Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo (Khóa luận tốt nghiệp)
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA : SINH - KTNN
tk # ok 2
HOÀNG THỊ THUÝ
NGHIÊN CUU ANH HUGNG CUA
MOI TRUGNG DINH DUONG VA HAM LUGNG
MEN GIONG CHO QUA TRINH LEN MEN
VANG TAO MEO
KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC
Chuyén nganh: Vi sinh vat hoc
Người hướng dan khoa học
TS ĐINH THỊ KIM NHUNG
Trang 2LOI CAM ON
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cẩm ơn cô giáo: TS Đỉnh Thị Kim Nhung, thấy giáo: Th.Š Nguyễn Khắc Thanh đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô trong khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện cho em học tập và nghiên cứu trong thời gian qua
Xin chân thành cẩm ơn các bạn sinh viên đã giúp đỡ tơi để khố luận hoàn
thành một cách tốt đẹp
Xin chan thanh cam ơn!
Ha Noi, thang 5 nam 2007
Sinh vién
Hoang Thi Thuy
Trang 3ĐẶT VẤN ĐỀ -G - QC CC CÓ 00 9300600066006 60 60960909069 6 0906006060669 6699096 5 CHUONG 1 TONG QUAN TAI LIEU cscscscscscscccscsssesscscneses 7 1.1.Khái quát chung vỆ rượu Vang cà 7
1.2 Một sô đặc tính sinh học của tê bào nầm men Saccharomyces serevisiae 8
CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨCU 18
2.1.Nguyên liệu, thiết bị và hoá chất -.ccc ch cà 18 2.2.Phương pháp nghiên cỨu_ c co 19 2.3.Phạm vi nghiên CỨU HS nh nh kh hà ha 23 2.4 Địa điểm thực hiện đề tài cu 2Q QnSnSSSnnnnn ng hao 23 2.5.Thời gian thực hiện đề tài ch nh nhe 23 CHƯƠNG 3 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THÁO LUẬN 24
3.1.Phân lập, tuyên chọn, xác định tên khoa học của chủng nam men lên men 23102 (4 24
3.2.Ảnh hưởng của một số nhân tố trong quá trình nhân giống 33
3.3.Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo 38
3.4.Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 42
3.5.Ứng dụng lên men vang táo mẻo với quy mô phòng thí nghiệm .44
3.6.Quy trình công nghệ lên men vang táo mèo 45
41% 097.90 A0700 19.101 47
(V.98Hi3000:7.9/80.4.7 01 e 48
Trang 41 Danh mục các chữ viết tắt Nxb: Nhà xuất bản SLTB: Số lượng tế bào HL: Hàm lượng 2 Danh mục các bảng
Bảng 1.1 Thành phần hoá học của các loại quả
Bảng 3.1.2.1.a Khả năng sinh trưởng và phát triển của 4 chủng nẫm men
Bảng 3.1.2.1.b Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao
Bảng 3.1.2.1.c Thử hoạt lực lên men của bốn chủng nắm men Bang3.1.2.1.d Khả năng kết lắng của bốn chủng nắm men
Bảng 3.1.2.1.e Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm của 4 chủng nắm men
Bang 3.1.2.1.g Tông hợp kết quả tuyển chọn chủng nắm men
Bảng 3.1.3.2.a Khả năng lên men các loại đường của chủng TM¿
Bang 3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng K;S;O; trong quá trình nhân giống Bang 3.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng cao men bố sung trong quá trình nhân giống
Bảng 3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình nhân giống Bảng 3.2.5.Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hoà tan trong
quá trình nhân giống
Bảng 3.3.1 Động thái lên men vang trong ngày thứ nhất
Bảng 3.4.2 Ảnh hưởng của độ pH đến quá trình lên men vang táo mèo
Bang 3.4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống tới quá trình lên
men vang táo mèo
Bang 3.5 Kết quả phân tích rượu thành phẩm
3 Danh mục đồ thị, biểu đồ
eK À A As 3 ` 3 A 3 A
Trang 5Biểu đồ 3.2.4 Số lượng tế bào trung bình sau 28 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau
Đồ thị 3.3.1 Tốc độ phát triển của ,S.cerevisiae TM¿ trong ngày
Đồ thị 3.3.2 Động thái của quá trình lên men vang táo mèo
4 Danh mục các hình ảnh Hinh 3.1 Khuan lac ching TM,
Hinh 3.2 Ching nam men
Hình 3.3 Ảnh chụp gel sau điện di soi trên tia uv
DAT VAN DE
Trang 6Vang là loại đô uống có độ cồn nhẹ lên men trực tiếp từ dịch trái cây mà không phải trải qua quá trình chưng cất Rượu vang có hàm lượng cồn thấp,
nhiều vitamin và các chất khoáng có mùi thơm dễ chịu, có hương vị đặc trưng
của từng loại quả Rượu vang kích thích tiêu hố, tuần hồn, thần kinh
Người ta đã biết làm rượu vang từ 3000 năm trước công nguyên Hàng năm
trên thế giới sản xuất khoảng 18 tỷ lít rượu vang trong đó có 1/3 của Pháp và
Angeri
Ở Việt Nam ngành sản xuất vang mới thực sự bắt đầu từ những năm 80 của thé ki 20 với sự xuất hiện vang mang nhãn hiệu (Thăng Long, Thanh Ba, Gia
Lâm ) Nguồn nguyên liệu để sản xuất vang tại Việt Nam chủ yếu là từ các
loại quả: nho, dâu, táo, lê, dứa, vải [7]
Thực tế cho thay phan lớn các loại quả có chứa đường, axit, vitamin,
khống và khơng có độc hại thì đều có thể sử dụng để lên men vang, nhưng để
có vang tốt thì không phải loại quả nào cũng làm được Do đó việc lựa chọn nguyên liệu phù hợp với yêu cầu của công nghệ và chất lượng của sản phẩm cho đến nay vẫn là vấn đề cấp thiết đối với ngành sản xuất vang ở nước ta Mặt khác cũng rất cần phải có quy trình công nghệ hoàn thiện để có thê sản xuất loại vang thực sự có chất lượng cao, từng bước hội nhập vào thị trường khu vực và quốc tế
Nguyên liệu mà chúng tôi lựa chọn và nghiên cứu cho lên men rượu vang là qua tao méo (Docynia indica) Day 1a loai qua cé huong vi thom rất đặc trưng
được trồng nhiều ở các tỉnh miền núi phía bắc nước ta với tổng diện tích 40.000
ha Nơi có diện tích trồng cây táo mẻo nhiều là các tỉnh Yên Bái, Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La Tổng diện tích trồng cây táo mẻo vẫn tiếp tục tăng trong những năm gan day [6]
Nhu cầu tiêu dùng đối với quả táo mèo chủ yếu là ăn trực tiếp, ngâm rượu, ngâm dịch siro nhưng cũng chỉ chiếm khoảng 35-40% tổng sản lượng quả thu
Trang 7khi đó ngành sản xuất vang của nước ta đang phát triển với tốc độ nhanh và đang thiếu nguyên liệu có chất lượng phù hợp để sản xuất rượu vang có chất lượng cao giá thành hạ Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình lên men vang táo mèo”
2 Mục tiêu của đề tài
1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men phù hợp cho lên men vang táo mẻo, tiến hành định loại chủng nắm men này bằng phương pháp phân tử 2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nắm men đã tuyến chọn 3 Lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng quy
trình lên men vang táo mèo
3 Đối tượng nghiên cứu
- Qua tao méo (Docynia indica)
- Chủng nắm men có khả năng lên men vang táo mẻo
4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
- Nghiên cứu đặc tính, sinh lý, sinh hoá của chủng nam men có khả năng lên
men vang táo mèo Kết quả nghiên cứu này là đữ liệu góp phần bô sung cho các nghiên cứu về nắm men và ứng dụng của nẫm men trong đời sống - Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có của địa phương nhằm sản xuất một
loại vang phù hợp thị hiếu của người tiêu dùng, góp phần làm phong phú thị trường vang trong nước và nâng cao thu nhập cho đồng bào dân tộc vùng cao
CHƯƠNG 1
TONG QUAN TAI LIEU
Trang 81.1.1 Thành phần của rượu vang
Thành phán chủ yếu của rượu vang bao gôm:
1 Côn(etanol): do lên men tự nhiên từ địch trái cây vì vậy không lẫn aldehit,
