Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo

Căn cứ vào độ rượu, hàm lượng đường, hàm lượng axit…có trong vang mà phân thành các loại vang: vang khô, vang dịu, vang ngọt… Xu hướng chung thì vang được phân thành 2 nhóm chính là va

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA

MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ HÀM LƯỢNG MEN GIỐNG CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN

VANG TÁO MÈO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô trong khoa Sinh

- KTNN đã tạo điều kiện cho em học tập và nghiên cứu trong thời gian qua

Xin chân thành c¶m ơn các bạn sinh viên đã giúp đỡ tôi để khoá luận hoàn thành một cách tốt đẹp

Xin chân thành cảm ơn!

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ……….……….5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU………7

1.1.Khái quát chung về rượu vang ……… 7

1.2 Một số đặc tính sinh học của tế bào nấm men Saccharomyces serevisiae 8

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 18

2.1.Nguyên liệu, thiết bị và hoá chất………18

2.2.Phương pháp nghiên cứu ……….………19

2.3.Phạm vi nghiên cứu ………23

2.4 Địa điểm thực hiện đề tài ……….…23

2.5.Thời gian thực hiện đề tài ………23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………24

3.1.Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men lên men vang táo mèo ……… 24

3.2.Ảnh hưởng của một số nhân tố trong quá trình nhân giống……… 33

3.3.Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo ……… 38

3.4.Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ……… 42

3.5.Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm ……… 44

3.6.Quy trình công nghệ lên men vang táo mèo ……….…45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO………48

Danh mục chữ viết tắt, bảng, đồ thị, biểu đồ , hình vẽ

Bảng 1.1 Thành phần hoá học của các loại quả

Bảng 3.1.2.1.a Khả năng sinh trưởng và phát triển của 4 chủng nấm men

Bảng 3.1.2.1.b Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao

Bảng 3.1.2.1.c Thử hoạt lực lên men của bốn chủng nấm men

Bảng3.1.2.1.d Khả năng kết lắng của bốn chủng nấm men

Bảng 3.1.2.1.e Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm của

4 chủng nấm men

Bảng 3.1.2.1.g Tổng hợp kết quả tuyển chọn chủng nấm men

Bảng 3.1.3.2.a Khả năng lên men các loại đường của chủng TM4

Bảng 3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng K2S2O5 trong quá trình nhân giống

Bảng 3.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng cao men bổ sung trong quá trình nhân

giống

Bảng 3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình nhân giống

Bảng 3.2.5.Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hoà tan trong

quá trình nhân giống

Bảng 3.3.1 Động thái lên men vang trong ngày thứ nhất

Bảng 3.4.2 Ảnh hưởng của độ pH đến quá trình lên men vang táo mèo

Bảng 3.4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống tới quá trình lên men vang táo mèo

Bảng 3.5 Kết quả phân tích rượu thành phẩm

Biểu đồ 3.1 Tốc độ sinh sản trung bình của bốn chủng nấm men

Biểu đồ 3.2.4 Số lượng tế bào trung bình sau 28 giờ nuôi cấy ở các giá trị

pH khác nhau

Đồ thị 3.3.1 Tốc độ phát triển của S.cerevisiae TM4 trong ngày

Đồ thị 3.3.2 Động thái của quá trình lên men vang táo mèo

4 Danh mục các hình ảnh

Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng TM4

Hình 3.2 Chủng nấm men Hình 3.3 Ảnh chụp gel sau điện di soi trên tia uv

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Lý do chọn đề tài

Vang là loại đồ uống có độ cồn nhẹ lên men trực tiếp từ dịch trái cây mà không phải trải qua quá trình chưng cất Rượu vang có hàm lượng cồn thấp, nhiều vitamin và các chất khoáng có mùi thơm dễ chịu, có hương vị đặc trưng của từng loại quả Rượu vang kích thích tiêu hoá, tuần hoàn, thần kinh

Người ta đã biết làm rượu vang từ 3000 năm trước công nguyên Hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 18 tỷ lít rượu vang trong đó có 1/3 của Pháp và Angeri

Ở Việt Nam ngành sản xuất vang mới thực sự bắt đầu từ những năm 80 của thế kỉ 20 với sự xuất hiện vang mang nhãn hiệu (Thăng Long, Thanh Ba, Gia Lâm…) Nguồn nguyên liệu để sản xuất vang tại Việt Nam chủ yếu là từ các loại quả: nho, dâu, táo, lê, dứa, vải…[7]

