6. Điểm mới của đề tài
2.2.4. Phương pháp toán học
Chúng tôi xử lí các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp trong cuốn "Ứng dụng tin học trong sinh học" [1], và "Thống kê và ứng dụng" [2] nhƣ:
Số trung bình công: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm:
̅ ∑
Trung bình bình phƣơng các sai lệch:
√∑ ̅
Sai số đại diện của trung bình cộng:
M = √ Hệ số biến thiên: Cv ̅ Trong đó: n: Số lần nhắc lại. Xi: Giá trị của lần thứ i S: Độ lệch chuẩn m: Sai số trung bình học 2.2.5. Quá trình xử lí màng BC từ chủngGluconacetobacter
Do màng BC khi đƣợc tạo thành còn khá nhiều thành phần dƣ của môi trƣờng bám vào nên mục đích của quá trình xử lí màng là loại bớt các sản phẩm dƣ thừa (thành phần chính là đƣờng dƣ), giảm độ pH, làm sạch khuẩn đồng thời phần nào giúp màng đạt đƣợc hiệu quả về mặt cảm quan: màu trắng trong, dai và bền hơn... Song màng BC chúng tôi nghên cứu chủ yếu đƣợc ứng dụng sản xuất ở qui mô công nghiệp, vì vậy các bƣớc xử lí màng phải đơn giản, hiệu quả và ít tốn kém.
Màng BC thu trực tiếp từ dịch nuôi cấy đƣợc qua các bƣớc xử lí sau:
Bảng 2.1. Các bƣớc xử lí màng BC
1 -Rửa sạch màng bằng nƣớc máy nhiều lần
-Loại bỏ bớt acid acetic và các thành phần dƣ thừa từ môi trƣờng, màng có màu vàng, mùi hơi chua.
2 -Ngâm màng BC trong dung dịch muối NaCl 0,7M, ở 25 - 40oC trong 12 giờ
-Rửa nƣớc và đun sôi 3 lần.
-Làm chết và làm sạch vi khuẩn
-Loại bớt muối và chất dƣ thừa
3 -Cho màng BC vào dung dịch NaOH 0,5M (400g màng BC/1 lít), ở 30 - 40oc cho đến khi màng chuyển sang màu trắng trong (20 phút)
-Rửa sạch bằng nƣớc máy nhiều lần
- Loại bỏ chất dƣ thừa, làm trắng màng, kiềm hóa bề mặt sợi cellulose. Màng có màu trắng trong, mùi khét, giảm độ cứng và dai
-Giảm bớt nồng độ kiềm (pH: 8,3)
4 -Trung hòa bằng acid citric loãng và kiểm tra bằng máy đo pH. Rửa sạch để muối Natri acetat
-Ngâm cồn 70o, kiểm tra nếu còn kiềm tiếp tục trung hòa bằng acid acetic -Rửa nƣớc và đun sôi màng 3 lần, mỗi lần đun sôi từ 2 - 3 phút
-Màng có màu trắng đục, có mùi kiềm
-Kiềm còn dƣ và chất dƣ thừa sẽ tan trong cồn, sau khi trung hòa pH: 7
-Loại bỏ muối Natri acetat, các chất dƣ thừa. Màng trắng hơi đục, không mùi
Sau khi xử lí màng BC, chúng tôi tạo màng có kích thƣớc 10x10 cm, sau đó sấy màng ở nhiệt độ 45o
C trong khoảng 6 giờ để làm thoát bớt hơi nƣớc có trên màng. Nhìn chung, thời gian để sấy màng phụ thuộc nhiều vào độ dày của màng, nếu sấy màng ở nhiệt độ quá cao màng sẽ bị giòn, giảm tính dẻo dai.
Quy trình bảo quản nhƣ sau:
+ Sấy màng ở độ ẩm khoảng 30%.
+ Đóng gói chế phẩm màng trong các túi nilon nhờ máy hút chân không. + Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC, trong 15 phút.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter
3.1.1. Quan sát hình hình thái tế bào của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
Chủng Gluconacetobacter nhận từ phòng Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học Labomed (Mỹ) với độ phóng đại 1000 lần, nhận thấy vi khuẩnGluconacetobacter là trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong,kích thƣớc khoảng 2µm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào đƣợc bao bọc bởi màng nhày có bản chất là hemicellulose,bắt màu hồng khi nhuộm fucshin.
Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của Gluconacetobacter 3.1.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Trên môi trƣờng thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc nhƣ hình 3.2
Hình 3.2.Gluconacetobacter trên môi trƣờng thạch đĩa
Khi quan sát trên hình 3.2 thấy khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thƣớc lớn (đƣờng kính khuẩn lạc đạt 2 - 5 mm), tròn, bề mặt nhày và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.