este Độ côn của rượu vang từ 10-12”, nên nhiêu người uông được
Chất bố dưỡng: đường là nguyên liệu để tạo nên các loại rượu trong quá trình lên men vang Trong dịch quả chín chủ yếu là các loại đường khử: fructoza, glucoza, và một Ít galactoza ngồi ra cịn có cả đường kép: sacaroza đường trong vang từ 62-132g/1
Axit v6 co va axit hiru co: axit malic, axit tartaric, axit citric, axit oxalic Hàm lượng axit tổng số từ 4-7g/1 ( quy ra axit tartaric)
Rượu vang giàu vitamm: vitamin có trong nước quả không bị quá trình
lên men phân huỷ mà nó chỉ điều chỉnh lại thành phân [ 3]
Các axIt amin: các axit amin có vai trò quan trọng đôi với sự sinh sản và phát triên của nầm men Ngoài lượng axit amin có săn trong dịch quả, quá trình lên men vang cũng tạo thêm được một sô axIt amin đã làm cho vang thành phâm có hương, vị rât đặc trưng Các axit amin nhu: Lizin, treonin, valin, acginm [ 10]
1.1.2 Phân loại vang
Có nhiêu cách phân loại khác nhau, có thê căn cứ vào màu sắc của sản phầm mà phân thành các loại: vang đỏ, vang hồng, vang trắng, và tương ứng với các loại vang này đều có các chỉ tiêu giới hạn về màu sắc nhất định Chăng hạn vang
đỏ là loại vang có màu đỏ, đỏ lựu, đỏ thăm, vang trăng là vang có màu vàng rơm
đên vàng ánh, vang hông có màu hông đên đỏ tươi
Căn cứ vào độ rượu, hàm lượng đường, hàm lượng axIt có trong vang mà phân thành các loại vang: vang khô, vang dịu, vang ngọt
Xu hướng chung thì vang được phân thành 2 nhóm chính là vang không có
gas (trong vang thành phẩm không có CO;) và vang có gas (trong vang thành
phẩm có CO;) [ 9], [ 5]
Trang 9Nguyên liệu để sản xuất là dịch trải cây từ các loại quả: mơ, táo mo, vải, dứa, lê, nho ( bảng 1.1)
Bảng 1.1 Thành phẩn hoá học của các loại quả [6]
Tên quả Thành phân hoá học
Nước Đường | Axittôngsố |Pectin | Tanin Nhongọt | 73,1 9,88 0,56 0,092 | 0,07 Vai 84,28 16,1 5,16 0,249 | 0,83 Dutra 54,3 3,9 0,6 _ _ Mo 73,8 9,0 1,1 _ _ Táo mèo 84,0 4,8 1,45 — — 1.2 MOT SO DAC TINH CUA TE BAO NAM MEN Saccharomyces cerevisiae
1.2.1 Sơ lược về nắm men
Nam men (yeast) la tén chung dé chỉ nhóm nam có cấu tạo tế bào, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chổi Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như trong đất, trong nước, không khí và đặc biệt là có mặt nhiều trên bề mặt
nhiều loại quả
Nam men có khả năng sinh sản nhanh chóng Sinh khối của chúng rất giàu
protein, vitamin va lipit Nam men c6 khả năng lên men các loại đường để tạo
thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng lại có
khả năng tạo sinh khối tế bào Vì thế nam men được ứng dụng rộng rai trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối Tuy nhiên một số nam men dai có hại cho sản xuất, làm nhiễm các quy trình công nghệ và gây hư hỏng sản phẩm
1.2.2 Hình thái và cầu trúc của tê bào nầm men ,Šzccharornyces cerevisiqe - Hinh thai Saccharomyces cerevisiae co dang hinh ovan hoac hinh trimg
Hình dạng này có thê thay đôi tuỳ thuộc vào điêu kiện môi trường, điêu
Trang 10- _ Kích thước của tế bào nắm men: khoảng 2-8um x 4-10um và cũng có thể
thay đơi tuỳ lồi, giống và điều kiện môi trường sống
- Nắm men có màu trăng đục, vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt tế bào thường
khô và căng, có thê đứng riêng lẻ hoặc dính nhau thành chuỗi
1.2.3 Cầu tạo của tế bào nắm men
Mặc dù có cấu tạo đơn bào nhưng nẫm men cũng mang đây đủ tính chất của
một cơ thể sống Chúng có cầu tạo gồm màng, chất nguyên sinh và nhân 1.2.3.1 Màng
Có câu tạo 2 lớp với tỷ lệ glucan và mannan tương đương nhau Màng tế bào có cầu tạo chủ yếu là hemixeniuloza, chiếm khoảng 70% trọng lượng khô của tế
bao (31% mannan + 29% glucan), 6-7% protein và thường protein của nó liên
kết vững chắc với các hidratcacbon, tạo thành một phức chất giàu lưu huỳnh, tồn tại dưới dạng disunft ( -S-S- ) hoặc sulfidrin (-SH- ) Ngoài ra màng tế bào còn
chứa lipit, đường khử, nitơ, các axit amin và các chất khoáng Trên thành tế bào
nắm men có các lỗ nhỏ, qua các lỗ này chất dinh dưỡng được đưa vào trong tế bào và các sản phẩm trao đôi chất được thải ra ngồi mơi trường xung quanh
Nhiệm vụ của màng tế bào: bảo vệ hình thái tế bào, duy trì áp suất thắm thấu
bên trong tế bào và điều hoà các quá trình trao đổi chất Các chất dinh dưỡng
được hấp thụ, chọn lọc qua thành tế bào 1.2.3.2 Nguyên sinh chất
- Màng nguyên sinh chất: nằm ngay dưới lớp thành tế bào, chức năng chủ yếu của nó là chủ động điều hoà việc hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế
bào, và nhờ có hệ enzim pecmeaza mà chất đinh dưỡng được hấp thụ và
tích luỹ lại trong tế bào
- Chất nguyên sinh của tế bào nẫm men
+ Riboxom: bao gồm 2 loại là riboxom 80S ( tồn tại trong tế bào chất) và riboxom 70S ( có trong ty thê)
+ Ty thể có hình bầu dục dài, kích thước 0,2-0,5nm x 0,4-1,0nm kích thước và hình dáng có thê thay đôi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và
trạng thái sinh lý của tế bào DNA của nẫm men là một phân tử dạng vòng có
Trang 11cao) DNA nam men chiếm 15-23% tổng lượng DNA của toàn tế bào nam men
+ Phức hệ gôngi: nơi giải phóng các sản phẩm của quá trình đị hoá, đồng thời
tổng hợp oligosacarit từ monosacarit cho màng tế bào
+ Lizoxom: chứa nhiều loại enzim có khả năng phân giải protein, lipit, polysacarit
+ Các tế bào nắm men khi già sẽ xuất hiện không bào Trong không bào có chứa các enzim thuỷ phân, polyphotphat, lipit, ion kim loại, các sản phẩm trao đối chất trung gian Ngoài tác dụng một kho dự trữ, không bào còn có chức năng điều hoà áp suất thâm thấu của tế bào
1.2.3.3 Nhân
Tế bào nắm men có nhân thật hình tròn hoặc hình ovan, được bao bọc bởi lớp màng nhân Nhân có kích thước khá lớn khoảng 1-2,4um x 2-8um cấu tạo bởi protein, DNA, RNA và nhiều enzim Nhân quyết định đặc tính di truyền và tham gia điều khiến tất cả mợi hoạt động sống của tế bào nắm men
1.2.4 Sinh sản của tế bào nắm men
Nắm men sinh sản dưới hai hình thức: vô tính và hữu tính
- — Sinh sản vô tính bao gồm:
+ Sinh sản bằng hình thức nấy chôi
+ Sinh sản bằng hình thức phân chia
Trong đó sinh sản bằng hình thức nây chổi là hình thức phố biến nhất Khi
tế bào phát triển đến một mức nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chổi nhỏ
gợi là mầm (hay chổi) Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm ở trên đầu tế bào mẹ Cùng một lúc tế bào có thể đâm ra nhiều chồi, ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất
nhân và chất nguyên sinh của tế bào mẹ, sau đó nó tách ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập hoặc không tách khỏi mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau tạo
thành chuỗi gọi là khuẩn ty giả
- _ Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi
Bào tử túi của nắm men là những bào tử được sinh ra trong những túi nhỏ gọi
là túi hay nang Mỗi túi chứa từ 4-8 bào tử túi Nắm men được tạo thành theo
Trang 12tế bào riêng rẽ, không qua tiếp hợp Bào tử túi sau khi ra khỏi túi, gặp điều
kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nâm men Sự hình thành bào tử