Thực tế cho thấy phần lớn các loại quả có chứa đường, axit, vitamin, khoáng…và không có độc hại thì đều có thể sử dụng để lên men vang, nhưng để

có vang tốt thì không phải loại quả nào cũng làm được Do đó việc lựa chọn nguyên liệu phù hợp với yêu cầu của công nghệ và chất lượng của sản phẩm cho đến nay vẫn là vấn đề cấp thiết đối với ngành sản xuất vang ở nước ta Mặt khác cũng rất cần phải có quy trình công nghệ hoàn thiện để có thể sản xuất loại vang thực sự có chất lượng cao, từng bước hội nhập vào thị trường khu vực và quốc tế Nguyên liệu mà chúng tôi lựa chọn và nghiên cứu cho lên men rượu vang là

quả táo mèo (Docynia indica) Đây là loại quả có hương vị thơm rất đặc trưng

được trồng nhiều ở các tỉnh miền núi phía bắc nước ta với tổng diện tích 40.000

ha Nơi có diện tích trồng cây táo mèo nhiều là các tỉnh Yên Bái, Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La Tổng diện tích trồng cây táo mèo vẫn tiếp tục tăng trong những năm gần đây [6]

Nhu cầu tiêu dùng đối với quả táo mèo chủ yếu là ăn trực tiếp, ngâm rượu, ngâm dịch siro nhưng cũng chỉ chiếm khoảng 35-40% tổng sản lượng quả thu hoạch, số còn lại thường chưa được sử dụng hết do nhiều nguyên nhân Trong

khi đú ngành sản xuất vang của nước ta đang phỏt triển với tốc độ nhanh và đang thiếu nguyờn liệu cú chất lượng phự hợp để sản xuất rượu vang cú chất

lượng cao giỏ thành hạ Chớnh vỡ vậy chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu: “Nghiờn

cứu ảnh hưởng của mụi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quỏ trỡnh lờn men vang tỏo mốo”

2 Mục tiờu của đề tài

1 Phõn lập, tuyển chọn chủng nấm men phự hợp cho lờn men vang tỏo mốo, tiến hành định loại chủng nấm men này bằng phương phỏp phõn tử

2 Nghiờn cứu một số đặc tớnh sinh học của chủng nấm men đó tuyển chọn

3 Lờn men vang tỏo mốo với quy mụ phũng thớ nghiệm, xõy dựng quy trỡnh lờn men vang tỏo mốo

3 Đối tượng nghiờn cứu

- Quả tỏo mốo (Docynia indica)

- Chủng nấm men cú khả năng lờn men vang tỏo mốo

4 í nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài

- Nghiờn cứu đặc tớnh, sinh lý, sinh hoỏ của chủng nấm men cú khả năng lờn men vang tỏo mốo Kết quả nghiờn cứu này là dữ liệu gúp phần bổ sung cho cỏc nghiờn cứu về nấm men và ứng dụng của nấm men trong đời sống

- Tận dụng nguồn nguyờn liệu sẵn cú của địa phương nhằm sản xuất một loại vang phự hợp thị hiếu của người tiờu dựng, gúp phần làm phong phỳ thị trường vang trong nước và nõng cao thu nhập cho đồng bào dõn tộc vựng cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ RƯỢU VANG

1.1.1 Thành phần của rượu vang

Thành phần chủ yếu của rượu vang bao gồm:

1 Cồn(etanol): do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn aldehit, este Độ cồn của rượu vang từ 10-12o, nên nhiều người uống được

2 Chất bổ dưỡng: đường là nguyên liệu để tạo nên các loại rượu trong quá trình lên men vang Trong dịch quả chín chủ yếu là các loại đường khử: fructoza, glucoza, và một ít galactoza ngoài ra còn có cả đường kép: sacaroza…đường trong vang từ 62-132g/l

3 Axit vô cơ và axit hữu cơ: axit malic, axit tartaric, axit citric, axit oxalic Hàm lượng axit tổng số từ 4-7g/l ( quy ra axit tartaric)

4 Rượu vang giàu vitamin: vitamin có trong nước quả không bị quá trình lên men phân huỷ mà nó chỉ điều chỉnh lại thành phần[ 3]

5 Các axit amin: các axit amin có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản và phát triển của nấm men Ngoài lượng axit amin có sẵn trong dịch quả, quá trình lên men vang cũng tạo thêm được một số axit amin đã làm cho vang thành phẩm có hương, vị rất đặc trưng Các axit amin như: Lizin, treonin, valin, acginin…[ 10]