3.1.3 Sinh trưởng trên môi trường dịch lỏng
Vi khuẩn Gluconacetobacter nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng hình thành một lớp màng trên môi trƣờng nuôi cấy (hình 3.3)
Hình 3.3.Gluconacetobacter trong môi trƣờng dịch lỏng
3.1.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Gluconacetobacter
3.1.4.1. Hoạt tính catalase
Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tƣợng sủi bọt khí (hình 3.4). Chứng tỏ oxy đƣợc giải phóng ra, hay dƣới tác dụng của enzzym catalase phân giải H2O2 theo phƣơng trình:
H2O2→H2O +
2 1
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
3.1.4.2. Khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic
Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng có chứa CaCO3 điều đó cho thấy acid gluconic đã đƣợc tạo thành (Hình 3.5). Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trƣờng từ màu trắng sang không màu.
H+ + CaCO3 → Ca2+ + H2O + CO2
Hình 3.5. Vòng phân giải CaCO3
3.1.5. Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Gluconacetobacter
Dựa theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, TS. Dƣơng Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng
Gluconacetobacter đƣợc tiến hành theo 4 bƣớc cơ bản sau: Vòng phân giải
Bƣớc 1: Nhân giống ↓
Bƣớc 2: Hoạt hóa giống ↓
Bƣớc 3: Lên màng ↓
Bƣớc 4: Thu màng Cụ thể nhƣ sau:
Bước 1: Nhân giống
Quá trình nhân giống đƣợc tiến hành cấy truyền liên tục chủng
Gluconacetobacter trên môi trƣờng thạch nghiêng.
Hình ảnh vi khuẩn Gluconacetobacter đƣợc cấy truyền trên thạch nghiêng đƣợc thể hiện trong hình 3.6
Hình 3.6.Vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trƣờng thạch nghiêng
Chủng Gluconacetobacter khi nuôi cấy trên thạch nghiêng có màu trắng đục, bề mặt nhẵn, bóng, có tính dai và nhớt.
Bước 2: Hoạt hóa
Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối vi khuẩn từ các ống giống
Gluconacetobacter nuôi trong các bình chứa nhân giống cấp 1 theo tỉ lệ 3 ống giống/250ml dịch.
Sau đó tiến hành lắc các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 trong khoảng 1-1,5 ngày để thu sinh khối Gluconacetobacter.
Các bình chứa nhân giống cấp 1 đƣợc thể hiện trong hình 3.7
Hình 3.7.Vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trƣờng nhân giống cấp 1
Sau 1-1,5 ngày nuôi lắc, các bình giống Gluconacetobacter có màu trắng đục, có hệ sợi lơ lửng trong dung dịch, đó là các sợi cellulose mà vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trƣởng.
Bước 3: Tạo màng
Dùng micropipet cấy dịch nhân giống cấp 1 vào môi trƣờng lên men theo tỉ lệ 10ml/100ml môi trƣờng.
Tiến hành lên men tĩnh 4 ngày
Các hộp lên men sau 4 ngày xuất hiện 1 lớp màng màu trắng đục trên bề mặt dịch lên men. Lớp màng này có thể dày hay mỏng khác nhau ở các hộp khác nhau.
Bước 4: Thu màng Thu màng ở ngày thứ 4
Sau 4 ngày tiến hành thu màng BC. Chuẩn bị hộp cồn 90o để ngâm bảo quản màng. Dùng găng tay cao su vớt màng trong các hộp lên men. Tiến hành cân và kiểm tra đặc tính của từng màng nhƣ cân nặng, độ dày, độ dai.
