Chọn lựa môi trường dinh dưỡng cho việc tạo màng BC của vi khuẩn acetobacter xylinum BHN2

Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công M U Lý chn ti Mng BC cú bn cht l cellulose liờn kt vi cỏc t bo vi khun A.xylinum Do vy, mng BC va cú cu trỳc v c tớnh c hc rt ging vi cellulose thc vt nhng li cú thờm mt s c tớnh húa lý c bit nh: bn c hc cao, ng kớnh c hc nh, tinh khit cao, tớnh n hi ln, kh nng thm hỳt nc nhanh, kh nng polyme húa ln Trờn th gii mng BC ó c ng dng rt nhiu cỏc lnh vc cụng ngh khỏc nh: cụng nghip thc phm, y hc, cụng ngh m phm, khoa hc vt liu Trong nhng nm gn õy phũng thớ nghim Thc vt - Vi sinh khoa Sinh trng i hc S phm H Ni ó phõn lp tuyn chn c chng A.xylinum BHN2 cú kh nng to mng BC vi nng sut v cht lng tt Tuy nhiờn, cha cú c mụi trng thớch hp cho quỏ trỡnh to mng BC nờn nng sut v cht lng mng BC vi khun A.xylinum BHN2 to cha cao v cha n nh Xut phỏt t thc t ũi hi phi tỡm c mụi trng dinh dng phự hp nht cho quỏ trỡnh to mng BC ca vi khun A.xylinum BHN2, tụi quyt nh tin hnh thc hin ti nghiờn cu : Chn la mụi trng dinh dng cho vic to mng BC ca vi khun Acetobacter xylinum BHN2 Mc ớch nghiờn cu Nghiờn cu nh hng ca mt s yu t dinh dng n quỏ trỡnh hỡnh thnh mng BC ca vi khun A.xylinum BHN2 T ú tỡm c mụi Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công trng dinh dng thớch hp cho quỏ trỡnh to mng ca vi khun A.xylinum BHN2 í ngha khoa hc ca ti Tỡm c mụi trng dinh dng ti u nht v kinh t nht cho s to mng ca vi khun A.xylinum BHN2 T ú to c s cho vic ng dng sn xut mng BC trờn quy mụ cụng nghip vi giỏ thnh r v hiu qu cao Ni dung cn tin hnh - Nghiờn cu nh hng ca cỏc ngun ng v nng ng n quỏ trỡnh to mng BC ca vi khun A.xylinum BHN2 mụi trng nuụi cy tnh - Nghiờn cu nh hng ca cỏc ngun nit v nng nit n quỏ trỡnh to mng BC ca vi khun A.xylinum BHN2 mụi trng nuụi cy tnh - Nghiờn cu nh hng ca nng hp cht phospho n quỏ trỡnh to mng BC ca vi khun A.xylinum BHN2 mụi trng nuụi cy tnh - Nghiờn cu nh hng ca vic b sung nng axit axetic v ru etylic n quỏ trỡnh to mng BC ca vi khun A.xylinum BHN2 mụi trng nuụi cy tnh Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công NI DUNG CHNG 1: TNG QUAN TI LIU 1 V trớ phõn loi v c im hỡnh thỏi ca A.xylinum Theo h thng phõn loi ca nh khoa hc Bergey thỡ A.xylinum thuc ging Acetobacter, h Pseudomonadaceae, b Pseudomonadales, lp Schizommycetes [4] A.xylinum thuc nhúm vi khun acetic, l loi vi khun to c nhiu BC nht t nhiờn Mi t bo A.xylinum cú th chuyn húa 108 phõn t glucose thnh cellulose gi [21, 27] A.xylinum cú dng hỡnh que, thng hay hi cong, cú th di ng hay khụng di ng, khụng sinh bo t Chỳng l vi khun Gram õm, nhng c im nhum Gram cú th thay i t bo gi i hay iu kin mụi trng Chỳng cú th ng riờng l hay xp thnh chui Trờn mụi trng thiu thc n hoc mụi trng ó nuụi cy lõu, A.xylinum d dng sinh nhng t bo cú hỡnh thỏi c bit (t bo cú th phỡnh to hoc kộo di, ụi li cú dng phõn nhỏnh) T