1.1.2 Phân loại vang

Có nhiều cách phân loại khác nhau, có thể căn cứ vào màu sắc của sản phẩm

mà phân thành các loại: vang đỏ, vang hồng, vang trắng, và tương ứng với các loại vang này đều có các chỉ tiêu giới hạn về màu sắc nhất định Chẳng hạn vang

đỏ là loại vang có màu đỏ, đỏ lựu, đỏ thắm, vang trắng là vang có màu vàng rơm đến vàng ánh, vang hồng có màu hồng đến đỏ tươi

Căn cứ vào độ rượu, hàm lượng đường, hàm lượng axit…có trong vang mà phân thành các loại vang: vang khô, vang dịu, vang ngọt…

Xu hướng chung thì vang được phân thành 2 nhóm chính là vang không có gas (trong vang thành phẩm không có CO2) và vang có gas (trong vang thành phẩm có CO2)[ 9], [ 5]

1.1.3 Nguyên liệu sản xuất rượu vang

Nguyên liệu để sản xuất là dịch trái cây từ các loại quả: mơ, táo mèo, vải, dứa, lê, nho…( bảng 1.1)

Bảng 1.1 Thành phần hoá học của các loại quả [6]

Tên quả Thành phần hoá học

Nước Đường Axit tổng số Pectin Tanin Nho ngọt 73,1 9,88 0,56 0,092 0,07

1.2.1 Sơ lược về nấm men

Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo tế bào, sinh sản

chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như trong đất, trong nước, không khí và đặc biệt là có mặt nhiều trên bề mặt nhiều loại quả

Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng Sinh khối của chúng rất giàu protein, vitamin và lipit Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng lại có khả năng tạo sinh khối tế bào Vì thế nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối… Tuy nhiên một số nấm men dại có hại cho sản xuất, làm nhiễm các quy trình công nghệ và gây hư hỏng sản phẩm

1.2.2 Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

- Hình thái Saccharomyces cerevisiae có dạng hình ovan hoặc hình trứng

Hình dạng này có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào

- Kích thước của tế bào nấm men: khoảng 2-8m x 4-10m và cũng có thể thay đổi tuỳ loài, giống và điều kiện môi trường sống

- Nấm men có màu trắng đục, vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt tế bào thường khô và căng, có thể đứng riêng lẻ hoặc dính nhau thành chuỗi

1.2.3 Cấu tạo của tế bào nấm men

Mặc dù có cấu tạo đơn bào nhưng nấm men cũng mang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống Chúng có cấu tạo gồm màng, chất nguyên sinh và nhân

1.2.3.1 Màng

Có cấu tạo 2 lớp với tỷ lệ glucan và mannan tương đương nhau Màng tế bào

có cấu tạo chủ yếu là hemixenluloza, chiếm khoảng 70% trọng lượng khô của tế

bào ( 31% mannan + 29% glucan), 6-7% protein và thường protein của nó liên kết vững chắc với các hidratcacbon, tạo thành một phức chất giàu lưu huỳnh, tồn tại dưới dạng disunfit ( -S-S- ) hoặc sulfidrin (-SH- ) Ngoài ra màng tế bào còn chứa lipit, đường khử, nitơ, các axit amin và các chất khoáng Trên thành tế bào nấm men có các lỗ nhỏ, qua các lỗ này chất dinh dưỡng được đưa vào trong tế bào và các sản phẩm trao đổi chất được thải ra ngoài môi trường xung quanh Nhiệm vụ của màng tế bào: bảo vệ hình thái tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu bên trong tế bào và điều hoà các quá trình trao đổi chất Các chất dinh dưỡng được hấp thụ, chọn lọc qua thành tế bào

1.2.3.2 Nguyên sinh chất

- Màng nguyên sinh chất: nằm ngay dưới lớp thành tế bào, chức năng chủ yếu của nó là chủ động điều hoà việc hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, và nhờ có hệ enzim pecmeaza mà chất dinh dưỡng được hấp thụ và tích luỹ lại trong tế bào

- Chất nguyên sinh của tế bào nấm men

+ Riboxom: bao gồm 2 loại là riboxom 80S ( tồn tại trong tế bào chất) và riboxom 70S ( có trong ty thể)

+ Ty thể có hình bầu dục dài, kích thước 0,2-0,5nm x 0,4-1,0nm kích thước

và hình dáng có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và trạng thái sinh lý của tế bào DNA của nấm men là một phân tử dạng vòng có khối lượng phân tử là 50x106 Da ( gấp 5 lần so với DNA ty thể động vật bậc

cao) DNA nấm men chiếm 15-23% tổng lượng DNA của toàn tế bào nấm men

+ Phức hệ gôngi: nơi giải phóng các sản phẩm của quá trình dị hoá, đồng thời tổng hợp oligosacarit từ monosacarit cho màng tế bào

