƣợc nhiều tác giả quan tâm. Ngày càng có nhiều các nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng Gluconacetobacter sự hình thành màng BC và các hƣớng ứng dụng màng BC. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trƣởng bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh, Trƣờng đại học Y Dƣợc học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng phƣơng pháp lên men. Màng BC có khả năng thấm nƣớc cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò nhƣ màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da, chính vì vậy dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thƣơng bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thƣơng, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu. Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu nhận màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter, ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng. 15 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng ngiên cứu và hóa chất 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu là chủng Gluconacetobacter từ phòng thí nghiệm Vi Sinh - Khoa sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ pham Hà Nội 2 cung cấp. 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ và thiết bị sau: Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức). Box cấy vô trùng (Haraeus). Nồi hấp Tommy (Nhật). Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh). Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 0.5 µl – 10ml. Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40. Cân (Preccisa XT 320M- Thụy Sỹ). Khay nhựa có kích thƣớc 15 x 10 x 4 cm. Tủ lạnh, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn… 2.1.3. Hóa chất Nguồn Cacbon: Ethanol, Glucose, Acid acetic, Agar. Nguồn Nitơ: (NH4)2SO4, KNO3. Các muối khoáng: KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O. Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol. Ngoài ra còn sử dụng: nƣớc dừa. 16 2.1.4. Môi trường 2.1.4.1. Môi trường giữ giống (MT1) Glucose: 20g (NH4)2SO4: 3g KH2PO4: 2g MgSO4.7H2O: 2g Pepton : 5g Agar: 20g Nƣớc máy: 1000ml. 2.1.4.2. Môi trường nhân giống (MT2) Glucose: 20g (NH4)2SO4: 3g KH2PO4: 2g MgSO4.7H2O: 2g pH: 5,0 - 6,0 Axit acetic: 2% Nƣớc dừa: 1000ml 2.1.4.3. Môi trường lên men (MT3) Glucose: 20g (NH4)2SO4: 3g KH2PO4: 2g MgSO4.7H2O: 2g pH: 5,0 - 6,0 Axit acetic: 2% Nƣớc dừa: 1000ml 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật 2.2.1.1. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng Các chủng sau khi phân lập đƣợc xác định là vi khuẩn Gluconacetobacterđƣợc cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm 30oC. Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4 oC dùng cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo 2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa giống Giống từ ống nghiệm đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, trƣớc khi đem sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lƣợng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phƣơng pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trƣờng tiêu 17 chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121o C trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn cực tím trong 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghiêng vào nuôi lắc 130 vòng/phút trong 24h [8], [14]. 2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phƣơng pháp nhuộm gram: Tím gentian: 2 phút Rửa nƣớc Dung dịch lugol: 2 phút Rửa nƣớc Cồn 95o: 20 giây Rửa nƣớc Dung dịch fucshin: 2 phút Rửa nƣớc Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó soi trên tiêu bản dƣới vật kính dầu và kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm màu hồng, đó là vi khuẩn Gluconacetobacter. 2.2.1.4. Phương pháp lên men tạo màng Sử dụng môi trƣờng lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110oC trong 20 phút để tránh caramen đƣờng.Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung vào môi trƣờng 10% giống hoạt hóa. Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh và theo dõi sự hình thành màng BC. Khoảng sau 5 ngày thì có thể thu đƣợc màng. 18 2.2.2. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC Sau khi nuôi cấy, màng đƣợc lấy ra, để ráo nƣớc khoảng 4 -5 giờ, trên khay nhựa của nhiệt độ phòng thí nghiệm. Tiến hành cân màng trên cân điện tử. Trọng lƣợng tƣơi của màng đƣợc tính bằng hiệu số của trọng lƣợng khay nhựa lúc có và chƣa có màng. 2.2.3. Phương pháp hóa sinh 2.2.3.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tƣợng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó đƣợc coi là có hoạt tính catalase (catalase +). Ngƣợc lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -). 2.2.3.2. Xác định khả năng oxy hóa acid acetic Sử dụng môi trƣờng sau để khử khả năng oxy hóa acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn. Thành phần: Cao nấm men : 10g Calcium acetate : 10g Thạch : 20g Nƣớc máy : 1000ml pH : 7,0-7,2 Phân phối môi trƣờng vào bình tam giác đem khử trùng ở 121oC trong 20 phút, để nguội khoảng 40-45oC đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới hoạt hóa (18-24h) nuôi 6-7 ngày ở điều kiện thích hợp. Quan sát hiện tƣợng: nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dƣơng tính (acetat bị oxy hóa, calcium giải phóng ra tạo màu trắng sữa), nếu không là âm tính. 2.2.4. Phương pháp toán học Chúng tôi xử lí các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp trong cuốn "Ứng dụng tin học trong sinh học" [1], và "Thống kê và ứng dụng" [2] nhƣ: 19 Số trung bình công: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: ̅ ∑ Trung bình bình phƣơng các sai lệch: ̅ ∑ √ Sai số đại diện của trung bình cộng: M= √ Hệ số biến thiên: Cv ̅ Trong đó: n: Số lần nhắc lại. Xi: Giá trị của lần thứ i S: Độ lệch chuẩn m: Sai số trung bình học 2.2.5. Quá trình xử lí màng BC từ chủngGluconacetobacter Do màng BC khi đƣợc tạo thành còn khá nhiều thành phần dƣ của môi trƣờng bám vào nên mục đích của quá trình xử lí màng là loại bớt các sản phẩm dƣ thừa (thành phần chính là đƣờng dƣ), giảm độ pH, làm sạch khuẩn đồng thời phần nào giúp màng đạt đƣợc hiệu quả về mặt cảm quan: màu trắng trong, dai và bền hơn... Song màng BC chúng tôi nghên cứu chủ yếu đƣợc ứng dụng sản xuất ở qui mô công nghiệp, vì vậy các bƣớc xử lí màng phải đơn giản, hiệu quả và ít tốn kém. Màng BC thu trực tiếp từ dịch nuôi cấy đƣợc qua các bƣớc xử lí sau: Bảng 2.1. Các bƣớc xử lí màng BC STT Các bƣớc xử lí Kết quả 20 1 -Rửa sạch màng bằng nƣớc máy nhiều -Loại bỏ bớt acid acetic và các thành phần dƣ thừa từ môi lần trƣờng, màng có màu vàng, mùi hơi chua. 2 -Ngâm màng BC trong dung dịch -Làm chết và làm sạch vi muối NaCl 0,7M, ở 25 - 40oC trong 12 khuẩn giờ -Rửa nƣớc và đun sôi 3 lần. -Loại bớt muối và chất dƣ thừa 3 -Cho màng BC vào dung dịch NaOH - Loại bỏ chất dƣ thừa, làm 0,5M (400g màng BC/1 lít), ở 30 - trắng màng, kiềm hóa bề mặt 40oc cho đến khi màng chuyển sang sợi cellulose. Màng có màu trắng trong, mùi khét, giảm độ màu trắng trong (20 phút) cứng và dai -Rửa sạch bằng nƣớc máy nhiều lần -Giảm bớt nồng độ kiềm (pH: 8,3) 4 -Trung hòa bằng acid citric loãng và -Màng có màu trắng đục, có kiểm tra bằng máy đo pH. Rửa sạch để mùi kiềm muối Natri acetat -Ngâm cồn 70o, kiểm tra nếu còn kiềm -Kiềm còn dƣ và chất dƣ thừa tiếp tục trung hòa bằng acid acetic sẽ tan trong cồn, sau khi trung -Rửa nƣớc và đun sôi màng 3 lần, mỗi hòa pH: 7 lần đun sôi từ 2 - 3 phút -Loại bỏ muối Natri acetat, các chất dƣ thừa. Màng trắng hơi đục, không mùi 21 Sau khi xử lí màng BC, chúng tôi tạo màng có kích thƣớc 10x10 cm, sau đó sấy màng ở nhiệt độ 45oC trong khoảng 6 giờ để làm thoát bớt hơi nƣớc có trên màng. Nhìn chung, thời gian để sấy màng phụ thuộc nhiều vào độ dày của màng, nếu sấy màng ở nhiệt độ quá cao màng sẽ bị giòn, giảm tính dẻo dai. Quy trình bảo quản nhƣ sau: + Sấy màng ở độ ẩm khoảng 30%. + Đóng gói chế phẩm màng trong các túi nilon