bo thng c tỡm thy nhiu dch hoa qu, gim, dch ru, t[7] Hỡnh 1.1 Vi khun A.xylinum Khun lc ca A.xylinum cú kớch thc nh (ng kớnh khun lc t - 2mm), trũn, b mt nhy v trn búng, phn gia khun lc li lờn, dy hn v sm mu hn cỏc phn xung quanh, rỡa mộp khun lc nhn Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công 1.2 c im sinh lý, sinh húa ca A.xylinum Vi khun A.xylinum phỏt trin nhit 25 - 350C, pH = [4] Vỡ A.xylinum cú kh nng chu c pH thp nờn ngi ta thng b sung thờm acid acetic vo mụi trng nuụi cy hn ch s nhim khun l [11] Cỏc c im sinh hoỏ dựng nh danh ca A.xylinum bao gm: Oxy hoỏ ethanol thnh acid acetic, CO2, H2O; Phn ng catalase dng tớnh; Khụng tng trng trờn mụi trng Hoyer; Chuyn hoỏ glucose thnh acid; Chuyn hoỏ glycerol thnh dihydroxyaceton; Khụng sinh sc t nõu; Tng hp cellulose [11] 1.3 Bacterial cellulose (BC) 1.3.1 Cu trỳc BC cú ng kớnh bng 1/100 ng kớnh ca cellulose thc vt (PC plant cellulose) Mng BC c cu to bi chui polyme -1,4 glucopynanose Cú thnh phn hoỏ hc ng nht vi cellulose thc vt, nhng cu trỳc v c tớnh li khỏc xa [30] Chui polyme -1,4 glucopynanose mi hỡnh thnh liờn kt vi to thnh si nh (subfibril) cú kớch thc 1,5nm Nhng si nh kt tinh to si ln hn - si v mụ ( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), nhng si ny kt hp vi to thnh bú v cui cựng to di ribbon (Yamanaka et.al 2000) Di ribbon cú chiu di khong t - 9nm Nhng di ribbon c kộo t t bo ny s liờn kt vi nhng di ribbon ca t bo khỏc bng liờn kt hiro hoc lc Van Der Waals to thnh cu trỳc mng li hay mt lp mng mng trờn b mt mụi trng nuụi cy [21] 1.3.2 Mt s tớnh cht ca mng BC A.J Brown (1986), ó nghiờn cu lp mng c vi khun A.xylinum Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công to trờn mụi trng nuụi cy v thy cú bn cht l hemicellulose Hemicellulose l nhng polysaccharid khụng tan nc nhng tan dung dch kim tớnh [7, 21] Mt s tớnh cht ca mng BC: tinh sch: Mng BC cú tinh sch tt hn rt nhiu so vi cỏc cellulose khỏc, cú th phõn hy sinh hc, tỏi ch hay phc hi hon ton bn c hc: Mng BC cú bn tinh th cao, sc cng ln, trng lng thp, n nh v kớch thc Tớnh hỳt nc: Mng BC cú kh nng gi nc ỏng k (lờn n 99%), cú tớnh xp, m cao 1.3.3 Quỏ trỡnh tng hp BC t vi khun A.xylinum Khi nuụi cy vi khun A.xylinum mụi trng cú ngun dinh dng y (ch yu l carbohydrate, vitamin B1, B2, B12 v cỏc cht kớch thớch sinh trng), chỳng s thc hin quỏ trỡnh trao i cht ca mỡnh bng cỏch hp th dinh dng t mụi trng bờn ngoi vo c th, mt phn c th sinh trng v phỏt trin, mt phn tng hp cellulose v thi mụi trng Ta thy cỏc si t nh phỏt trin ngy cng di hng t ỏy lờn b mt mụi trng nuụi cy [16] Thiaman (1962) ó gii thớch cỏch to thnh cellulose nh sau: Cỏc t bo A.xylinum sng mụi trng lng s thc hin quỏ trỡnh trao i cht ca mỡnh bng cỏch hp th ng glucose, kt hp ng vi acid bộo to thnh tin cht nm mng t bo Tin cht ny c tit ngoi nh h thng l nm trờn mng t bo cựng vi mt enzyme cú th polymer húa glucose thnh