túi có 2 ý nghĩa : vừa sinh sản vừa tạo dạng bền vững vì bào tử túi có vỏ dày,
chịu được điều kiện không thuận lợi của môi trường, chịu được nhiệt độ cao
và khô hạn
1.2.5 Những biến động sinh lý, sinh hoá, vi sinh khi lên men rượu vang, khả năng lên men dudng cia Saccharomyces cerevisiae
Quá trình sản xuất rượu vang bat đầu là phát triển của nam men dé
tăng sinh khối, lúc này môi trường dịch quả cần nhiều oxi để kích thích sự sinh
trưởng của nắm men Sau đó tạo điều kiện yếm khí để tiến hành lên men tạo
thành rượu etylic, CO; và nhiều sản phẩm phụ khác như axit lactic, axit axetic, glixerin
CsH;,0s ~~ 2 C,H;0H +2CO, + Q
*Quá trình lên men rượu xáy ra theo 5 giai đoạn Giai đoạn I Hoạt hoá phân tử hexoz gồm 3 phản ứng
- — Dưới tác dụng của enzIm photphoglucokinase, phân tử glucoza kém hoạt động nhận một gốc photphat từ ATP tạo thành glucozo 6P là dạng hoạt động
Phân tử glucozo 6P đưới tác dụng của enzim izomerase chuyển thành
dạng đơn phân của nó là fuctozo 6P có cầu tạo kém bền vững hơn Từ fructozo 6P, băng cách photphoril hoá nhờ tác dụng của enzim
photphofuctokinase chuyển thành fructozol,6điphotphat Phân tử này
rat dé bi cat mach cacbon
Giai doan 2 Cat mach cacbon
- Aldolase la enzim xtc tac sy phan li fructozo 1,6 diphophat thành 2 phân tr trioz photphat (dihidroxi axeton photphat va glyxeraldehit 3- photphat) 2
Trang 13(trioz-photphat-izomerase) Cân bằng phản ứng lệch về phía tạo thành glyxeraldehit 3- photphat Bởi vậy, từ một phân tử fructozo 1,6- diphotphat sé tạo thành 2 phân tử glyxeraldehit 3- photphat
Giai đoạn 3 oxi hoa
- Enzim glyxeraldehit 3 photphat- dehidrogenase dugc tach ra ru nam men
sẽ xuc tac cho sy oxi hoa glyxeraldehit 3 photphat thành axit tương ứng
la axit 1,3- diphotphoglyxeric Axit nay chuyén gốc phophat cao năng cho ADP để tạo thành ATP và tạo axit 3- photphoglyxeric Phản ứng này rất có ý nghĩa vì năng lượng được giải phóng ra trong quá trình oxi hoá sẽ được tích luỹ trong phân tử ATP, đảm bảo cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động sống của tế bào trong điều kiện yếm khí
Giai đoạn 4 sự tạo thành axit pyruvic
Photphoglixeratmutase
Axit 3 - photphoglyxeric » axit 2 photphoglyxeric Enolase
ADP ATP H,O
Dang xeton „ »angenol „ QZ Axit photphoenolpyruvic
Axit pyruvie Pyruvat kinase
Giai đoạn 5 Sự chuyên hoá tiếp tục axit pyruvic thành các sản phẩm cuối cùng - — Sự tạo thành axit lactic
Lactatdehidrogenase
Axit pyruvic > Axit lactic
- _ Lên men rượu: gồm 2 bước
+ Nhờ enzIm pyruvat decacboxylase, axIt pyruvic bị khử nhóm cacboxyl
thanh CO, va axetaldehit
+ Axetaldehit bi khử thành etanol nhờ enzIm alcol đehirogenase - Sy tao thành ơ - glixerophotphat va glixerin
Trang 14NADH+H NAD” Photphatase
P,
Glixerin
1.2.6 Vi sinh vat tham gia vao qua trinh lén men vang, bénh vang 1.2.6.1 Nam men
Nam men được sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất là chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae Theo quan điểm kinh tế người ta chia thành các chung [ 6], [ 4], [ 1]: © Chung lén men véi hiéu suat cén cao, ở thời gian tối ưu sản xuất tới 20.5 % thể tích côn e Chủng lên men với thời gian ngắn, sản sinh §-12% thể tích cồn, thậm chí ở nhiệt độ thấp 4-10°C không bị kìm hãm
e Chủng chịu được độ cồn cao, lên men được trong rượu vang gồm 30%
đường, hàm lượng côn 12-15% thẻ tích
1.2.6.2 Nẵm mốc
Nắm mốc phát triển ở quả, chất bã của quá trình sản xuất rượu vang, thùng chứa thiết bị hoặc do bụi, không khí đưa đến Đại dién:chi Rhizopus, Aspergillus
1.2.6.3 Vĩ sinh vật làm hỏng vang
Có không ít vi sinh vật làm cho vang bị đục, có vị chua gat, mui kho chiu, lam
cho vang bi hong nhu: Bacterium gracile, Acetobacter xylinum, Acetobacter axefi [ 4]
Các vi khuẩn kị khí: các vi khuẩn lactic như: 1.revia, L.pastoerianus, L
buchneri đã làm cho vang bị vẫn đục, có mùi đưa muối Các vi khuẩn hiếu
khí: Một số loại nằm men tạo mang trên bề mặt vang nhu: Candida, Zygopichia, Pichia phần giải đường thành các axit hữu cơ: cItric, axetic làm cho vang bị đục, độ chua tăng cao, vị không ngon [8]
1.2.6.4 Bệnh vang
Là hiện tượng rượu vang bị chua chất lượng rượu vang bị giảm rất nhanh
Trang 15khuẩn axetic đã biến cồn thành axit axetic Hoặc có thể do vi sinh vật lên men trong điều kiện kị khí gây ra
1.2.7.Các yếu tô ảnh hướng đến quá trình sinh trưởng của nắm men 1.2.7.1 Nguồn cacbon
Cacbon là thành phần quan trọng trong các hợp chất hữu cơ tham gia vào câu trúc và hoạt động sống của tế bào Trong hợp chất hữu cơ cacbon chiếm vị trí quan trọng hàng đầu cho sự sống của vi sinh vật là nguồn thức ăn chủ yếu của vi sinh vật là hydratcacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu sau:
- San sinh năng lượng - Tạo tiền chất
- Thực hiện những quá trình oxi hoá - khử để biến tiền chất thành những
sản phẩm trung gian hoặc cuối cùng để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trường
1.2.7.2.Nguôn nitơ vô cơ
Nắm men cần nitơ để xây dựng tế bào Vì vậy, môi trường nuôi cây nắm men
cần bố sung hợp chất chứa nitơ mà nắm men có thể đồng hoá Do đó trong môi trường phân lập cũng như trong môi trường nuôi cấy ta thường bổ sung
(NH,);5O,
1.2.7.3.Nguén photpho vé co
Hợp chất photpho có vai trò quan trọng Nếu thay đối nông độ hợp chat photpho trong môi trường sẽ dẫn đến sự thay đổi các quá trình tổng hợp hang loạt các hợp phần của tế bào có chứa photpho, tế bào chất và chất nhân Ngoài
ra, photpho có trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzim
đồng hoá các loại thức ăn cacbon Trong môi trường phân lập cũng như trong
môi trường nuôi cấy ta thường bổ sung KH;PO¿,
1.2.7.4 Nguôn ngun tơ khống khác
Trang 16thay đổi trạng thái hoá keo của tế bào chất Dưới tác dụng của muối vô cơ, bề
mặt tế bào không ngường thay đổi và dẫn đến làm thay đổi phản ứng enzim trong quá trình trao đối chất Như vậy, có thể nói rằng muối khoáng có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của nằm men
lon Ca””, Mg”” điều chỉnh sự phát triển của tế bào nắm men lon Fe”, Mg”” năm trong thành phần của enzim hoạt động
Ngoài ra, một số nguyên tố vi lượng và các chất kích thích sinh học cũng ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nắm men
1.2.7.5 Nguôn oxi
Có liên quan tới sự tổng hợp các xitocrom Nếu nồng độ oxi là 0,05uM/I thì hệ thống các xItocrom a, b, c, c¡ sẽ vắng mặt Vì vậy, lượng oxI cung cấp có một ý nghĩa hết sức đặc biệt
Khi trong môi trường có oxi nắm men sẽ sinh trưởng tăng sinh khối Khi trong môi trường không có mặt oxi nắm men sẽ tiến hành lên men
1.2.8.Các yếu tố ảnh hướng tới quá trình lên men
1.2.8.1 Ảnh hướng cúa nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát trién cua nam men và chất lượng của vang
- Nhiệt độ < 20°C: sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp - Nhiệt độ < 10°C: không diễn ra quá trình lên men
- Nhiệt độ ở 35°C: nguy hiểm cho quá trình lên men, nắm men không chết
nhưng mất tác dụng
- Nhiệt độ > 35°C: quá trình lên men dừng lại, lượng đường sót cao, vi khuẩn