+ Lizoxom: chứa nhiều loại enzim có khả năng phân giải protein, lipit, polysacarit

+ Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào Trong không bào có chứa các enzim thuỷ phân, polyphotphat, lipit, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian Ngoài tác dụng một kho dự trữ, không bào còn có chức năng điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào

1.2.3.3 Nhân

Tế bào nấm men có nhân thật hình tròn hoặc hình ovan, được bao bọc bởi lớp màng nhân Nhân có kích thước khá lớn khoảng 1-2,4m x 2-8m cấu tạo bởi protein, DNA, RNA và nhiều enzim Nhân quyết định đặc tính di truyền và tham gia điều khiển tất cả mọi hoạt động sống của tế bào nấm men

1.2.4 Sinh sản của tế bào nấm men

Nấm men sinh sản dưới hai hình thức: vô tính và hữu tính

- Sinh sản vô tính bao gồm:

+ Sinh sản bằng hình thức nẩy chồi

+ Sinh sản bằng hình thức phân chia

Trong đó sinh sản bằng hình thức nẩy chồi là hình thức phổ biến nhất Khi

tế bào phát triển đến một mức nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ gọi là mầm (hay chồi) Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm ở trên đầu tế bào mẹ Cùng một lúc tế bào có thể đâm ra nhiều chồi, ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh của tế bào mẹ, sau đó nó tách ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập hoặc không tách khỏi mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau tạo thành chuỗi gọi là khuẩn ty giả

- Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi

Bào tử túi của nấm men là những bào tử được sinh ra trong những túi nhỏ gọi

là túi hay nang Mỗi túi chứa từ 4-8 bào tử túi Nấm men được tạo thành theo phương thức sinh sản đơn tính, là quá trình tạo thành bào tử trực tiếp từ một

tế bào riêng rẽ, không qua tiếp hợp Bào tử túi sau khi ra khỏi túi, gặp điều

kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men Sự hình thành bào tử

túi có 2 ý nghĩa : vừa sinh sản vừa tạo dạng bền vững vì bào tử túi có vỏ dày,

chịu được điều kiện không thuận lợi của môi trường, chịu được nhiệt độ cao

và khô hạn

1.2.5 Những biến động sinh lý, sinh hoá, vi sinh khi lên men rượu vang,

khả năng lên men đường của Saccharomyces cerevisiae

Quá trình sản xuất rượu vang bắt đầu là phát triển của nấm men để tăng sinh khối, lúc này môi trường dịch quả cần nhiều oxi để kích thích sự sinh

trưởng của nấm men Sau đó tạo điều kiện yếm khí để tiến hành lên men tạo

thành rượu etylic, CO2 và nhiều sản phẩm phụ khác như axit lactic, axit axetic,

glixerin…

C6H12O6 2 C2H5OH +2CO2 + Q

*Quá trình lên men rượu xảy ra theo 5 giai đoạn

Giai đoạn 1 Hoạt hoá phân tử hexoz gồm 3 phản ứng

- Dưới tác dụng của enzim photphoglucokinase, phân tử glucoza kém hoạt

động nhận một gốc photphat từ ATP tạo thành glucozo 6P là dạng hoạt

động

-Phân tử glucozo 6P dưới tác dụng của enzim izomerase chuyển thành

dạng đơn phân của nó là fructozo 6P có cấu tạo kém bền vững hơn

-Từ fructozo 6P, bắng cách photphoril hoá nhờ tác dụng của enzim

photphofructokinase chuyển thành fructozo1,6điphotphat Phân tử này

rất dễ bị cắt mạch cacbon

Giai đoạn 2 Cắt mạch cacbon

- Alđolase là enzim xúc tác sự phân li fructozo 1,6 điphophat thành 2 phân

tử trioz photphat (đihiđroxi axeton photphat và glyxeralđehit 3- photphat) 2

trioz photphat này có thể chuyển hoá lẫn nhau nhờ một enzim đồng phân

(trioz-photphat-izomerase) Cân bằng phản ứng lệch về phía tạo thành glyxeralđehit 3- photphat Bởi vậy, từ một phân tử fructozo 1,6- điphotphat sẽ tạo thành 2 phân tử glyxeralđehit 3- photphat