cellulose [29] Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công Hỡnh 1.2 Quỏ trỡnh tng hp cellulose t bo vi khun A.xylinum Quỏ trỡnh sinh tng hp BC l mt tin trỡnh bao gm nhiu bc c iu ho mt cỏch chuyờn bit v chớnh xỏc bng mt h thng cha nhiu loi enzyme, phc hp xỳc tỏc v cỏc protein iu hũa ( hỡnh 1.3) Cỏc enzyme tham gia vo quỏ trỡnh sinh tng hp BC vi khun A.xylinum bao gm : 1PFK: Fructose-1-phosphate kinase PGI: Phosphoglucoisomerase PGM: Phosphoglucomutase PTS: H thng phosphotransferrase UGP:UDP-glucose pyrophosphorylase Fru-bi-P:Fructose-1,6bi-phosphate Fru-6-P: Fructose-6-phosphate Glc-6-P: Glucose6-phosphate Glc-1-P: Glucose-1-phosphate PGA: Phosphogluconic acid acid Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công UDPGlc: Uridine diphosphoglucose CS: Cellulose synthase GK: glucokinase FK: fructokinase FBP: fructose -1,6 - biphosphate phosphatase G6PDH: glucose - phosphate dehydrogenase Hỡnh 1.3 Con ng chuyn húa cỏcbon vi khun A.xylinum 1.3.4 Chc nng ca cellulose i vi vi khun A.xylinum Mng BC nm mt thoỏng ca mụi trng nuụi cy cú tỏc dng nh mt lp bo v cho cỏc t bo vi khun A.xylinum trc cỏc nhõn t cú hi Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công ca mụi trng Cú nhng ghi nhn rng cellulose bao quanh t bo vi khun bo v chỳng tia cc tớm Khong 23% s t bo A.xylinum c bao bc bi BC sng sút sau gi x lớ bng tia cc tớm Khi tỏch BC t bo, kh nng sng ca chỳng gim ỏng k, ch cũn 3% [29] Ngoi ra, mng BC cũn l giỏ th chng cho cỏc t bo vi khun ng thi cng giỳp chỳng ly cht dinh dng t mụi trng mt cỏch d dng hn so vi mụi trng lng khụng cú mng li cellulose [21] 1.4 Cỏc yu t nh hng n quỏ trỡnh to mng BC 1.4.1 Ngun cỏcbon Cỏcbon cú t bo cht, thnh t bo, tt c cỏc phõn t enzim, axit nucleic v cỏc sn phm trao i cht Chớnh vỡ vy, nhng hp cht hu c cú cha cỏcbon cú ý ngha hng u i sng ca vi sinh vt nh hng ca ngun cỏcbon n nng sut sn xut mng BC c th hin bng 1.1 Bng 1.1 nh hng ca ngun cỏcbon n nng sut sn xut mng BC Nng sut Ngun cỏcbon tng hp Disaccharide cellulose Nng sut tng hp cellulose D-Glucose 100 Lactose 16 D-Fructose 92 Maltose D-Galactose 15 Sucrose 33 D-Xylose 11 Cellobiose 7-11 D-Arabinos 14 D-Sorbose 11 Ngun cỏcbon Monosaccharide Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công 1.4.2 Ngun nit í ngha ch yu ca ngun nit l cung cp cho c th sinh vt nguyờn liu hỡnh thnh cỏc nhúm amin (-NH2 v -NH-) cỏc phõn t aminoacid, nucleotit, cỏc baz d vũng v cỏc hp cht húa hc nguyờn sinh cht [4] Ngun nit d hp th nht i vi vi sinh vt l NH3 v NH4+ Vi sinh vt cú kh nng ng húa rt tt nit cha cỏc thc n hu c Do ú nuụi cy vi khun A.xylinum ngi ta thng s dng ngun nit vụ c l (NH4)2SO4 , NH4NO3, ngun nit hu c l peptone, cao tht, cao nm men [4] Mụi trng c bn cho cỏc nghiờn cu v BC l mụi trng Hestrin v Scharamm thit lp [29] 1.4.3 Ngun dinh dng khoỏng Phospho bao gi cng chim t l cao nht s cỏc nguyờn t khoỏng ca t bo vi sinh vt Phospho