hoạt động, đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hoá đường thành axIt axetic gây chua, giảm chất lượng vang
Nhiệt độ thích hợp nhất cho nắm men phát triển là 26-28°C[7]
1.2.8.2 Anh hưởng của nông độ côn
Trang 17quá trình lên men luôn sinh ra cồn Nếu nồng độ cồn cao sẽ làm tê liệt hoạt động sống của tế bào nắm men, ức chế, kìm hãm quá trình đồng hoá hydratcacbon và nito [7]
1.2.8.3 Anh hướng của pH
pH ở các mức khác nhau thì quá trình lên men diễn ra với tốc độ khác nhau pH = 2,3 thi qua trình lên men yếu, pH = 6,5-7,5 thì quá trình lên men dừng lại Đối với quá trình lên men vang một số loại quả pH thích hợp từ 4,0-4,5 [7] 1.2.8.4 Ảnh hưởng của hàm lượng giỗng
Hàm lượng tế bào nắm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian nhân giống và lên men sẽ kéo dài hơn, dễ bị nhiễm khuẩn, ngược lại hàm lượng
men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lên men sẽ ngắn hơn, hạn
chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nắm men Nhưng hàm lượng men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trường lên men và sẽ không có lợi cho quá trình lên men và chất lượng rượu vang [7]
Nhìn chung hàm lượng nắm men giống thích hợp nhất trong dịch lên men từ 4-10 triệu tế bào/1ml địch lên men
1.2.8.5 Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Hàm lượng đường phù hợp cho quá trình lên men vang là 12-25%.Hàm lượng
đường 30%V sẽ ức chế quá trình lên men Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi hàm lượng đường trong dịch lên men tăng thì hàm lượng axIt axetic trong vang
cũng cao Mặt khác tỉ lệ các loại đường có trong dịch lên men cũng ảnh hưởng
không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả đã cho thấy: glucoza là loại đường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển
của tế bào nắm men cũng như quá trình tạo rượu, tiếp đó là đường fructoza và đường sacaroza Vì vậy quả có chứa hàm lượng đường khử càng cao càng có
lợi cho quá trình lên men và chất lượng của vang thành phẩm [7]
Trang 18Nồng độ oxy hoà tan giữ vai trò quan trọng không chỉ đối với sự sinh sản và phat trién tối đa của nằm men mà còn quyết định đến hiệu suất lên men và chất lượng của vang Trong điều kiện lên men rượu, các đường đơn glucoza, fructoza sẽ được phân giải theo con đường EMP và chu trình ATC, tiếp đó là chuỗi hô hấp hoạt động, khi nắm men thu được nhiều năng lượng, sinh khối trong dịch lên men cũng tăng, môi trường cũng dần chuyên sang kị khí và nắm men chuyển sang lên men rượu, do đó sản phẩm của quá trình lên men rượu bao gồm: etanol,
CO;¿, sinh khối, các axit hữu cơ và các sản phẩm phụ khác Do đó, việc cung
cấp oxy cho quá trình lên men vang không chỉ đáp ứng yêu cầu sinh sản và phát triển mạnh của nắm men mà còn làm mất đi một số sản phẩm lên men không cần thiết
-Khi môi trường có đầy đủ oxy thì nắm men sẽ sử dụng đường làm nguồn năng lượng tăng sinh khối
-Khi môi trường thiếu oxy thì nắm men lại tiến hành hô hấp kị khí và chuyên
thành rượu
Trang 19NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYEN LIEU, THIET BI, HOA CHAT
2.1.1 Nguyên liệu chính
- Quả táo mèo thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái và Sơn La
- Dịch táo mèo được sử dụng làm các môi trường phân lập, tuyển chọn giống
nam men, môi trường nghiên cứu một số đặc tính sinh học của nẫm men đồng
thời cũng chính là nguyên liệu để nghiên cứu lên men vang táo mẻo
2.1.2 Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1 Hoá chất
Một số hoá chất được sử dụng: MgSO„,KH;PO¿, (NH¿);SO¿, axit xItric (hang:
FENXICHUN-Trung Quốc), K;S;O: (hãng: BATOL-của C.H Pháp), các loại muối nitrat, các loại đường (hãng: BDH-Anh)
2.1.2.2 Thiết bị
H6p petri, ống nghiệm, đường kế Đức, tủ sấy, tủ lạnh sâu, buồng cấy vô
trùng, buồng đếm Goriaev, máy đo pH, máy quang phô kế, máy ly tâm, kính
hiển vi quang học Nikon Nhat, nồi khử trùng cao áp, máy lắc ôn nhiệt,
2.1.3 Các loại môi trường
Trang 201 Duong glucoza : 50g 2 Pepton : 3g 3 MgSO, 7H,O : 0,58 4 KH,PO, : lg 5 (NH¿);SO¿ : lg 6 Nước : 1000ml
2.1.3.3 Môi trường lên men (môi trường 3)g/I 1 Dịch siro hoa quả : 200ml 2 MgSO,.7HO : 0,5g 3 KH;PO¿ : lg 4 (NH4)2SO, : lg 5 Nước 1000ml 2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Các phương pháp vỉ sinh
Nguồn nắm men được chúng tôi sử dụng phân lập và tuyên chọn để nghiên cứu lên men vang táo mẻo là từ thiên nhiên và được tiến hành theo các bước cơ bản sau:
2.2.1.1.a Tạo nguôn giỗng nắm men để phân lập và tuyến chọn
Nguyên liệu dùng để sản xuất rượu vang ở đây là các loại quả táo mèo (quả sơn tra) Táo mèo được thu hoạch vào tháng 6, tháng 7 Quả thu hoạch về cần phải được chọn lay các quả đã chín, loại bỏ các quả non, quả dập nát thối rữa Quả đã chọn đem rửa sạch bằng nước đạt tiêu chuẩn vệ sinh rồi để ráo nước Sau đó cho vào các ang thùng ngâm đường theo tỉ lệ 1:1 Qua tao méo ta khia cac đường nhỏ quanh quả Khoảng hai ngày khuấy trộn một lần Sau một tháng ta thu được một thứ siro nước quả có nồng độ đường khoảng 60-80 % và nhiều
dưỡng chất khác được chiết ra từ thịt quả
Theo dõi dịch lên men phân tích nông độ cồn trong dịch quả lựa chọn mẫu có độ cồn bằng 10% V lam nguồn cung cấp nam men để tiến hành phân lập
Trang 21Pha loãng dịch quả bằng nước đảm bảo vệ sinh cho đến khi đạt nồng độ
đường 20% Dịch pha lỗng được sunft hố bằng K;S;O; với liều lượng thích hợp để không giết chết nắm men thuần chủng Sau đó để lên men tự nhiên ở
nhiệt độ 26 - 28 °C, đến ngày lên men thứ 3-5 chúng tôi lấy khoảng 5-10ml dịch đang lên men đem pha loãng ở các nồng độ khác nhau: 10”, 10”, 10”, 10, 10 ” 10”” Từ mỗi ống nghiệm chứa dịch pha loãng ta lẫy 1 giọt, dùng bàn trang
trải đều trên hộp lồng có chứa môi trường Hansen rồi để trong tủ âm 26 - 28°C
trong khoảng thời gian 2 - 3 ngày [6] Từ các hộp lồng này ta lựa chọn lẫy các
khuẩn lạc to, trơn, nhấn, bóng, sáng đem cây riêng rễ vào các ống thạch
nghiêng, nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng tuyến chọn 2.2.1.2 Dém số lượng té bao nam men
Phương pháp đếm số lượng tế bào dùng để xác định mật độ tế bào trong môi
trường nuôi cây là phương pháp đơn giản, thuận tiện, cho kết quả nhanh Dụng cụ để đếm số lượng tế bào là buồng đếm hồng cầu Thoma- Goriaev có cầu tạo là
một khung đếm bằng phiến kính bao gồm 400 ô vuông nhỏ với tổng thể tích của
buông đếm là = 0,1m
Việc đếm số lượng tế bào nẫm men có trong môi trường nuôi cấy được thực hiện đúng theo nguyên tắc đếm số lượng hồng cầu trong máu
2.2.1.3 Phương pháp hoạt hoá giống
Các khuẩn lạc được chọn sẽ được cây vào thạch nghiêng để ở 26-28°C trong
vòng 24 giờ được giống cấp 1 Nam men được lấy từ thạch nghiêng để đưa vào
dịch lên men Để có số lượng nắm men lớn và có những tế bào trẻ, to khoẻ, chúng tôi tiến hành hoạt hoá giống bằng cách nuôi trong môi trường nhân giống ở 26-28°C trong 24 giờ trên máy lắc, được giống cấp 2 Dùng giống cấp 2 để lên men
2.2.1.4.Xác định hoạt lực lên ren
Chúng tôi xác định hoạt lực lên men của nắm men thông qua việc xác định