Giai đoạn 3 oxi hoá

- Enzim glyxeralđehit 3 photphat- đehiđrogenase được tách ra rừ nấm men

sẽ xúc tác cho sự oxi hoá glyxeralđehit 3 photphat thành axit tương ứng

là axit 1,3- điphotphoglyxeric Axit này chuyển gốc phophat cao năng cho ADP để tạo thành ATP và tạo axit 3- photphoglyxeric Phản ứng này rất có ý nghĩa vì năng lượng được giải phóng ra trong quá trình oxi hoá

sẽ được tích luỹ trong phân tử ATP, đảm bảo cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động sống của tế bào trong điều kiện yếm khí

Giai đoạn 4 sự tạo thành axit pyruvic

Photphoglixeratmutase

Axit 3 - photphoglyxeric axit 2 photphoglyxeric

Enolase

ADP ATP H2O

Dạng xeton Dạng enol Axit photphoenolpyruvic

Axit pyruvic Pyruvat kinase Giai đoạn 5 Sự chuyển hoá tiếp tục axit pyruvic thành các sản phẩm cuối cùng

- Sự tạo thành axit lactic

Lactatdehidrogenase

Axit pyruvic Axit lactic

- Lên men rượu: gồm 2 bước

+ Nhờ enzim pyruvat decacboxylase, axit pyruvic bị khử nhóm cacboxyl thành CO2 và axetaldehit

+ Axetaldehit bị khử thành etanol nhờ enzim alcol đehirogenase

- Sự tạo thành α - glixerophotphat và glixerin

Đihidroxiaxeton P α - glixero P đehidrogenase L -α - glixero P

H2O

NADH+H+ NAD+ Photphatase

Pv

Glixerin

1.2.6 Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang, bệnh vang

1.2.6.1 Nấm men

Nấm men được sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất là chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae Theo quan điểm kinh tế người ta chia thành các

Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của quá trình sản xuất rượu vang, thùng

chứa thiết bị hoặc do bụi, không khí đưa đến Đại diện:chi Rhizopus,

Aspergillus

1.2.6.3 Vi sinh vật làm hỏng vang

Có không ít vi sinh vật làm cho vang bị đục, có vị chua gắt, mùi khó chịu, làm

cho vang bị hỏng như: Bacterium gracile, Acetobacter xylinum, Acetobacter

axeti [ 4].

Các vi khuẩn kị khí: các vi khuẩn lactic như: L.brevia, L.pastoerianus, L

buchneri…đã làm cho vang bị vẩn đục, có mùi dưa muối Các vi khuẩn hiếu

khí: Một số loại nấm men tạo mang trên bề mặt vang như: Candida, Zygopichia,

Pichia… phân giải đường thành các axit hữu cơ: citric, axetic…làm cho vang bị

đục, độ chua tăng cao, vị không ngon [8]

1.2.6.4 Bệnh vang

Là hiện tượng rượu vang bị chua chất lượng rượu vang bị giảm rất nhanh Nguyên nhân do rượu vang bị tiếp xúc với không khí và do dưới tác dụng của vi

khuẩn axetic đã biến cồn thành axit axetic Hoặc có thể do vi sinh vật lên men trong điều kiện kị khí gây ra

1.2.7.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm men

1.2.7.1 Nguồn cacbon

Cacbon là thành phần quan trọng trong các hợp chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc và hoạt động sống của tế bào Trong hợp chất hữu cơ cacbon chiếm vị trí quan trọng hàng đầu cho sự sống của vi sinh vật là nguồn thức ăn chủ yếu của vi sinh vật là hydratcacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu sau:

- Sản sinh năng lượng

- Tạo tiền chất

- Thực hiện những quá trình oxi hoá - khử để biến tiền chất thành những sản phẩm trung gian hoặc cuối cùng để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trường

1.2.7.2.Nguồn nitơ vô cơ

Nấm men cần nitơ để xây dựng tế bào Vì vậy, môi trường nuôi cấy nấm men cần bổ sung hợp chất chứa nitơ mà nấm men có thể đồng hoá Do đó trong môi trường phân lập cũng như trong môi trường nuôi cấy ta thường bổ sung (NH4)2SO4

1.2.7.3.Nguồn photpho vô cơ

Hợp chất photpho có vai trò quan trọng Nếu thay đổi nồng độ hợp chất photpho trong môi trường sẽ dẫn đến sự thay đổi các quá trình tổng hợp hàng loạt các hợp phần của tế bào có chứa photpho, tế bào chất và chất nhân Ngoài

ra, photpho có trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzim đồng hoá các loại thức ăn cacbon Trong môi trường phân lập cũng như trong môi trường nuôi cấy ta thường bổ sung KH2PO4