cú mt hu ht cỏc thnh phn ca t bo m bo ngun dinh dng phospho, ngi ta s dng cỏc loi phospho vụ c nh KH2PO4, K2HPO4, KNO3[4] Vic b sung phosphat (nht l phosphat kali) vo cỏc mụi trng dinh dng cũn cú tỏc dng to tớnh m ca mụi trng [4] Ngoi cũn nhiu nguyờn t vi lng cng cú vai trũ nh hng n sinh trng ca vi khun A.xylinum v quỏ trỡnh hỡnh thnh mng BC nh Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl Nu thiu mt s cỏc nguyờn t vi lng thỡ vi khun A.xylinum khụng th sinh trng v phỏt trin bỡnh thng c Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công i vi A.xylinum nguyờn liu ch yu hin c s dng l nc da gi, dch hoa qu, r ng thỡ nuụi cy khụng cn phi b sung cỏc nguyờn t vi lng na [4] 1.4.4 Cỏc cht kớch thớch sinh trng Cỏc vitamin pyrodoxine, acid nicotinic, paminobenzoic acid (pABA), biotin c xỏc nh l cn thit cho s tng trng t bo v tng hp cellulose, pantothenate v riboflavin cho kt qu ngc li [23] Nc da gi l ngun nguyờn liu ch yu c s dng nuụi cy A.xylinum thu mng BC Tựy theo ging da, tui ca qu da m cỏc thnh phn hoỏ hc nc da cú khỏc Lng ng kh tng v protein nc da tng lờn da cng chớn (cao nht l vo thỏng th 9, sau ú gim dn) ng õy cú th l glucose, fructose, sucrose hay sorbitol Ngoi ra, nc da cũn cú nhiu khoỏng cht, vitamin, acid amin phự hp cho quỏ trỡnh sinh trng v quỏ trỡnh hỡnh thnh mng BC ca vi khun A.xylinum [14] 1.4.5 iu kin nuụi cy 1.4.5.1 pH Vi khun A.xylinum phỏt trin thun li trờn mụi trng cú pH thp Do ú mụi trng nuụi cy cn b sung thờm acid acetic nhm acid hoỏ mụi trng ng thi acid acetic cũn cú tỏc dng sỏt khun, giỳp ngn chn s phỏt trin ca vi sinh vt cú hi [22] 1.4.5.2 Nhit Theo Beyger nhit thớch hp vi vi khun A.xylinum vo khong 25 - 300C nhit cao s c ch hot ng v n mc no ú s ỡnh ch s sinh sn ca t bo v hiu sut lờn men s gim [11] Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 10 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công Khi lng ti ca mng 5 4 3 2 1 Peptone (NH4)2SO4 NH4Cl NH4NO3 Hm lng nit Hỡnh 3.5 nh hng ca ngun nit n lng ti ca mng BC T bng trờn ta thy ngun nit l peptone s cho lng mng cao hn so vi ngun nit l (NH4)2SO4 Cú th gii thớch kt qu thu c nh sau: Vi khun cú kh nng ng húa rt tt ngun nit hu c Peptone l ch phm thy phõn khụng trit ca mt ngun protein no ú, cỏc polypeptit cú peptone cha khụng quỏ gc acid amin ú cú th di chuyn trc tip qua mng sinh cht ca t bo vi khun [4] Cỏc acid amin ny cú th c s dng luụn vo cỏc hot ng sng ca t bo ú s lm tng tc sinh trng v lm tng nhanh kh nng to mng BC ca t bo vi khun Tuy nhiờn, giỏ thnh ca ngun nit hu c t hn rt nhiu so vi ngun nit vụ c, hn na mu sc ca mng BC khụng c trng Do ú, nghiờn cu ca mỡnh tụi quyt nh s dng ngun nit l (NH4)2SO4 cho quỏ trỡnh tng sinh v to mng BC ca vi khun A.xylinum BHN2 Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 28 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công 3.2.2 nh hng ca hm lng nit n kh nng to mng BC 