hàm lượng CO; được sinh ra ( g/1 địch lên men ) khi tiến hành lên men trong các
Trang 22Trong một số trường hợp khi nghiên cứu về nắm men ở giai đoạn nhân giống
hoặc lên men vang chúng tôi kết hợp phân tích hàm lượng côn và đường sót để
xác định hiệu suất lên men, nếu hiệu suất lên men càng cao thì hoạt lực lên men
của nắm men được đánh giá càng tốt
Hiệu suất lên men được tính bằng công thức: Vị N= — x 100% Vit Trong đó N: Hiệu suất lên men V+r : Nồng độ côn thực tế ( %m)
Vir : Nong độ cồn tính theo lý thuyết
2.2.1.5 Quan sát hình dạng tẾ bào trên kính hiển vi
Tế bào nắm men được nhuộm don bang cach: lay một lượng nhỏ tế bào từ ống thạch nghiêng, dàn đều lên lam kính có chứa một giọt nước cất sau đó cố định vết bôi bằng cách hơ lên ngọn lửa đèn côn Nhỏ 1-2 giọt xanhmetilen lên vết bôi, để trong khoảng 2-3 phút rồi rửa lại bằng nước cất Cuối cùng hơ trên ngon lửa đèn cồn, để khô rồi quan sát hình thái tế bào nẫm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần
2.2.1.6 Xác định khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng của chủng nắm men được xác định bằng tốc độ lắng của sinh khối phương pháp này được tiến hành như sau: hoà sinh khối nắm men vào
dung dịch đệm axetat (có pH=4,5) được đựng trong các ống nghiệm có hình
dạng và kích thước như nhau với thể tích của dung dịch đệm và số lượng nắm men hoàn toàn bằng nhau Lắc kỹ trên máy với tốc độ 200 vòng/phút trong thời
gian 3-5 phút, để lắng 15 phút, lúc này toàn bộ khối địch phân thành 2 lớp ( phía
Trang 23chủng nắm men Ông nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nắm
men có độ kết lăng tốt nhất
2.2.1.7 Xúc định tên khoa học của chúng nấm men
Chúng tơi sử dụng khố phân loại của Lodder (1970) để xác định tên khoa học của chủng nắm men do chúng tôi phân lập và tuyển chọn được đề lên men vang táo mèo thông qua các tiêu chí cơ bản
- Đặc điểm sinh học ( cau tao, hình thái, sinh lý, điều kiện hình thành túi
bào tử và số lượng bào tử )
- — Khả năng đồng hoá cacbon
- Khả năng đồng hoá các loại muối nitrat
2.2.2.Phương pháp hoá học
- _ Xác định hàm lượng đường bằng đường kế - Xác định độ pH bằng máy đo pH và giấy đo pH
- — Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ dung dịch
NaOH 0,1N Từ số ml NaOH 0,1N dùng dé chuẩn ta suy ra hàm lượng
axit dịch lên men
- Xác định hàm lượng cồn bằng côn kế hoặc bằng phương pháp hoá học
2.2.3 Phương pháp tốn học
Chúng tơi tiến hành xử lý kết quả thu được bằng phương pháp thống kê toán học qua các thông số sau:
2.2.3.1 Giá trị trung bình số học:
Nn M,
M => i=l 0
Trong đó M: trung bình tông thể
X; : gid tri của mỗi kết quả thí nghiệm từ thứ 1 đến thứ n
Trang 242.2.3.2 Độ lệch chuẩn: 5 = «Vir ~My Trong đó: X;: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ thứ 1 đến thứ n M: trung bình tổng thê 2.2.3.3 Hệ số biễn thiên của trung bình tổng thé 5x 100 CV = ——— (%) M Trong do: CV: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể M: trung bình tổng thể õ: độ lệch chuẩn 2.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Ching nam men Saccharomyces tuyén chọn trên đối tượng là quả táo mèo
được thu từ Trạm Tấu (Yên Bái), Sơn La 2.4 DIA DIEM THUC HIEN DE TAI
Phòng thí nghiệm VI sinh-CNSH, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Phòng thí nghiệm VI sinh, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2
2.5 THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐÈ TÀI
Trang 25CHƯƠNG 3
KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 PHÂN LẬP, TUYẾN CHỌN, XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CÚA
CHUNG NAM MEN LEN MEN VANG TAO MEO
3.1.1 Phân lập chúng nắm men có khả năng lên men vang táo mèo
Sau 10 lần phân lập chúng tôi thu được 38 mẫu nắm men Từ số mẫu này tuyến chọn được 4 chủng có đường kính khuẩn lạc lớn hơn 1,5mm, chúng tôi
dùng 4 chủng làm đối tượng nghiên cứu tiếp, các chủng này kí hiệu là TM,
TM;¿, TM;, TM¿,
3.1.2 Tuyến chọn chúng nắm men có khả năng lên men vang táo mèo
Nam men đóng vai trò quan trọng đối với toàn bộ quy trình sản xuất và chất
lượng của vang Nắm men sử dụng lên men rượu vang từ dịch táo mèo phải đạt các yêu cầu sau: [12]
1 Lên men được ở nông độ đường và nồng độ axit khá cao
2 Có hiệu suất lên men cao
3 Có khả năng kết lăng tốt và làm trong sản phẩm
4 Tao được hương thơm đặc trưng và không có vị lạ, không sinh độc tố
5 Ôn định lâu dài trong sản xuất
3.1.2.1 Sơ bộ tuyễn chọn chúng nắm men để lên men vang táo mèo
Sau khi đã phân lập được 4 chủng nam men ( theo phương pháp đã nêu trên) chúng tôi tiếp tục các bước tiếp theo để tuyến chọn chủng nắm men phù hợp với
yêu cầu đã đề ra ( mục 3.1.2) bằng các phương pháp sau
3.1.2.1.a Thứ khả năng phát triển của ching nam men
Môi trường chúng tôi dùng để thử khả năng sinh trưởng và phát triển của 4 ching nam men thu được là môi trường dịch siro táo mèo có bố sung nước chiết giá đỗ xanh Môi trường nuôi cấy sau khi được khử trùng được đưa vào các bình
tam giác 250 ml và đặt lên máy lắc ôn nhiệt (26-28°C) tốc độ 150 vòng /phút
Trang 263.1.2.1.a và đồ thị 3.1 Tốc độ sinh sản trung bình của các chủng nắm men trong
1 giờ được tính bằng công thức: v = “
Trong đó v - tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men trong 1 gid
dx: s6 té bdo nam men tăng thêm trong 1 mỉ dịch ( từ thời điểm t¡ đến t› ) dt : thời gian nuôi cấy ( đt = †; - tị)
Bảng 3.1.2.1 a Khả năng sinh trưởng và phát triển của 4 chúng nẫm men
Thời Ching nam men x 10°tb/ml
gian ( giờ ) TM, TM, TM; TM, SLTBxItriệu/ml 7 0° 3,24+1,1 | 3,2+1,1 3,2+1,1 3,2+1,1 18) 16; 4 3,5+1,1 3,6+1,1 7+1,1 3,6+1,1 14 gt 6,2+1,1 5,4+1,1 10+1,1 6,4+1,1 42 12" 8,4+1,1 12+1,1 20,7541,1 | 14,841,1 40: 16" 87,25+1,1 | 65+1,1 100+1,1 102+1,1 g4 20° 16+1,1 147,5+1,1 | 205+1,1 210+1,1 6- 24" 245+1,1 305+1,1 390+1,1 405+1,1 4: 28ˆ 250+1,1 312+1,1 396,6+1,1 | 505+1,1 2: 32" 248+1,1 310+1,1 390+1,1 498+1,1 0: ™1 TM2 TM3 TM4
Biểu đô 3.1 Tốc độ sinh sản trung
binh cia bon ching nam men
Két qua thi nghiém cho thay:
Chủng có tốc độ sinh sản trung bình cao nhất là chủng TM¿ Chủng có tốc độ sinh sản trung bình thấp nhất là chủng TM;
3.1.2.I.b Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao
Các chủng nấm men được lên men trong môi trường dịch sirô táo mèo có
hàm lượng đường 240 g/I Đây là hàm lượng đường thường được dùng cho lên
Trang 27Bảng 3.1.2.I.b Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao Chỉ tiêu đánh giá Don | Chung nam men vi TM, TM; TM; TM, Đường tông số g/l 75 70 65 50 Đường khử g/l 0,75 0,7 0,65 0,45 Độ côn %V |9,76 9.84 10,51 | 11,17 Hiệu suấtlênmen | % 76,2 76,6 81,9 87,06
3.1.2.1.c Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau
Khả năng lên men của các chủng nắm men ở một số độ pH khác nhau được chúng tôi tính bằng số gam CO;z/lit môi trường Môi trường nghiên cứu là dịch siro táo mèo có bố sung cao men và được pha loãng dé đạt nồng độ đường là 20% Tiến hành lên men trong các bình tam giác ở quy mô 150 ml với thời gian là 36" Chúng tôi thu được kết quả sau Các chủng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt và đạt số lượng tế bào cực đại sau 28 giờ nuôi cấy Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.2 l.c