nhờ máy hút chân không. + Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC, trong 15 phút. 22 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter 3.1.1. Quan sát hình hình thái tế bào của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Chủng Gluconacetobacter nhận từ phòng Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học Labomed (Mỹ) với độ phóng đại 1000 lần, nhận thấy vi khuẩnGluconacetobacter là trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong,kích thƣớc khoảng 2µm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào đƣợc bao bọc bởi màng nhày có bản chất là hemicellulose,bắt màu hồng khi nhuộm fucshin. Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của Gluconacetobacter 3.1.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa Trên môi trƣờng thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc nhƣ hình 3.2 23 Hình 3.2.Gluconacetobacter trên môi trƣờng thạch đĩa Khi quan sát trên hình 3.2 thấy khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thƣớc lớn (đƣờng kính khuẩn lạc đạt 2 - 5 mm), tròn, bề mặt nhày và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. 3.1.3 Sinh trưởng trên môi trường dịch lỏng Vi khuẩn Gluconacetobacter nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng hình thành một lớp màng trên môi trƣờng nuôi cấy (hình 3.3) Hình 3.3.Gluconacetobacter trong môi trƣờng dịch lỏng 3.1.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Gluconacetobacter 3.1.4.1. Hoạt tính catalase Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tƣợng sủi bọt khí (hình 3.4). Chứng tỏ oxy đƣợc giải phóng ra, hay dƣới tác dụng của enzzym catalase phân giải H2O2 theo phƣơng trình: H2O2→H2O + 24 1 O2 2 Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 3.1.4.2. Khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng có chứa CaCO3 điều đó cho thấy acid gluconic đã đƣợc tạo thành (Hình 3.5). Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trƣờng từ màu trắng sang không màu. H+ + CaCO3 → Ca2+ + H2O + CO2 Vòng phân giải CaCO3 Hình 3.5. Vòng phân giải CaCO3 3.1.5. Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Dựa theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, TS. Dƣơng Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter đƣợc tiến hành theo 4 bƣớc cơ bản sau: 25 Bƣớc 1: Nhân giống ↓ Bƣớc 2: Hoạt hóa giống ↓ Bƣớc 3: Lên màng ↓ Bƣớc 4: Thu màng Cụ thể nhƣ sau: Bước 1: Nhân giống Quá trình nhân giống đƣợc tiến hành cấy truyền liên tục chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng thạch nghiêng. Hình ảnh vi khuẩn Gluconacetobacter đƣợc cấy truyền trên thạch nghiêng đƣợc thể hiện trong hình 3.6 Hình 3.6.Vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trƣờng thạch nghiêng Chủng Gluconacetobacter khi nuôi cấy trên thạch nghiêng có màu trắng đục, bề mặt nhẵn, bóng, có tính dai và nhớt. Bước 2: Hoạt hóa Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối vi khuẩn từ các ống giống Gluconacetobacter nuôi trong các bình chứa nhân giống cấp 1 theo tỉ lệ 3 ống giống/250ml dịch. 26 Sau đó tiến hành lắc các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 trong khoảng 1-1,5 ngày để thu sinh khối Gluconacetobacter. Các bình chứa nhân giống cấp 1 đƣợc thể hiện trong hình 3.7 Hình 3.7.Vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trƣờng nhân giống cấp 1 Sau 1-1,5 ngày nuôi lắc, các bình giống Gluconacetobacter có màu trắng đục, có hệ sợi lơ lửng trong dung dịch, đó là các sợi cellulose mà vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trƣởng. Bước 3: Tạo màng Dùng micropipet cấy dịch nhân giống cấp 1 vào môi trƣờng lên men theo tỉ lệ 10ml/100ml môi trƣờng. Tiến hành lên men tĩnh 4 ngày Các hộp lên men sau 4 ngày xuất hiện 1 lớp màng màu trắng đục trên bề mặt dịch lên men. Lớp màng này có thể dày hay mỏng khác nhau ở các hộp khác nhau. Bước 4: Thu màng Thu màng ở ngày thứ 4 Sau 4 ngày tiến hành thu màng BC. Chuẩn bị hộp cồn 90o để ngâm bảo quản màng. Dùng găng