3.2.2.1 nh hng ca hm lng (NH4)2SO4 n kh nng to mng BC kim tra nh hng ca ngun nit ti kh nng to mng BC chng A.xylinum BHN2 tụi quyt nh s dng mụi trng tiờu chun (MT3) cú s thay i hm lng ca (NH4)2SO4 Kt qu thu c th hin qua bng sau: Bng 3.5 nh hng ca hm lng (NH4)2SO4 n lng ti ca mng BC Hm lng c im mng BC (NH4)2SO4 (g/l) M m (g/l) 0,0 0,1 0,48 0,02 Mng mng, d b rỏch 1,23 0,01 0,5 1,87 0,03 1.0 2,67 0,03 1,5 3,04 0,01 2,0 Mng dy (2-3mm), nhn 3,24 0,03 2,5 3,12 0,03 3,0 2,98 0,01 4,0 2,09 0,05 Mng mng 5,0 Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 1,78 0,01 29 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công Khi lng ti ca mng BC (g) 3.5 2.5 M 1.5 0.5 0 0.1 0.5 1.5 2.5 Hm lng (NH4)2SO4 (g/l) Hỡnh 3.6.nh hng ca hm lng (NH4)2SO4 n lng ti ca mng BC Hỡnh 3.7 nh hng ca hm lng (NH4)2SO4 n dy ca mng BC T bng 3.5, hỡnh 3.6 v 3.7 ta thy rng hm lng 2g/l vi khun s to mng BC dy nht Cú th gii thớch kt qu thu c nh sau: Kt qu kim tra cho thy, hm lng 2,0 g/l mụi trng cho hiu sut mng BC cao nht Hm lng (NH4)2SO4 trờn 3,0 cú th l quỏ cao i vi yờu cu ca A.xylinum BHN2, ú khụng hp th ht lng sulphate Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 30 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công amone, lng cũn li mụi trng s c ch s phỏt trin ca vi khun Vỡ vy, lng BC to thp hn so vi mụi trng cú hm lng (NH4)2SO4 2,0 g/l Cũn hm lng (NH4)2SO4 di 1,0 g/l cú th l thp hn so vi yờu cu cho s phỏt trin ca vi khun, nờn lng BC to thp hn Tỏc gi Neelobon Suwannapinunt (2007) nuụi cy vi khun A.xylinum trờn mụi trng nc da vi t l (NH4)2SO4 l 3g/l, cũn Saibuatong.O b sung g/l (NH4)2SO4 lờn men sn xut thch da [21] T kt qu thớ nghim thu c tụi quyt nh s dng ngun (NH4)2SO4 vi hm lng 2g/l tin hnh cỏc thớ nghim tip theo 3.2.2.2 nh hng ca vic b sung peptone n kh nng to mng BC Vi khun Acetobacter hp th ngun nit hu c tt hn so vi ngun nit vụ c quỏ trỡnh sinh trng c bit l giai on mi cy ging Do vy nu b sung thờm hm lng pepton hp lớ s lm tng kh nng hỡnh thnh mng, m khụng h nh hng n mu sc cht lng ca mng Nờn chỳng tụi tin hnh nghiờn cu b sung hm lng pepton n s hỡnh thnh ca mng BC Kt qu trỡnh by bng 3.6 Bng 3.6 nh hng ca hm lng peptone n mng BC Hm lng peptone(g/l) c im mng BC Mm 0,2 Mng mng, mu trng 4,21 0,21 0,3 Mng dy, mu trng(1-2 mm) 4,435 0,286 0,4 Mng dy, mu trng (2-3mm) 5,445 0,26 0,5 Mng dy, mu nõu (3-5mm) 4,66 0,54 Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 31 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công Khi lng ti ca mng 3Hỡnh 3.7 nh hng ca hm lng peptone n dy mng BC 0,2 0,3 0,4 0,5 Hm lng pepton Hỡnh 3.8 nh hng vic b sung hm lng peptone n lng ti ca mng BC thớ nghim b sung peptone vo mụi trng hm lng 0,4 g/l s cho mng BC dy nht Hm lng peptone 0,2 g/l cú th l ớt, khụng kớch thớch s sinh trng ban u ca vi khun A.xylinum BHN2 Cũn hm lng peptone ln hn 0,4 g/l cú th l tha cho nhu cu ca vi khun, hn na cũn to