Bảng 3.1.2.1.c Thứ hoạt lực lên men của bốn chúng nắm men STT |Chủng | Độ pH 3,4 3,8 4,2 4,5 4,8 3,2 1 TM; + + + ++ ++ ++ 2 |TM;ẹ + ++ ++ +++ ++++ |++++ 3 TM: ++ ++ +++ ++++ ++++ |++++ 4 |TM_ |++ |+++ |++++ |++++ ++++ |++++
Trong đó + + + +: Ham lương CÓ; được tạora > 32g/Ï dịch lên men + + +: Ham lượng CO; được tạo r2a trẻ 16z24g/l dịch lên men
+l6g/I dịch lên men
< &g/Ï dịch lên men ++: Ham lượng CO; được tạo ra từ
+ : Hàm lượng CO; được tạo ra Từ kết quả thu được cho thấy rằng:
Các chủng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong khoảng pH từ
Trang 283.1.2.1.d Khả năng kết lắng của ching nam men
Hoà sinh khối nam men thu được vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy
với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 3-5 phút và để lắng 15 phút Chúng tôi
thu được kết quả sau:
Bảng3 1.2.1.d Khả năng kết lắng của bốn chủng nấm men Tên chủng TM, |TM; | TM; | TM, Chiêu cao cột sinh khôi (mm) | 14 16 17,5 | 18 Theo kết quả ở bảng trên, chủng có khả năng kết lắng tốt nhất là TM¿, tiếp theo là các chủng TM:, TM; và kém nhất là chung TM)
3.1.2.1.e Khả năng tạo hương thom và độ trong sản phẩm
Sau khi kết thúc lên men được 30 ngày, chúng tôi tiến hành xác định khả năng
tạo hương thơm bằng phương pháp cảm quan và xác đinh độ trong sản phẩm ở OD 600 nm Chúng tôi thu được kết quả dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.1.2.1.e Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm của bốn chúng nắm men TT | Chỉ tiêu đánh | Chủng gia TM, TM) TÌM: TM, 1 D6 duc (OD ) | 0,08 0,12 0,98 0,033 2 Huong thom | Thơm Itthom |Ítthơm | Thơm Kết quả phân tích cho thây: hai chủng TM; và TM¿ đạt độ trong và hương thơm tốt hơn các chủng TM; và TM¡ Tổng hợp các kết quả nghiên cứu của 4 chủng nắm men, chúng tôi thu được kết quả bảng sau Bảng 3.1.2.1.g Tổng hợp kết quả tuyển chọn chúng nắm men TT | Chỉ tiêu đánh giá Chủng TM, |TM; |TM; TM,
1 Kha nang phat trién 1 2 3 4
2 Hiệu suất lên men 1 3 2 4
3 Khả năng lên men 6 pH thap 4 1 2 3
4 Độ trong của sản phâm 3 l 2 4 5 Hương thơm của sản phẩm 2 3 l 4 6 Đánh giá chung 3 1 2 4
Tông điểm 14 11 12 23
Trang 29
Chủng đạt số điểm cao nhất là chủng TM¿, vì vậy chúng tôi quyết định
chọn chủng TM¿ cho các nghiên cứu tiếp theo
3.1.3 Xác định tên khoa học của chủng TM,
Việc xác định tên khoa học đối với chủng nắm men TM¿ được chúng tôi tiễn hành theo hai phương pháp:
Thứ nhất: Dựa vào đặc tính sinh học của chung nam men như
- _ Khả năng lên men các loại ẩưởng - _ Khả năng đơng hố các muối nitrat
- Quan sat hình dạng tế bào trên kính hiển vi Thứ hai: Nghiên cứu phân loại nắm men bằng phương pháp phân tử *Phương pháp thứ nhất
3.1.3.1 Hình thái tế bào và khuẩn lạc
Khuẩn lạc của chủng nắm men TM¿ cấy trên môi trường M;(sau 3-4 ngày) là những khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng, viền xung quanh nhẫn (hình3 l)
Chủng nắm men TM¿ bao gồm các tế bào có hình ovan (hoặc hình trứng), có kích thước tế bào khoảng: (4-7)x(9-12) um (Hình 3.2)
Những đặc điểm của nắm men TM hoàn toàn giống đặc điềm về khuẩn lạc và tế bào của chủng ,§øccharomyces cerevisiae( Š cerevisiae) [7] nói chung Sau
đây là ảnh khuẩn lạc và tế bào chụp trên kính hiển vi quang học x 1000 lần của
Trang 303.1.3.2 Đặc điểm sinh học của chúng TM,
3.1.3.2.a Khả nắng lên men các loại đường
Đề xác định khả năng lên men các loại đường của chủng TM¿ chúng tôi sử dụng phương pháp lên men trong các bình tam giác 250ml bằng cách: cấy chủng
TM, vao 8 môi trường khác nhau (mỗi môi trường ứng với 1 loại đường) với số
lượng tế bào nắm men ban đầu như nhau là 4,8.10”/mI.(bảng 3.1.3.2.a)
Bảng 3.1.3.2.d Khả năng lên men các loại lường của chúng TM,
Loại đường Khả năng lên men | Loại đường | Khả năng lên men D- glucoza ++ Sacaroza + D- Galactoza + Dextrin _ Maltoza + Rafinoza + Melibioza _ Lactoza _ ++; Lén men manh
+; Có khả năng lên men nhưng không mạnh - Không có khả năng lên men
Chủng TM¿ không có khả năng lên men ở các môi trường có chứa đường
Dextrin, Lactoza, Melibioza nhưng có khả năng lên men rất tốt đối với môi trường có đường D- GŒalactoza, Maltoza, Saccaroza
3.1.3.2.b Khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nitơ duy nhất
Để xác đỉnh khả năng sử dụng nitrat của ching nam men TM¿ chúng tôi đã tiến hành nuôi cây chủng TM¿ trên môi trường có thành phần như sau: 1 Glucoza : 20g 2 MgSQO, 7 H,O: 0,5¢ 3 Thach 20g 4 KH,PO, lg 5, Nước cất : 1000ml 6 KNO; : 0,78g
Đồ môi trường vào các ống nghiệm sau đó hấp thanh trùng (không để nghiêng sau khi khử trùng) và bồ trí các thí nghiệm theo 2 lô khác nhau:
+ Lô thứ 1: Mẫu đối chứng
Trang 31Dùng que cấy có đầu nhọn để cấy chủng TM¿ trích sâu vào bề mặt thạch và tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ 2§8-30°c trong thời gian 2-3 ngày
kết quả: Lô thứ 1: không có sự phát triển của chủng TM¿
Lô thứ 2: chủng TM¿ đều phát triển rất tốt trong các ống nghiệm tạo khuẩn lạc rất đặc trưng
Tóm lại: Chủng nắm men TM, không có khả năng sử dụng nitrat làm nguôn nitơ duy nhát
3 l.3 3 Xác định tên khoa học của chúng TM,
Căn cứ và khoá phân loại của Lodder (1970) và các kết quả thí nghiệm đối
voi chung TM, co dac tinh: - Sinh sản nảy chôi nhiều phía
- Tế bào hình trứng, ovan, cầu
- Lên men glucoza mạnh, lên men được hầu hết các loại đường saccaroza,
galactoza, mantoza
- Diéu kién không thuận lợi hình thành 1-4 bào tử, mỗi nang chứa 2 bào tử Từ đó chúng tôi xác định chính xác tên khoa học của chúng nắm menTM, phan ldp tu dich tao méo la Saccharomyces cerevisiaeTM,.( S.cerevisiaeTM,)
* Phương pháp thứ hai
3.1.3.4 Nghiên cứu phân loại nấm men bằng phương pháp phân tir [11]
Cùng với phương pháp phân loại nẵm men bằng xác định hình thái tế bào Chúng tôi tiến hành phân loại nắm men bằng phân tử Cơ sở sinh học của phương pháp này là: những chủng loài có họ hàng với nhau sẽ có trình tự DNA giống nhau Việc giải trình tự DNA và so sánh tìm độ sai khác sẽ cho phép ta định loại và xác định vị trí của chủng nẫm men trong cây phát sinh chủng loài
Phương pháp và kĩ thuật tiến hành
*Quy trình phân loại nấm men bằng phương pháp phân tử:
1 Nuôi cấy nẫm men đề thu sinh khối 2 Tách DNA tổng số
3 Điện di để tách gen
Trang 32Cụ thể các bước: + Nuôi cây nắm men trên môi trường VDP: - 1% (w/v) cao men - 2% (w/v) pepton - 2% (w/v) dextrose
+ Tach DNA tong số: Tiến hành theo thứ tự các bước sau:
- Bước 1: Nuôi cấy tế bào nắm men trong môi trường YDP, nhiệt độ 30°c - Bước 2: Hút dịch nuôi cấy sang ống thuỷ tỉnh nhỏ, ly tâm dịch nuôi cấy
với tốc độ 12000vòng/ phút trong vòng 2 phút, thu lấy cặn tế bào
và thêm vào 5ml nước cất để hoà tan cặn
- Bước 3: Ly tâm tế bào với tốc độ 12000vòng /phút trong vòng 5 phút và loại bỏ phần nổi, hoà tan cặn trong 500 Hl của Lysis Buffer và lắc mạnh, thêm 0,3g hạt thuý tỉnh có đường kính 2mm và lắc