tay cao su vớt màng trong các hộp lên men. Tiến hành cân và kiểm tra đặc tính của từng màng nhƣ cân nặng, độ dày, độ dai. 27 Hình 3.8. Màng BC từ chủng Gluconacetobacter Đã lên men tạo màng BC thành công từ chủng Gluconacetobacter 3.2. Ảnh hƣởng của KNO3 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Trong quá trình phát triển tiến hóa, các vi sinh vật có quan hệ mật thiết với các yếu tố của điều kiện sống. Mọi hoạt động sống của vi sinh vật đều phụ thuộc vào sự tác động chi phối của môi trƣờng. Các vi sinh vật cần ở môi trƣờng tự nhiên hay môi trƣờng nhân tạo (nuôi cấy) những chất dinh dƣỡng để xây dựng lên các hợp chất của tế bào và các hợp chất dùng cho trao đổi chất và năng lƣợng. Đối với sự phát triển của vi sinh vật nói chung và các vi khuẩn Gluconacetobacter nói riêng, các điều kiện môi trƣờng cần cung cấp tƣơng đối đơn giản. Tuy nhiên cũng phải đảm bảo đầy đủ các nguồn dinh dƣỡng nhƣ nƣớc, nguồn năng lƣợng nhƣ cacbon, nitơ, gluxit, vitamin, các hợp chất khoáng và các nhân tố sinh trƣởng. Các yếu tố này không chỉ cung cấp năng lƣợng cho vi sinh vật mà còn là nguồn nguyên liệu cấu trúc nên các thành phần tế bào khi vi khuẩn sinh trƣởng và phát triển. Do đó các yếu tố này ảnh hƣởng trực tiếp đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Đối với vi khuẩnGluconacetobacter, tế bào nhỏ nên sự ảnh hƣởng của các yếu tố trên biểu hiện rõ rệt. Sự ảnh hƣởng của các yếu tố dinh dƣỡng không chỉ xảy ra khi nó bị thiếu hụt mà còn diễn ra khi ta cung cấp các yếu tố đó ở 28 các nồng độ khác nhau. Không phải ở bất kì nồng độ nào vi sinh vật cũng có thể sử dụng các chất dinh dƣỡng ta cung cấp và phát triển bình thƣờng mà mỗi loài vi khuẩn có một ngƣỡng nhất định với từng yếu tố dinh dƣỡng và từng điều kiện môi trƣờng sống. Các điều kiện này không đạt đến ngƣỡng hoặc vƣợt quá ngƣỡng thì sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn diễn ra không bình thƣờng thậm chí ngừng sinh trƣởng. Mặt khác lại có những nồng độ mà tại đó vi sinh vật sinh trƣởng và phát triển rất nhanh và mạnh. Với phƣơng pháp nghiên cứu chủ yếu là: giữ nguyên nồng độ các thành phần khác của môi trƣờng, chỉ thay đổi nồng độ KNO3, tôi tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trƣờng dịch thế MT3 (thay (NH4)2SO4bằng KNO3) ở 30oC. Hình 3.9. Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lƣợng KNO3 Sau 4 ngày nuôi cấy, kết quả đạt đƣợc biểu hiện ở bảng 3.1 và hình 3.10. 29 Hình 3.10. Sau 4 ngày lên men tạo màng BC trên MT3 có sự thay đổi hàm lƣợng KNO3 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ KNO3 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter STT Hàm lƣợng KNO3 (g/l) Đặc điểm của màng BC Khối lƣợng màng (g) 1 1 Không có sự hình thành màng 0 2 2 Không có sự hình thành màng 0 3 3 Không có sự hình thành màng 0 4 4 Không có sự hình thành màng 0 5 5 Không có sự hình thành màng 0 6 6 Không có sự hình thành màng 0 Nguồn nitơ ảnh hƣởng gián tiếp tới khả năng tạo màng thông qua ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn. Nitơ có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo của axit nucleic, photpholipit, một số coenzyme quan trọng nhƣ ATP, NADP, FDA và một số enzyme tham gia vào quá trình tạo thành Hemicellulose. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Do đó 30 khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter ngƣời ta thƣờng sử dụng nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơhữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men. Từ kết quả kiểm tra cho thấy nguồnnitơ vô cơ KNO3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triển phù hợp với nghiên cứu của tác giả Neelobon, Jiraporn và Suwanncee (2007). Nguồn nitơ vô cơ KNO3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triển. 3.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủngvi khuẩn Gluconacetobacter Yếu tố (NH4)2SO4 của Gluconacetobacter, là nhân tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển.Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trƣờng quá ít sẽ ảnh hƣởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hƣởng đến quá trình tạo màng BC. Ngƣợc lại, nếu hàm lƣợng nitơ quá nhiều, vi khuẩn không sử dụng hết, nó sẽ bị thối rữa gây ô nhiễm môi trƣờng [3]. Mặt khác, nitơ có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo của axit nucleic, photpholipit, một số coenzyme quan trọng nhƣ ATP, NADP, FDA và một số enzyme tham gia vào quá trình hình thành màng BC. Để tìm ra nồng độ (NH4)2SO4tốt nhất cho sự hình thành màng BC, tôi quyết định nuôi cấy chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng dịch thể(MT3) ở 30oC với sự thay đổi hàm lƣợng của (NH4)2SO4 từ 0g/l đến 6g/l. Hình 3.11. Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lượng (NH4)2SO4 31 Sau 4 ngày nuôi cấy, kết quả dẫn ra ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.1. Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter STT Hàm lƣợng Đặc điểm của màng BC (NH4)2SO4 (g/l) Khối lƣợng màng (g) 1 0 Màng mỏng, dễ rách 1.99 2 1 Màng mỏng, dễ rách 3.15 3 2 Màng mỏng, dai, mềm 5,92 4 3 Màng dày, dai, trong 7.64 5 4 Màng mỏng, dai, 5.68 6 5 Màng mỏng, dai, mềm 4.47 7 6 Màng mỏng, dễ rách 2.30 9.000 7.640 8.000 Khối lượng màng (g) 7.000 5.920 6.000 5.680 5.000 4.470 4.000 3.150 3.000 2.000 2.300 1.990 1.000 .000 .00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 Hàm lượng (g/l) Biểu đồ 3.1. Biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter 32 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng Từ bảng 3.1, biểu đồ 3.1 và hình 3.12 ta thấy rằng (NH4)2SO4 ở hàm lƣợng 3/l vi khuẩn sẽ tạo ra màng BC dày nhất. Có thể giải thích kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Kết quả kiểm tra cho thấy, ở hàm lƣợng 3g/l môi trƣờng cho hiệu suất màng BC cao nhất. Hàm lƣợng (NH4)2SO4 trên 3g/l có thể là quá cao đối với nhu cầu của tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter, do đó không thể hấp thụ hết lƣợng sulphate amone làm tăng pH dẫn đến ức chế sự sinh trƣởng và tổng hợp màng BC của vi khuẩn. Vì vậy, lƣợng BC tạo ra thấp hơn so với môi trƣờng có hàm lƣợng (NH4)2SO4 3g/l. Còn hàm lƣợng (NH4)2SO4 dƣới 3g/l có thể là thấp hơn so với yêu cầu phát triển của vi khuẩn, nên lƣợng BC tạo ra thấp hơn. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Schramm và Hestrin (1954) và tác giả Nguyễn Trung Kiên (2013), tôi quyết định sử dụng nguồn (NH4)2SO4 với hàm lƣợng 3g/l để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4 phù hợp cho quá trình lên men tạo màng BC của chủng Gluconacetobacterlà 3 (g/l). 33 3.4. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng dinh dƣỡng từ nƣớc gạo Nƣớc gạo có lƣợng dinh dƣỡng rất cao với lƣợng chất béo chƣa bão hoà, vitamin nhóm E, nhóm B, kẽm, canxi, kali đều rất cao, ngoài ra trong cám gạo còn có chứa chất béo omega 3 khá cao. Khoảng 65% chất dinh dƣỡng của gạo tập trung ở cám, thành thần của cám có nhiều lọai vitamin và chất béo tốt, lại cân đối và có nhiều xơ dễ tiêu có thể xem là rất tốt cho vi khuẩn phát triển. Khối lƣợng/100g Thành phần - Calori 316 KJ - Lipit 21g - Chất béo bão hòa 4.2 g - Chất xơ tiêu hóa đƣợc 21g - Carbohydrat 28 g - Đƣờng 0,9 g - Protein 13,3 g - Vitamin E 4,9 mg - Vitamin B6 4,1 mg - Canxi 57 mg Theo: www.Nutritiondata.com Tôi tiến hành lên men tạo màng từ chủng Gluconacetobactertrên môi trƣờng dịch thể (MT3) ở 30oC với môi trƣờng dinh dƣỡng nƣớc gạo thay thế nƣớc dừa. Kết quả thí nghiệm đƣợc dẫn ra trên hình 3.13 và bảng 3.3 34 Bảng 3.3. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng nƣớc dừa và môi trƣờng nƣớc gạo Đặc điểm màng BC Môi trƣờng nƣớc dừa Môi trƣờng nƣớc gạo Màu sắc, cảm quan Màng mỏng, nhẵn, màu Màng mỏng, nhẵn, màu trong đục 7.64g 5.91g Khối lƣợng màng tƣơi thu đƣợc Hình 3.13. Khối lƣợng màng BC thu đƣợc trên môi trƣờng nƣớc dừa và môi trƣờng nƣớc gạo Nhận xét:môi trƣờng nƣớc gạocó khả năng tạo màng tốt,tƣơng đƣơng với môi trƣờng nƣớc dừa. Thu màng ở ngày thứ 4,không có sự chênh lệch lớn về khối lƣợng, màng mỏng, dai, nhẵn.Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Trung Kiên (2013). Nhƣ vậy môi trƣờng nƣớc gạo có thể thay thế môi trƣờng nƣớc dừa khi lên men tạo màng BC từ chủngGluconacetobacter. 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Kiểm tra một một số đặc tính sinh học và lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacterthu màngổn định ở ngày thứ 4. 1.2. Nguồn nitơ KNO3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triển. 1.3. Xác định đƣợc nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4 phù hợp cho quá trình lên men tạo màng BC của chủng Gluconacetobacterlà 3 (g/l). 1.4. Đã xác định đƣợc khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng nƣớc gạo. 2. Đề nghị Trên đây là những kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn nitơ vô cơ đến khả năng hình thành màng của chủng Gluconacetobacter.Để sản phẩm hoàn thiện hơn và ứng dụng vào thực tiễn cần phải tiếp tục nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất dinh dƣỡng khác tới khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. [2] Đặng Hùng Thắng (1999), Thống kê và ứng dụng, Nxb Giáo dục, tr. 214-267. [3] Đặng Thị Hồng (2007), Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học, Luận văn thạc sĩ sinh học trƣờng ĐHSP Hà Nội. [4] Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng lên men acetic theo phương pháp chìm,Luận án PTS khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội [5] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Hoàng Thị Thảo (2011), "Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum sinh tổng hợp màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng", Tạp chí Y học thảm họa và bỏng, ISSN 1859-3461 Số 2, tr. 122-127. [6] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng. Số 361, Tạp chí dƣợc học. [7] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr. 149-150 [8] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vƣơng Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, Nxb Giáo dục, tr. 17-34, 63-74, 89-92. [9] Nguyễn Thị Nguyệt (2008), Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Luận văn thạc sĩ sinh họctrƣờng ĐHSP Hà Nội. [10] Nguyễn Thị Thùy Vân (2009), Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả 37 năng tạo màng Bacterialcellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam, Luận văn thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội. [11] Nguyễn Thúy Hƣơng (2008), "Ảnh hƣởng củanguồn cơ chất và kiểu lên men đến năng suất và chất lƣợng cellulose vi khuẩn", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, số 24, trang 205-210. [12] Trần Linh Thƣớc (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật, Nxb Giáo dục, 2006, tr. 1-29, 40-69. [13] Trƣơng Thị Ngọc Hoa, Trƣơng Nguyễn Quỳnh Hƣơng (2007), Đa dạng hóa các môi trường sản xuất Natadecoco từ vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học, Luận văn thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội. [14] Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 1-50. B.TÀI LIỆU TIẾNG ANH [15] Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005). Polysaccharides and polyamides in the food industry, www.wiley.vch. pp. 31-85. [16] Alina Krystynowicz, Marianna Turkiewicz, Stanislaw Bielecki, Emilia Klemenska, Aleksander Masny, Andrzej Plucienniczak (2005). "Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum”, Acta biochimica polonica, Vol. 52, pp. 691-698. [17] Barbara Surma - S'lusarska, Sebastion, Presler, Dariusz Danielewicz (2008), "Characteristics of Bacterial Cellulose Obtained from Actobacter xylinum culture for applycation in papermarking", FIBRES TEXTILES in Eastem Europe, vol. 16, No. 4, pp. 108-111. 38 [...]