mu sc khụng phự hp vi mc tiờu ca nghiờn cu l sn xut mng tr bng cú cht lng, phm cht tt v giỏ thnh r Do ú, nghiờn cu ca mỡnh tụi quyt nh b sung vo mụi trng 0,4 gam peptone vo lớt dch nuụi cy 3.3 nh hng ca KH2PO4 n kh nng to mng BC S cú mt cỏc hp cht phospho v nng ca chỳng mụi trng cú nh hng rt ln n quỏ trỡnh trao i cht ca t bo vi sinh vt Thay i nng cỏc hp cht phospho mụi trng s dn n thay i Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 32 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công cỏc quỏ trỡnh tng hp hng lot cỏc cht hp phn ca t bo cú cha phospho, t bo cht v cht nhõn Ngoi ra, phospho mụi trng cú tỏc dng iu chnh hot tớnh enzyme ng húa thc n cỏcbon [17] Phospho ngoi vai trũ tham gia cu trỳc cỏc thnh phn ca t bo, nú cũn cú vai trũ ht sc quan trng tng hp cellulose vi khun A.xylinum [31] Chỳng tụi tin hnh kho sỏt nh hng ca KH2PO4 n kh nng hỡnh thnh mng BC ca vi khun A.xylinum BHN2 cỏc hm lng khỏc Sau ngy nuụi cy iu kin tnh tin hnh thu v kim tra lng mng mụi trng cú hm lng KH2PO4 khỏc Kt qu thu c nh sau: Bng 3.7 nh hng ca hm lng KH2PO4 n lng mng BC Hm lng KH2PO4 (g/l) c im mng BC 0,0 0,1 M m (g/l) 0,54 0,02 Mng mng 1,34 0,03 0,5 2,45 0,03 1.0 3,22 0,02 1,5 3,56 0,03 2,0 Mng mng 2-3 mm, nhn, dai 3,87 0,01 2,5 3,43 0,02 3,0 3,12 0,02 4,0 2,65 0,02 Mng nhn, dai 5,0 Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 2,37 0,01 33 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công Khi lng ti ca mng BC 3.5 2.5 M 1.5 0.5 0 0.1 0.5 1.5 2.5 Hm lng KH2PO4 Hỡnh 3.9 nh hng ca hm lng KH2PO4 n lng ti ca mng BC Hỡnh 3.10 nh hng ca hm lng KH2PO4 n dy mng BC T bng 3.7 v hỡnh 3.9, hỡnh 3.10 ta thy rng KH2PO4 hm lng 2g/l cho mng cú lng cao nht v dy nht Nguyờn nhõn cú s khỏc ú l photphat kali cú mt trog nhiu thnh phn cu to quan trng ca t bo nh acid nucleic, protein, photpholipid, nhiu coenzim quan trng nh ADP, ATP, NADP, flavin, vitamintham gia vo quỏ trỡnh oxy húa ru etylic thnh acid acetic n CO2 v H2O [4] Vi hm lng KH2PO4 cao hn 2g/l mụi trng gõy Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 34 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công hin tng tha phospho v kali, t bo khụng dựng ht vo quỏ trỡnh sinh trng, phỏt trin v oxy húa ru etylic thnh acid acetic Hn na lng ny d tha nú lm thay i c tớnh lý húa ca mụi trng, c ch quỏ trỡnh sinh trng, phỏt trin t ú nh hng n s hỡnh thnh mng BC Ngc li, nu lng phospho v kali quỏ thp (thp hn 0,5 g/l) s nh hng n vic tham gia v cu to coenzim xỳc tỏc cho cỏc phn ng quỏ trỡnh sinh trng hm lng KH2PO4 t - 3g/l cho lng BC cao Theo tỏc gi Schramm v Hestrin (1954) s dng ngun mui phỏt KH2PO4 l 2,7 g/l [29] Kt qu ny phự hp vi nghiờn cu ca tụi, tụi quyt nh s dng hm lng 2g/l KH2PO4 cho cỏc nghiờn cu tip theo 3.4 nh hng ca MgSO4.7 H2O n kh nng to mng BC Magie l nguyờn t c vi sinh vt ũi hi cng vi lng khỏ cao (10-3 -10-4) Magie mang tớnh cht ca mt cofactor, chỳng tham