1.2.7.4 Nguồn nguyên tố khoáng khác

Muối khoáng có trong môi trường tham gia chủ yếu vào thành phần hạt nhiễm sắc và các enzim Vì vậy, một trong những tính chất của chúng là làm

thay đổi trạng thái hoá keo của tế bào chất Dưới tác dụng của muối vô cơ, bề mặt tế bào không ngường thay đổi và dẫn đến làm thay đổi phản ứng enzim trong quá trình trao đổi chất Như vậy, có thể nói rằng muối khoáng có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của nấm men

Ion Ca2+, Mg2+ điều chỉnh sự phát triển của tế bào nấm men

Ion Fe3+, Mg2+ nằm trong thành phần của enzim hoạt động

Ngoài ra, một số nguyên tố vi lượng và các chất kích thích sinh học cũng ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm men

1.2.7.5 Nguồn oxi

Có liên quan tới sự tổng hợp các xitocrom Nếu nồng độ oxi là 0,05µM/l thì

hệ thống các xitocrom a, b, c, c1 sẽ vắng mặt Vì vậy, lượng oxi cung cấp có một

ý nghĩa hết sức đặc biệt

Khi trong môi trường có oxi nấm men sẽ sinh trưởng tăng sinh khối

Khi trong môi trường không có mặt oxi nấm men sẽ tiến hành lên men

1.2.8.Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men

1.2.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men và chất lượng của vang

- Nhiệt độ < 20oC: sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp

- Nhiệt độ < 10oC: không diễn ra quá trình lên men

- Nhiệt độ ở 35oC: nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men không chết nhưng mất tác dụng

- Nhiệt độ > 35oC: quá trình lên men dừng lại, lượng đường sót cao, vi khuẩn hoạt động, đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit axetic gây chua, giảm chất lượng vang

Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26-28oC[7]

1.2.8.2 Ảnh hưởng của nồng độ cồn

Khả năng chịu cồn cao và lên men được trong môi trường có nồng độ cồn hợp

lý là một trong những yêu cầu của chủng nấm men lên men rượu vang, vì trong

quá trình lên men luôn sinh ra cồn Nếu nồng độ cồn cao sẽ làm tê liệt hoạt động sống của tế bào nấm men, ức chế, kìm hãm quá trình đồng hoá hydratcacbon và nitơ [7]

1.2.8.3 Ảnh hưởng của pH

pH ở các mức khác nhau thì quá trình lên men diễn ra với tốc độ khác nhau

pH = 2,3 thì quá trình lên men yếu, pH = 6,5-7,5 thì quá trình lên men dừng lại Đối với quá trình lên men vang một số loại quả pH thích hợp từ 4,0-4,5 [7]

1.2.8.4 Ảnh hưởng của hàm lượng giống

Hàm lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian nhân giống và lên men sẽ kéo dài hơn, dễ bị nhiễm khuẩn, ngược lại hàm lượng men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lên men sẽ ngắn hơn, hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men Nhưng hàm lượng men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trường lên men và sẽ không

có lợi cho quá trình lên men và chất lượng rượu vang [7]

Nhìn chung hàm lượng nấm men giống thích hợp nhất trong dịch lên men từ 4-10 triệu tế bào/1ml dịch lên men

1.2.8.5 Ảnh hưởng của hàm lượng đường

Hàm lượng đường phù hợp cho quá trình lên men vang là 12-25%.Hàm lượng đường 30%V sẽ ức chế quá trình lên men Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi hàm lượng đường trong dịch lên men tăng thì hàm lượng axit axetic trong vang cũng cao Mặt khác tỉ lệ các loại đường có trong dịch lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả

đã cho thấy: glucoza là loại đường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển của tế bào nấm men cũng như quá trình tạo rượu, tiếp đó là đường fructoza và đường sacaroza… Vì vậy quả có chứa hàm lượng đường khử càng cao càng có lợi cho quá trình lên men và chất lượng của vang thành phẩm [7]

1.2.8.6 Ảnh hưởng của nồng độ oxy hoà tan

Nồng độ oxy hoà tan giữ vai trò quan trọng không chỉ đối với sự sinh sản và phát triển tối đa của nấm men mà còn quyết định đến hiệu suất lên men và chất lượng của vang Trong điều kiện lên men rượu, các đường đơn glucoza, fructoza

sẽ được phân giải theo con đường EMP và chu trình ATC, tiếp đó là chuỗi hô hấp hoạt động, khi nấm men thu được nhiều năng lượng, sinh khối trong dịch lên men cũng tăng, môi trường cũng dần chuyển sang kị khí và nấm men chuyển sang lên men rượu, do đó sản phẩm của quá trình lên men rượu bao gồm: etanol,