mạnh khoảng 30 giây, thêm 25 pl dich NaCL 5M va lac mạnh
khoảng 30 giây
- Bước 4: Ly tâm trong siêu ly tâm với tốc độ cao nhất trong vòng 2 phút - Bước 5: Di chuyên phần nổi cả cặn sang ống ly tâm sạch
- Bước 6: Thêm 400 ul phenol lắc đều rồi lại ly tâm với tốc độ cao nhất
trong vòng 5 phút, tách thành từng pha, pha cao hơn là pha nước - Bước 7: Giữ pha nước và thêm vào 1 lượng phenol: chloroform, tiếp tục
ly tâm với tốc độ cao nhất trong vòng 5 phút, chiết phenol: loroform giữ pha nước
- Bước 8: Thêm vào 1ml của 95% Ethanol, lắc đều rồi lại ly tâm với tốc độ cao nhất trong vòng 10 phút và loại bỏ đi phần nổi
- Bước 9: Rửa lai bằng Iml Ethanol, lắc đều rồi lại ly tâm với tốc độ cao
nhất trong vòng 6 phút và loại đi phần nỗi
- Bước 10: Giữ cặn DNA trong 50 Hl nước cất, bảo quản ngắn ở 4°C, bảo
quan dai 6 - 20°C
+ Dién di trén gel agarose - thu DNA genom
Trang 33- Bước 1: Đồ gel agarose 1%
Can 1 lugng agarose 1% cho vào bình tam giác có chứa 20ml dung dịch đệm TAE, khuấy đều ngâm khoảng 15 phút Dun cach thuy dung dich gel, lắc nhẹ để hoà tan các hạt agarose, đun nóng chảy hoàn toàn, để nguội
khoảng 50-60°C thì đồ gel, trước khi đồ bô sung 1,5ul thuốc nhuộm Et
brom Đồ gel vào khuôn đã được lắp đặt sẵn, cắm lược vào sao cho lược
ngập trong gel khoảng 1,5mm, đợi cho gel nguội đông cứng ta chuyển gel sang bồn điện đi Đỗ đệm gập gel khoảng 3-5mm, dùng pipet hút rửa giếng
gel
- Bước 2: Nạp DNA vào giếng gel
Dùng pipet 10ul hút 3ul dung dịch DNA tron đều với 2ul dung dich
đệm 6x Sucarose , ding pipet 10ul nap mẫu vào giếng gel thao tác phải
chính xác đề tránh mất mẫu - Bước 3: Chạy điện di
Sau khi nạp gel xong nối dòng điện dẫn vào bồn với nguồn, tiến hành chạy điện di ở 50v trong vòng 60 phút
- Bước 4: Xử lý gel sau khi điện d1
Sau khi chạy điện di gel được lấy ra và soi bằng tia uv, dưới ánh sáng uv ta thấy các giải băng sáng phát huỳnh quang có màu vàng cam Ta quan sát được nhiều giải huỳnh quang có kích thước khác nhau bao gồm: các phan đoạn DNA genom có cùng phân tử gam, các phân tử RNA và các
DNA bị đứt gãy Sau đó tiến hành thu DNA genom từ gel
Đề thu DNA genom ta tiến hành cắt các đoạn gel chứa DNA genom rồi ngâm vào dung dịch đệm thích hợp, DNA sẽ khuyếch tán từ gel ra dung
dịch đệm Sau đó tiến hành tinh sạch DNA dùng để chạy PCR
* Kết quả và kết luận
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết và thu được DNA genom của nẫm men ching TM, phan lap từ dịch táo mèo( Hình 3.3)
Trên đây là những nghiên cứu bước đầu để thu DNA tổng số sử dụng cho các bước tiếp theo trong quy trình giải trình tự của đoạn DNA quy định RNA-
Trang 34Hình 3.3⁄nh chụp gel sau điện di soi trên tỉa uy
Phần nhân gen bằng PCR và đọc gen bằng phần mềm hiện nay đang chờ
đọc kết quả
3.2 ANH HUONG CUA MOT SO NHAN TO TRONG QUA TRINH
NHAN GIONG
Mục đích cơ bản của quá trình nhân giống nắm men để sản xuất vang là: tìm các điều kiện phù hợp với những đặc tính sinh học của chung nam men dé
trong một thời gian nhất định nắm men có thể sinh sản (có số lượng tế bào/ml
dịch nhân giống là nhiều nhất), chất lượng tốt nhất ( tỷ lệ các tế bào trẻ và tế bào
nây chổi nhiều nhất) để đáp ứng quá trình lên men vang
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men
Trong công trình nghiên cứu này chúng tôi nghiên cứu các yếu tố như: KạS;O¿,
cao men, nhiệt độ, pH, oxy hoà tan
3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng K›;Š;O;
Môi trường nhân giống là môi trường 100 % dịch siro táo mèo đã được pha loãng dé đạt nồng độ đường 10%Bx(100g/1) Dich môi trường được đưa vào
các bình tam 250ml rồi bố sung K;S;O; Việc bồ sung K;S›O; có tác dụng tiêu
Trang 35đặt lên máy lắc ôn nhiệt (28-30 ”C) với tốc độ 150 vòng/phút trong thời gian 28
giờ Chúng tôi thu được kết quả dẫn ra ở bảng 3.2.1
Bảng 3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng K›;Š;O; trong quá trình nhân giỗng SLTB Thời gian bỗ sung giống 6,
x10'tb/ml [Sau 6h sunfit hod Sau 12 h bd sunfit hod Thanh tring | Đổi chứng
Hàm 50mg 100mg/1 200mg/1 50mgi 100g1 200mg Omg/1 Omg/1 lượng T | oF 3,2+1,1 3,2+1,1 3,2+1,1 3,2+1,0 3,2+1,1 3,2+1,1 3,2+1,1 3,2+1,1 hye 7,541,1£1,1 5,5+1,2 4,25+1,2 5+1,1 4,5+1,0 4,15+1,3 6,25+1,2 3,5+1,0 ở gt 31,2+1,2 28,1+1,1 15+1,1 27,5+1,1 26,5+1,1 4,5+1,1 15+1,1 5,45+1,1 [12 64,2+1,1 56,5+1,0 29,5+1,1 54,5+1,3 50,2+1,1 7,541,1 29,5+1,1 21,5+1,1 16° 11521,1 120+1,1 58,5+1,3 60,5+1,1 95,5+1,2 84,5+1,3 58,5+1,0 43,5+1,3 * 1908 137+1,0 142+1,1 148+1,1 178+1,1 148+1,1 137+1,1 118+1,1 96,5+1,1 a 24" 172+1,1 178+1,3 155+1,1 165+1,2 145+1,1 135+1,1 155+1,1 175+1,1 n 28" 170+1,1 170+1,1 1470+1,0 162+1,1 148+1,3 130+1,0 150+1,1 172+1,2
Từ bảng cho thấy rằng: Chủng ,Š.cerevisae TM; sinh trưởng tốt trong môi
trường duoc sunfit hoa bang K;%O; với hàm lượng từ 50-100 mg/l Ở môi
trường được sunft hoá với liều lượng lớn hơn đã ức chế sự sinh trưởng của chủng TM¿ Trong trường hợp môi trường không được sunfit hoá thi chủng TM¿
sinh trưởng yếu hơn và môi trường cũng dễ bị nhiễm khuẩn Từ kết quả thu được chúng tôi quyết định sunfit hố mơi trường bằng K;S;O: với liều lượng là
50 mg/l
3.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng cao men
Hàm lượng đạm trong dịch siro của các loại quả thường thấp Vì vậy việc bổ sung cao men trong quá trình nhân giống và lên men là rất cần thiết [9] Chủng nam men TM, được nuôi cấy trong môi trường dịch siro táo mẻo ở nhiệt độ 28 -
30°C trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút Thời gian nuôi cấy là 24 giờ Bồ
sung cao men ở các hàm lượng: 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 6; 8; 10g/1 Chúng tôi thu được
Trang 36Bảng 3.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng cao men bỗ sung trong quá trình nhân giỗng SLTB x10 tb/m1 | Hàm lượng cao men Don vi(g/l) 3 3,5 4 4,5 5 6 8 10 Thời " |3,/2z1I | 3,2£1,1 [3,2£1,1 | 3,241,1 | 3,24147 | 3,241,0 | 3,241,1 | 3,241,3 gian B]3,441,1 |3,45+1,0 [3,441,2 | 3,541,1 | 3,6541,3 | 3,741,1 |3,85+1,0 |3,9+1,1 " |3,6+1,0 | 4,741,1 | 5,9541,1 | 641,1 6,141,1 | 6,2541,1 | 7,5+1,1_ | 7,841, 12° |10,5+1,1 |11+11 | 14/7+1,3 | 16,6+1,1 | 20,9+1,0 | 19,9+1,2 |16+11 | 18,541,0 16 | 2241,1 | 2541,1 | 30,641,1 | 4741,1 | 93447 | 86,341,1 | 8341,2 |145+1,1 20° | 34,741,2 | 40,5+1,2 | 5641,1 | 85.+1,1 | 14541,1 | 15241,3 | 12841,1 | 135+1,1 24" |85+lI | 110#1,1 | 12021,0 | 11241,1 | 14541,2 | 15041,1 | 12041,1 | 137+1,2
Từ kết quả cho thấy số lượng tế bào nắm men tỉ lệ thuận với hàm lượng cao men bố sung Nếu bồ sung cao men với hàm lượng thấp 3-4,5g/1 môi trường thiếu lượng đạm cần thiết tế bào nắm men sẽ sinh sản chậm cụ thẻ là: Sau 24” nuôi cấy số lượng tế bào tăng 85x10 ”tb/ml(ở môi trường bổ sung 3g/1 cao men) và 112 x10 ”tb/ml (ở môi trường bô sung 4,5gø/1 cao men) số lượng tế bào nắm men/ml dịch nhân giống này là nhỏ không đáp ứng được cho quá trình lên men
nên sự sinh trưởng chậm hơn Nhưng nếu bổ sung hàm lượng cao men 8-10g/1 là