gia vo nhiu phn ng, chỳng tham gia vo nhiu phn ng enzim cú liờn quan n cỏc quỏ trỡnh phosphoryl húa (chuyn H3PO4 t mt hp cht hu c ny sang mt hp cht hu c khỏc) Magie cú th lm hot húa cỏc hexokinaza, ATP aza, photphopheraza, transaxetylazacỏc men trao i protein, cỏc enzim oxy húa ca chu trỡnh Krebs Magie cũn cú vai trũ vic lm liờn kt cỏc tiu phn riboxom vi [4] kho sỏt nh hng ca hm lng magie n kh nng to mng BC ca vi khun A.xylinum BHN2 , chỳng tụi dựng mụi trng c bn (MT3) v thay i hm lng MgSO4.7H2O cỏc mc khỏc Kt qu thu c th hin qua bng 3.8 Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 35 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công Bng 3.8 nh hng ca hm lng MgSO4.7 H2O n mng BC Hm lng MgSO4.7H2O (g/l) c im mng BC 0,0 Mm 1,89 0,01 Mng mng 0,1 2,56 0,03 0,5 2,78 0,03 Mng mng 1.0 2,87 0,01 1,5 3,01 0,02 2,0 Mng mng, nhn, 3,23 0,01 2,5 dai 3,56 0,02 3,0 3,13 0,01 4,0 2,98 0,03 Mng mng, nhn 5,0 Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 2,78 0,01 36 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công Khi lng ti ca mng BC 3.5 2.5 M 1.5 0.5 0 0.1 0.5 1.5 2.5 Hm lng MgSO4.7H2O Hỡnh 3.11 nh hng ca hm lng MgSO4 n lng ti ca mng BC Hỡnh 3.12 nh hng ca hm lng MgSO4.7H2O n dy mng BC T kt qu bng 3.6 v hỡnh 3.11, ta thy rng MgSO4.7H2O hm lng 2,5 g/l cho lng mng BC cao nht Theo PGS-TS inh Th Kim Nhung, magie l nhõn t tham gia vo vic to thnh cỏc enzyme, nhng enzyme ny xỳc tỏc cho cỏc phn ng chuyn húa cỏc cht quỏ trỡnh hỡnh thnh mng BC Nu lng magie khụng cung cp cho vic to thnh Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 37 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công nhng enzyme xỳc tỏc cho cỏc phn ng hỡnh thnh cellulose, dn ti lng BC to thnh khụng cao Ngc li, lng magie quỏ cao mụi trng dn ti lm thay i c tớnh lý húa ca mụi trng, lm nng ion mụi trng cao s c ch quỏ trỡnh to mng BC [16] T kt qu nghiờn cu, chỳng tụi quyt nh s dng MgSO4.7H2O hm lng 2,5 g/l mụi trng nuụi cy to mng BC 3.5 Thớ nghim lờn mng BC bng mụi trng tuyn chn Sau xỏc nh c nh hng ca cỏc ngun dinh dng ti kh nng to mng BC ca vi khun A.xylinum BHN2 , tụi quyt nh tin hnh thớ nghim ỏnh giỏ kh nng to mng mụi trng tuyn chn (MT4) cú thnh phn nh sau: Ngun cỏcbon: Glucose 20 g/l, ru etylic: 0,6% (b sung sau kh trựng), Acid acetic: 2% (b sung sau kh trựng) Ngun nit: (NH4)2SO4 g/l ; peptone 0,4g/l Ngun khoỏng: KH2PO4 g/l; MgSO4 7H2O 2,5 g/l Kt qu thu c nh sau: Sau ngy nuụi cy tin hnh thu mng v kim tra cht lng mng BC thu c v so sỏnh vi mng thu c mụi trng c bn (MT3) thỡ thy rng: lng mng cao, mu trng Hỡnh 3.13 Mng BC thu c mụi trng chn lc (MT4) v mụi trng c bn (MT3) Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 38 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công KT LUN V NGH Kt lun Nghiờn cu nh hng ca cỏc ngun dinh dng n kh nng to mng ca vi khun A.xylinum BHN2, kt qu thu c nh sau: Ngun cỏcbon phự hp l