CO2, sinh khối, các axit hữu cơ và các sản phẩm phụ khác…Do đó, việc cung cấp oxy cho quá trình lên men vang không chỉ đáp ứng yêu cầu sinh sản và phát triển mạnh của nấm men mà còn làm mất đi một số sản phẩm lên men không cần thiết

-Khi môi trường có đầy đủ oxy thì nấm men sẽ sử dụng đường làm nguồn năng lượng tăng sinh khối

-Khi môi trường thiếu oxy thì nấm men lại tiến hành hô hấp kị khí và chuyển thành rượu

CHƯƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, HOÁ CHẤT

2.1.1 Nguyên liệu chính

- Quả táo mèo thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái và Sơn La

- Dịch táo mèo được sử dụng làm các môi trường phân lập, tuyển chọn giống nấm men, môi trường nghiên cứu một số đặc tính sinh học của nấm men đồng thời cũng chính là nguyên liệu để nghiên cứu lên men vang táo mèo

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

2.1.2.1 Hoá chất

Một số hoá chất được sử dụng: MgSO4,KH2PO4, (NH4)2SO4, axit xitric (hãng: FENXICHUN-Trung Quốc), K2S2O5 (hãng: BATOL-của C.H Pháp), các loại muối nitrat, các loại đường (hãng: BDH-Anh)…

2.1.2.2 Thiết bị

Hộp petri, ống nghiệm, đường kế Đức, tủ sấy, tủ lạnh sâu, buồng cấy vô trùng, buồng đếm Goriaev, máy đo pH, máy quang phổ kế, máy ly tâm, kính hiển vi quang học Nikon Nhật, nồi khử trùng cao áp,máy lắc ổn nhiệt, …

2.1.3 Các loại môi trường

2.1.3.1 Môi trường Hansen (môi trường 1) g l

2.1.3.3 Môi trường lên men (môi trường 3)g/l

1 Dịch siro hoa quả : 200ml

2.2.1.1.a Tạo nguồn giống nấm men để phân lập và tuyển chọn

Nguyên liệu dùng để sản xuất rượu vang ở đây là các loại quả táo mèo (quả sơn tra) Táo mèo được thu hoạch vào tháng 6, tháng 7 Quả thu hoạch về cần phải được chọn lấy các quả đã chín, loại bỏ các quả non, quả dập nát thối rữa Quả đã chọn đem rửa sạch bằng nước đạt tiêu chuẩn vệ sinh rồi để ráo nước Sau

đó cho vào các ang thùng ngâm đường theo tỉ lệ 1:1 Quả táo mèo ta khía các đường nhỏ quanh quả Khoảng hai ngày khuấy trộn một lần Sau một tháng ta thu được một thứ siro nước quả có nồng độ đường khoảng 60-80 % và nhiều dưỡng chất khác được chiết ra từ thịt quả

Theo dõi dịch lên men phân tích nồng độ cồn trong dịch quả lựa chọn mẫu có

độ cồn bằng 10% V làm nguồn cung cấp nấm men để tiến hành phân lập

2.2.1.1.b Phân lập giống nấm men

Pha loãng dịch quả bằng nước đảm bảo vệ sinh cho đến khi đạt nồng độ đường 20% Dịch pha loãng được sunfít hoá bằng K2S2O5 với liều lượng thích hợp để không giết chết nấm men thuần chủng Sau đó để lên men tự nhiên ở nhiệt độ 26 - 28 0C, đến ngày lên men thứ 3-5 chúng tôi lấy khoảng 5-10ml dịch đang lên men đem pha loãng ở các nồng độ khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-

5

….10-10.Từ mỗi ống nghiệm chứa dịch pha loãng ta lấy 1 giọt, dùng bàn trang trải đều trên hộp lồng có chứa môi trường Hansen rồi để trong tủ ấm 26 - 280C trong khoảng thời gian 2 - 3 ngày [6] Từ các hộp lồng này ta lựa chọn lấy các khuẩn lạc to, trơn, nhẵn, bóng, sáng đem cấy riêng rẽ vào các ống thạch nghiêng, nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng tuyển chọn