Hình 3.8. Màng BC từ chủng Gluconacetobacter
Đã lên men tạo màng BC thành công từ chủng Gluconacetobacter
3.2. Ảnh hƣởng của KNO3 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
Trong quá trình phát triển tiến hóa, các vi sinh vật có quan hệ mật thiết với các yếu tố của điều kiện sống. Mọi hoạt động sống của vi sinh vật đều phụ thuộc vào sự tác động chi phối của môi trƣờng. Các vi sinh vật cần ở môi trƣờng tự nhiên hay môi trƣờng nhân tạo (nuôi cấy) những chất dinh dƣỡng để xây dựng lên các hợp chất của tế bào và các hợp chất dùng cho trao đổi chất và năng lƣợng. Đối với sự phát triển của vi sinh vật nói chung và các vi khuẩn Gluconacetobacter nói riêng, các điều kiện môi trƣờng cần cung cấp tƣơng đối đơn giản. Tuy nhiên cũng phải đảm bảo đầy đủ các nguồn dinh dƣỡng nhƣ nƣớc, nguồn năng lƣợng nhƣ cacbon, nitơ, gluxit, vitamin, các hợp chất khoáng và các nhân tố sinh trƣởng. Các yếu tố này không chỉ cung cấp năng lƣợng cho vi sinh vật mà còn là nguồn nguyên liệu cấu trúc nên các thành phần tế bào khi vi khuẩn sinh trƣởng và phát triển. Do đó các yếu tố này ảnh hƣởng trực tiếp đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Đối với vi khuẩnGluconacetobacter, tế bào nhỏ nên sự ảnh hƣởng của các yếu tố trên biểu hiện rõ rệt. Sự ảnh hƣởng của các yếu tố dinh dƣỡng không chỉ xảy ra khi nó bị thiếu hụt mà còn diễn ra khi ta cung cấp các yếu tố đó ở
các nồng độ khác nhau. Không phải ở bất kì nồng độ nào vi sinh vật cũng có thể sử dụng các chất dinh dƣỡng ta cung cấp và phát triển bình thƣờng mà mỗi loài vi khuẩn có một ngƣỡng nhất định với từng yếu tố dinh dƣỡng và từng điều kiện môi trƣờng sống. Các điều kiện này không đạt đến ngƣỡng hoặc vƣợt quá ngƣỡng thì sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn diễn ra không bình thƣờng thậm chí ngừng sinh trƣởng. Mặt khác lại có những nồng độ mà tại đó vi sinh vật sinh trƣởng và phát triển rất nhanh và mạnh.
Với phƣơng pháp nghiên cứu chủ yếu là: giữ nguyên nồng độ các thành phần khác của môi trƣờng, chỉ thay đổi nồng độ KNO3, tôi tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trƣờng dịch thế MT3 (thay (NH4)2SO4bằng KNO3) ở 30oC.
Hình 3.9. Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lƣợng KNO3
Sau 4 ngày nuôi cấy, kết quả đạt đƣợc biểu hiện ở bảng 3.1 và hình 3.10.
Hình 3.10. Sau 4 ngày lên men tạo màng BC trên MT3 có sự thay đổi hàm lƣợng KNO3
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ KNO3 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter
STT Hàm lƣợng
KNO3 (g/l) Đặc điểm của màng BC Khối lƣợng màng (g) 1 1 Không có sự hình thành màng 0 2 2 Không có sự hình thành màng 0 3 3 Không có sự hình thành màng 0 4 4 Không có sự hình thành màng 0 5 5 Không có sự hình thành màng 0 6 6 Không có sự hình thành màng 0
Nguồn nitơ ảnh hƣởng gián tiếp tới khả năng tạo màng thông qua ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn. Nitơ có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo của axit nucleic, photpholipit, một số coenzyme quan trọng nhƣ ATP, NADP, FDA và một số enzyme tham gia vào quá trình tạo thành Hemicellulose.
Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Do đó
khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter ngƣời ta thƣờng sử dụng nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơhữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men. Từ kết quả kiểm tra cho thấy nguồnnitơ vô cơ KNO3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triển phù hợp với nghiên cứu của tác giả Neelobon, Jiraporn và Suwanncee (2007).
Nguồn nitơ vô cơ KNO3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triển.
3.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủngvi khuẩn Gluconacetobacter
Yếu tố (NH4)2SO4 của Gluconacetobacter, là nhân tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển.Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trƣờng quá ít sẽ ảnh hƣởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hƣởng đến quá trình tạo màng BC. Ngƣợc lại, nếu hàm lƣợng nitơ quá nhiều, vi khuẩn không sử dụng hết, nó sẽ bị thối rữa gây ô nhiễm môi trƣờng [3]. Mặt khác, nitơ có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo của axit nucleic, photpholipit, một số coenzyme quan trọng nhƣ ATP, NADP, FDA và một số enzyme tham gia vào quá trình hình thành màng BC. Để tìm ra nồng độ (NH4)2SO4tốt nhất cho sự hình thành màng BC, tôi quyết định nuôi cấy chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng dịch thể(MT3) ở 30o
C với sự thay đổi hàm lƣợng của (NH4)2SO4
từ 0g/l đến 6g/l.
Hình 3.11. Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lượng
Sau 4 ngày nuôi cấy, kết quả dẫn ra ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.1.