quá cao môi trường nhân giống nhiều chất dinh dưỡng khiến tế bào nắm men sinh sản nhanh, môi trường nuôi cấy bị biến đôi và dễ gây lây nhiễm Hơn nữa sự phát triển của nam men cũng thấp hơn so với ở mức cao men 5-6g/I Hàm lượng cao men bố sung hợp lý là từ 5 - 6 g/1 vì ở đây sự sinh trưởng của nam men đạt kết quả cao nhất ở 24 giờ đạt 145-150 x10” tb/ml
Vi vậy trong quá trình nhân giống chúng tôi quyết định bỗ sung cao men vào môi trường dịch siro với hàm lượng 5 - 6 g/l
3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Chủng S.cerevisiae TM¿ được cấy vào môi trường nhân giống có pH 3,8§ với
số lượng giống ban đầu là 3,2 x 10':b/ml, tiếp tục nhân giống nam men trén may
lắc với tốc độ 150 vòng/ phút ở các ngưỡng nhiệt độ: 24, 26, 28, 30, 32, 35, 37
(°C), sau dé tiến hành xác định số lượng tế bào trong khoảng thời gian 4 giờ/lần
Trang 37trưởng của nắm men trong 1 giờ, chúng tôi thu được kết quả được trình bày ở bảng 3.2.3 Bảng 3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình nhân giống SLTB Nhiệt độ x10°tb/ml | 24°C 26°C 28°C 30C 32°C 35°C 37°C TỊ 0 3,2+1,1 3,241,1 | 3,2£1,1 3,2+1,1 3,2+1,1 |3,2+1,1 3,2+1,1 hị 4 3,5+1,2 5,641,1 5,821,1 4,8541,1 | 4941,3 | 5,5+1,0 5+1,15 a] 38 12,541,1 | 15,4410 | 16,5411 | 12,541,0 | 11,5£1,0 | 10,021,1 | 9,541,1 i] 128 16,241,0 | 27411 25,741,2 | 20+1,1 21,2+1,1 | 19,641,2 | 20,741,1 gl 16° 75,5+1,1 | 95+1,0 95+1,0 80+1,1 9341,1 | 85 41,1 70+1,0 1Í 20 110,5+1,1 | 140411 | 15441,1 | 10841,1 |107+z13 |107210 | 101/1 al 245 14041,1 | 155411 | 16241,3 | 14541,0 | 14541,1 | 140+1,1 130+1,3 nl 7g 138211 | 162211 | 160411 | 14041,1 | 140#1,1 | 13841,1 126+1,1
Từ kết quả cho thấy chủng nắm men TM; sinh trưởng và phát triển tốt trong
khoảng nhiệt độ từ 26-28°C đạt trên 160 x 10°tb/ml Ở nhiệt độ trên 30°C tốc độ
sinh trưởng của chủng TM¿ bị giảm không phù hợp quá trình sản xuất, điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Amerine.M.A, Bergh W and Cruess.W khi nghiên cứu trên nắm men nói chung [12 ]
Vì vậy chúng tôi quyết định giữ nhiệt độ cho quá trình lên men của chúng nắm men TM, ở khoảng 26-28°C
3.2.4 Ảnh hướng của pH
Chúng tôi cây chủng nắm men S.cerevisiae TM; với số lượng tế bào ban đầu
là (3,2 + 1,1) x10°tb/ml vào các môi trường của dịch nhân giống có độ pH ở các
mức: 3; 3,3; 3,6; 3,8; 4,2; 4,5; 5,2; 7,2 (dùng axit HCI và NaOH để chỉnh pH) và
Trang 3850 45 40 SLTBx1 35 triệu tb/ml 30 25 20 15 10 5 0 3 3.3 3.6 3.8 4.2 4.5 5.2 7.2 Độ pH Biễu đồ 3.2.4 Số lượng tế bào trung bình sau 28 giờ nuôi cấy ở các giá tri pH khác nhau
Chủng S.cerevisize TM; sinh sản và phát triển tốt trên môi trường nhân giống có độ pH 4,2-4,5 Rõ ràng chúng ta nhận thấy sau 28 giờ nuôi cấy số lượng tế bào nắm men đạt cực đại ở môi trường có pH 4,2-4,5 Chính vì vậy độ
pH thích hợp là 3,8-4,5 bởi khi kiếm tra chất lượng tế bào nẫm men tỉ lệ tế bào
nây chổi là: 70-73%, hơn nữa độ pH này cũng phù hợp với pH của dịch quả Ở các giá trị pH khác chủng nắm men TM¿ sinh sản yếu ớt và khi pH môi trường cao dễ bị nhiễm khuẩn
Vì vậy chúng tôi giữ mức pH thích hợp cho quả trình lên men của chủng nấm
men TM, la 4,2-4,5
3.2.5 Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hoà tan
Trong qúa trình nhân giống hàm lượng O; có ảnh hưởng rất mạnh mẽ đến sự
sinh sản của nắm men Dé nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tô này tới sự sinh sản
Trang 39Bang 3.2.5 Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hoà tan trong
quá trình nhân giống SLTB(x10%tb/ml) | Hàm lương Oz(ng1) 4-6 8 8,25 8,5 8,75 9 Tốc đô lắc(v/phút) | Không lắc | 100 130 150 170 200 Thời gian | 0” 3,2+1,1 3,2+1,1 | 3,2+1,1 3,2+1,1 3,2+1,1 | 3,2+1,1 4" 3,3+1,0 3,4£1,2 | 3,6+1,3 3,8+1,3 4,0 +1,0 | 4,6+1,1 8h 3,5+1,1 4,6+1,1 | 5,8+1,1 7,5+1,1 7,841,1 | 8,2+1,2 12° 4,8+1,2 55+1,0 | 10,0+1,1 | 16+1,3 2141,1 |21+1,0 16" 5,6+1,1 6641,1 | 68,5+1,1 | 70+1,1 75+1,1 | 76+1,1 20" 9,1541,0 | 99+41,1 | 91,241,4 | 88,541,3 [9841,0 | 102+1,1 24" 18,2+1,1 | 109+1,1 | 128+1,1 139+1,1 145+1,1 | 152+1,3 28" 78+1,1 122+1,0 | 135+1,1 140+1,1 15141,1 | 170+1,1
Từ kết qua cho thay ching nam men TM, sinh san mạnh khi ham luong O, hoà tan trong khoảng 8 - 9 mg/1 Ở mẫu đối chứng ( không lắc) chủng TM, sinh sản yếu ớt, môi trường bị nhiễm khuẩn Như vậy việc bố sung O; trong quá trình
nhân giống là hoàn toàn hợp lý Kết quả này cũng phù hợp với các công bỗ của
các tác gia Amerine.M.A, Bergh W and Cruess.W Amerine.M.A, Bergh W and Cruess.W khi nghiên cứu trên nắm men nói chung [12], [13]
3.3 NGHIEN CUU DONG THAI LEN MEN VANG TAO MEO
Động thái lên men vang là quá trình chuyên hoá đường và các hợp chất hữu
cơ có trong dịch quả thành rượu, các axit hữu cơ, vitamin, chất thơm làm cho
vang có hương vị đặc trưng khác hắn nhiều loại rượu khác
Động thái lên men vang là quá trình biến đổi hết sức phức tạp của các hợp chất, ảnh hưởng quyết định đến chất lượng của sản phẩm cuối cùng Trong
phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tập chung nghiên cứu một số biến đổi
cơ bản của một số chất hữu cơ trong quá trình lên men vang táo mèo đó là
những biến đôi của đường, axit tổng số, độ pH, hàm lượng rượu, số lượng tế bào
nắm men thông qua nghiên cứu động thái lên men vang trong 24 giờ đầu và
Trang 403.3.1 Động thái lên men vang trong ngày thứ nhất
Chúng tôi tiến hành lên men vang ở quy mô thí nghiệm trong các bình lên men có dung tích I lít Môi trường lên men là dịch siro táo mèo được pha loãng bằng nước sạch tới nồng độ đường tông số 25% ( 250 g/1) Tiến hành khử trùng
môi trường bằng K;S;O; ( chứa 55% SO; ) với hàm lượng 50 mg/l Sau 6 tiéng
bổ sung K¿S;O; vào môi trường thì tiến hành cấy giống với tỉ lệ 5% v/v ( tương
đương khoảng 12.10” tế bào/ml ) Các bình sau khi cây giống được chuyên vào trong tủ 4m 30°C, gia tri pH khoảng từ 3,8-4,2 Tiến hành phân tích mẫu 4 giờ
một lần trong 24 giờ liên tục, chúng tôi thu được kết quả sau
Bảng 3.3.1 Động thái lên men vang trong ngày thứ nhất Chỉ tiêu Don vi | Thời gian (giờ) 0 4 8 12 16 20 HLcồn %V 0.2540.01 | 0.2640.01 | 0.28+0.01 | 0.340.01 |0.32+0.01 | 0.54+O.O1 HLaxit tổng | g/1 4.6+0.01 | 4.65+0.01 | 4.740.01 4.7640.01 | 4.82+0.01 | 4.9+O.O1 số HL đường | g1 25+0.1 25.540.1 24+0.1 23.5+0.1 23+0.1 22.540.1 tổng số HLđường g/l 62.6+0.02 | 61.5+0.02 | 60.0+0.02 | 59.8+0.02 | 58.2+0.02 | 57.840.02 khử pH 3.840.1 4.0+0.1 4.01+0.1 3.95+0.1 4.0+0.1 3.8440.1 SL té bao X10°/ml | 1241.1 1641.1 3841.1 4841.1 8241.1 16041.1
Kết quả cho thấy : trong nửa ngày đầu tiên hàm lượng đường giảm chậm, số
lượng tế bào nằm men tang dan, ham lượng etylic có tăng nhưng rất ít, các thông số khác có biến đổi nhưng không rõ rệt Theo chúng tôi nửa ngày đầu tiên là thời
gian nắm men làm quen với môi trường, một số nắm men đề kháng yếu với SO;
sẽ bị tiêu diệt Những nắm men thích nghi hơn sẽ tồn tại và sinh sản nên điều này đã dẫn đến hiện tượng trong nửa ngày đầu tiên số lượng tế bào nắm men tăng lên chậm chạp, các thông số khác biến đổi không nhiều là do lúc này nắm men đang thực hiện sinh sản là chủ yếu