2.2.1.2 Đếm số lượng tế bào nấm men

Phương pháp đếm số lượng tế bào dùng để xác định mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy là phương pháp đơn giản, thuận tiện, cho kết quả nhanh Dụng

cụ để đếm số lượng tế bào là buồng đếm hồng cầu Thoma- Goriaev có cấu tạo là một khung đếm bằng phiến kính bao gồm 400 ô vuông nhỏ với tổng thể tích của buồng đếm là = 0,1m3

Việc đếm số luợng tế bào nấm men có trong môi trường nuôi cấy được thực hiện đúng theo nguyên tắc đếm số lượng hồng cầu trong máu

2.2.1.3 Phương pháp hoạt hoá giống

Các khuẩn lạc được chọn sẽ được cấy vào thạch nghiêng để ở 26-280C trong vòng 24 giờ được giống cấp 1 Nấm men được lấy từ thạch nghiêng để đưa vào dịch lên men Để có số lượng nấm men lớn và có những tế bào trẻ, to khoẻ, chúng tôi tiến hành hoạt hoá giống bằng cách nuôi trong môi trường nhân giống

ở 26-280C trong 24 giờ trên máy lắc, được giống cấp 2 Dùng giống cấp 2 để lên men

2.2.1.4.Xác định hoạt lực lên men

Chúng tôi xác định hoạt lực lên men của nấm men thông qua việc xác định hàm lượng CO2 được sinh ra ( g/l dịch lên men ) khi tiến hành lên men trong các bình tam giác với 50ml dịch môi trường lên men Hàm lượng CO2 sinh ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt

Trong một số trường hợp khi nghiên cứu về nấm men ở giai đoạn nhân giống hoặc lên men vang chúng tôi kết hợp phân tích hàm lượng cồn và đường sót để xác định hiệu suất lên men, nếu hiệu suất lên men càng cao thì hoạt lực lên men của nấm men được đánh giá càng tốt

Hiệu suất lên men được tính bằng công thức:

2.2.1.5 Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi

Tế bào nấm men được nhuộm đơn bằng cách: lấy một lượng nhỏ tế bào từ ống thạch nghiêng, dàn đều lên lam kính có chứa một giọt nước cất sau đó cố định vết bôi bằng cách hơ lên ngọn lửa đèn cồn Nhỏ 1-2 giọt xanhmetilen lên vết bôi, để trong khoảng 2-3 phút rồi rửa lại bằng nước cất Cuối cùng hơ trên ngon lửa đèn cồn, để khô rồi quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần

2.2.1.6 Xác định khả năng kết lắng

Khả năng kết lắng của chủng nấm men được xác định bằng tốc độ lắng của sinh khối phương pháp này được tiến hành như sau: hoà sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH=4,5) được đựng trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thước như nhau với thể tích của dung dịch đệm và số lượng nấm men hoàn toàn bằng nhau Lắc kỹ trên máy với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút, để lắng 15 phút, lúc này toàn bộ khối dịch phân thành 2 lớp ( phía dưới đáy của ống nghiệm là nấm men đã kết lắng) Tiến hành đo chiều cao lớp kết lắng của nấm men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của

chủng nấm men Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm men có độ kết lắng tốt nhất

2.2.1.7 Xác định tên khoa học của chủng nấm men

Chúng tôi sử dụng khoá phân loại của Lodder (1970) để xác định tên khoa học của chủng nấm men do chúng tôi phân lập và tuyển chọn được để lên men vang táo mèo thông qua các tiêu chí cơ bản

- Đặc điểm sinh học ( cấu tạo, hình thái, sinh lý, điều kiện hình thành túi bào tử và số lượng bào tử…)

- Khả năng đồng hoá cacbon

- Khả năng đồng hoá các loại muối nitrat

2.2.2.Phương pháp hoá học

- Xác định hàm lượng đường bằng đường kế

- Xác định độ pH bằng máy đo pH và giấy đo pH

- Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N Từ số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn ta suy ra hàm lượng axit dịch lên men

- Xác định hàm lượng cồn bằng cồn kế hoặc bằng phương pháp hoá học 2.2.3 Phương pháp toán học

Chúng tôi tiến hành xử lý kết quả thu được bằng phương pháp thống kê toán học qua các thông số sau:

Chủng nấm men Saccharomyces tuyển chọn trên đối tượng là quả táo mèo

được thu từ Trạm Tấu (Yên Bái), Sơn La

2.4 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Phòng thí nghiệm Vi sinh-CNSH, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.5 THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Đề tài thực hiện từ tháng 9 năm 2005 đến tháng 12 năm 2006