... ngày tiến hành thu màng BC Chuẩn bị hộp cồn 90o để ngâm bảo quản màng Dùng găng tay cao su vớt màng trong các hộp lên men Tiến hành cân và kiểm tra đặc tính của từng màng nhƣ cân nặng, độ dày, độ dai 27 Hình 3.8 Màng BC từ chủng Gluconacetobacter Đã lên men tạo màng BC thành công từ chủng Gluconacetobacter 3.2 Ảnh hƣởng của KNO3 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Trong... cứu quá trình sinh axit acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC [4]; gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm nên và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn Năm 2000, nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hƣơng, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hƣng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện lên men cho vi khuẩn Gluconacetobacter ứng dụng vào làm... Gluconacetobacter tạo ra bao xung quanh môi trƣờng hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trƣờng, điều này ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khác, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter Màng cellulose có khả năng giữ nƣớc nên nên giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất dinh dƣỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại ảnh hƣởng của tia UV (tia tử... xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng + chứa CaCO3 6 7 -Kiểm tra khả năng sinh -Không hình thành sắc tố nâu sắc tố nâu -Kiểm tra khả năng tổng -Váng vi khuẩn xuất hiện màu hợp cellulose xanh lam 5 - + 1.2 Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 1.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon Để vi khuẩn sinh trƣởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn... nghiên cứu chế tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy điện tử chất lƣợng cao từ màng vi khuẩn (Jay shah, Brown M R., 2005); nghiên cứu của Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) về con đƣờng hình thành cellulose ở vi khuẩn, cấu trúc sợi cellulose và đặc tính của màng cellulose, mối quan hệ giữa khả năng hình thành cellulose và khả năng sinh axit... cellulose của màng BC Hình 1.3 Sợi cellulose của thực vật 1.3.2 Một số tính chất của màng Bacterial cellulocse Brown A J (1886), đã nghiên cứu các lớp màng đặc đo vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra trên môi nuôi cấy và thấy có bản chất là hemicellulose Hemicellulose là những polysaccarid không tan trong nƣớc nhƣng tan trong dng dịch kiềm tính Một số tính chất của màng BC: độ tinh sạch: màng BC có độ... tâm tới quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc của màng Về ứng dụng thực tiễn, mới chỉ đƣợc ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng và đƣợc ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [3], [5], [6], [9], [10] Hiện nay vi c nghiên cứu tìm môi trƣờng tối ƣu cho quá trình tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter chƣa đƣợc thực hiện Hầu nhƣ có rất ít các nghiên cứu liên quan đến sự hình thành BC. .. phân giải CaCO3 3.1.5 Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Dựa theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, TS Dƣơng Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter đƣợc tiến hành theo 4 bƣớc cơ bản sau: 25 Bƣớc 1: Nhân giống ↓ Bƣớc 2: Hoạt hóa giống ↓ Bƣớc 3: Lên màng ↓ Bƣớc 4: Thu màng Cụ thể nhƣ sau: Bước 1: Nhân... sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ màng BC vào các lĩnh vực khác nhau Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter và những ứng dụng của nó đã đƣợc hành ở nhiều nƣớc trên thế giới Tác giả Brown, 1999, dùng màng BC làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng tế bào Brown, Jonas và Farad, dùng màng nhƣ một chất để biến đổi độ nhớt,... phân tử của chủng Gluconacetobacter dại (có khả năng tổng hợp cellulose) và chủng đột biến (không có khả năng tổng hợp cellulose) [16]; năm 2006 đã có các nghiên cứu về cấu trúc của màng BC sử dụng làm monocomposit; Czafa, W Young; Elvie Escoro Brown đã nghiên cứu và đi đến kết luận có sự tƣơng đồng vầ cấu trúc giữa màng BC với colagen Năm 2007, Neelobon và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của điều