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter
STT Hàm lƣợng
(NH4)2SO4 (g/l) Đặc điểm của màng BC Khối lƣợng màng (g)
1 0 Màng mỏng, dễ rách 1.99
2 1 Màng mỏng, dễ rách 3.15
3 2 Màng mỏng, dai, mềm 5,92
4 3 Màng dày, dai, trong 7.64
5 4 Màng mỏng, dai, 5.68
6 5 Màng mỏng, dai, mềm 4.47
7 6 Màng mỏng, dễ rách 2.30
Biểu đồ 3.1. Biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter 1.990 3.150 5.920 7.640 5.680 4.470 2.300 .000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 9.000 .00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 Kh ố i lư ợ n g m àn g (g) Hàm lượng (g/l)
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng
Từ bảng 3.1, biểu đồ 3.1 và hình 3.12 ta thấy rằng (NH4)2SO4 ở hàm lƣợng 3/l vi khuẩn sẽ tạo ra màng BC dày nhất. Có thể giải thích kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Kết quả kiểm tra cho thấy, ở hàm lƣợng 3g/l môi trƣờng cho hiệu suất màng BC cao nhất. Hàm lƣợng (NH4)2SO4 trên 3g/l có thể là quá cao đối với nhu cầu của tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter, do đó không thể hấp thụ hết lƣợng sulphate amone làm tăng pH dẫn đến ức chế sự sinh trƣởng và tổng hợp màng BC của vi khuẩn. Vì vậy, lƣợng BC tạo ra thấp hơn so với môi trƣờng có hàm lƣợng (NH4)2SO4 3g/l. Còn hàm lƣợng (NH4)2SO4 dƣới 3g/l có thể là thấp hơn so với yêu cầu phát triển của vi khuẩn, nên lƣợng BC tạo ra thấp hơn. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Schramm và Hestrin (1954) và tác giả Nguyễn Trung Kiên (2013), tôi quyết định sử dụng nguồn (NH4)2SO4 với hàm lƣợng 3g/l để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4 phù hợp cho quá trình lên men tạo màng BC của chủng Gluconacetobacterlà 3 (g/l).
3.4. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng dinh dƣỡng từ nƣớc gạo
Nƣớc gạo có lƣợng dinh dƣỡng rất cao với lƣợng chất béo chƣa bão hoà, vitamin nhóm E, nhóm B, kẽm, canxi, kali đều rất cao, ngoài ra trong cám gạo còn có chứa chất béo omega 3 khá cao. Khoảng 65% chất dinh dƣỡng của gạo tập trung ở cám, thành thần của cám có nhiều lọai vitamin và chất béo tốt, lại cân đối và có nhiều xơ dễ tiêu có thể xem là rất tốt cho vi khuẩn phát triển.
Thành phần Khối lƣợng/100g
- Calori 316 KJ
- Lipit 21g
- Chất béo bão hòa 4.2 g - Chất xơ tiêu hóa đƣợc 21g
- Carbohydrat 28 g - Đƣờng 0,9 g - Protein 13,3 g - Vitamin E 4,9 mg - Vitamin B6 4,1 mg - Canxi 57 mg Theo: www.Nutritiondata.com
Tôi tiến hành lên men tạo màng từ chủng Gluconacetobactertrên môi trƣờng dịch thể (MT3) ở 30o
C với môi trƣờng dinh dƣỡng nƣớc gạo thay thế nƣớc dừa.
Bảng 3.3. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trƣờng nƣớc dừa và môi trƣờng nƣớc gạo
Đặc điểm màng BC Môi trƣờng nƣớc dừa Môi trƣờng nƣớc gạo Màu sắc, cảm quan Màng mỏng, nhẵn, màu
trong
Màng mỏng, nhẵn, màu đục
Khối lƣợng màng
tƣơi thu đƣợc 7.64g 5.91g
Hình 3.13. Khối lƣợng màng BC thu đƣợc trên môi trƣờng nƣớc dừa và môi trƣờng nƣớc gạo
Nhận xét:môi trƣờng nƣớc gạocó khả năng tạo màng tốt,tƣơng đƣơng với môi trƣờng nƣớc dừa. Thu màng ở ngày thứ 4,không có sự chênh lệch lớn về khối lƣợng, màng mỏng, dai, nhẵn.Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Trung Kiên (2013). Nhƣ vậy môi trƣờng nƣớc gạo có thể thay thế môi trƣờng nƣớc dừa khi lên men tạo màng BC từ chủngGluconacetobacter.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Kiểm tra một một số đặc tính sinh học và lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacterthu màngổn định ở ngày thứ 4.
1.2. Nguồn nitơ KNO3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter
phát triển.
1.3. Xác định đƣợc nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4 phù hợp cho quá trình