glucose vi hm lng 20 g/l Ngun nit : (NH4)2SO4 2g/l; peptone 0,4 g/l Ngun khoỏng thớch hp: KH2PO4 2g/l; MgSO4.7H2O 2,5 g/l B sung acid acetic 2% v 0,6% ru etylic 700 Cú b sung nc da vo mụi trng (50%): 500 ml Nc mỏy: 500 ml ngh Do gii hn v thi gian v iu kin thớ nghim nờn ti cũn nhiu hn ch Nu c tip tc nghiờn cu vi iu kin tt hn, chỳng tụi xin ngh mt s ý kin sau: - Tin hnh cỏc thớ nghim trờn quy mụ ln hn, lp li thớ nghim nhiu ln hn kim chng cỏc kt qu thu c - Tin hnh cỏc nghiờn cu tỡm kim cỏc ngun nguyờn liu r tin khỏc phc v cho vic sn xut mng BC trờn quy mụ cụng nghip Nghiờn cu xỏc nh cụng thc sn xut BC trờn mt s mụi trng khỏc: nc mớa, nc chit bó men bia, r ng m rng ngun nguyờn liu Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 39 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công TI LIU THAM KHO TING VIT Kiu Hu nh (1999) Giỏo trỡnh vi sinh vt hc cụng nghip Nxb khoa hc v k thut H Ni Phm Th Trõn Chõu, Trn Th ng (1992) Húa sinh hc Nxb Giỏo dc Vừ Huy Dõng (2002) Cụng ngh vt liu y sinh hc, tr.350-358 Nguyn Lõn Dng, Nguyn ỡnh Quyn, Phm Vn Ty (2009) Vi sinh vt hc Nxb Giỏo dc Nguyn Thnh t (1980) C s vi sinh hc Nxb Giỏo dc Phm Th Ngc oi, Nguyn Th Dim Chi (2002) Nghiờn cu to mng sinh hc tr phng t Acertobacter xylinum Tp hi dc hc Trng Th Ngc Hoa, Trng Nguyn Qunh Hng (2005) a dng húa cỏc mụi trng sn xut Natadecoco t vi khun Acetobacter xylinum S 2, Tp khoa hc k thut Nụng Lõm nghip ng Th Hng (2007) Phõn lp, tuyn chn v nghiờn cu mt s c tớnh sinh hc ca vi khun Aceetobacter xylinum ch to mng sinh hc Lun thc s sinh hc HSP H Ni Nguyn Thỳy Hng (2003) Chn lc dựng Acetobacter xylinum thớch hp cho cỏc loi mụi trng dựng sn xut cellulose vi khun vi quy mụ ln S 3, Tp di truyn v ng dng 10 Nguyn Thỳy Hng (2008) nh hng ca ngun c cht v kiu lờn men n nng sut v cht lng cellulose vi khun Tp KH HQGHN, Khoa hc t nhiờn v cụng ngh 224, 205-210 Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 40 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công 11 Hunh Th Ngc Lan, Nguyn Vn Thanh (2006) Nghiờn cu cỏc c tớnh mng cellulose vi khun t Acetobacter xylinum s dng lm mng tr bng S 361, Tp dc hc 12 Nguyn c Lng (2000) Cụng ngh Vi sinh vt 1-2-3 Nxb HQG TP.H Chớ Minh 13 Chu Vn Mn (2003) ng dng tin hc sinh hc Nxb HQG H Ni 14 Nguyn Vn Mựi (2001) Thc hnh hoỏ sinh hc Nxb HQG H Ni 15 Nguyn Th Nguyt (2008) Nghiờn cu vi khun Acetobacter xylinum cho mng Bacterial cellulose lm mt n dng da Lun Thc s sinh hc HSP H Ni 16 inh Th Kim Nhung (1996) Nghiờn cu mt s c im sinh hc ca vi khun Acetobacter v ng dng chỳng lờn men acid acetic theo phng phỏp chỡm Lun ỏn Tin s Sinh hc i hc Tng hp H Ni 17 Lng c Phm (2004) Cụng ngh vi sinh vt Nxb Nụng nghip 18 Trn Nh Qunh (2009) Nghiờn cu mt s c tớnh vt lý ca mng Bacterial cellulose (BC) t vi khun Acetobacter xylinum, ng dng tr bng Lun thc s khoa hc sinh hc HSP H Ni 19 ng Hựng Thng (1999) Thng kờ v ng dng Nxb Giỏo dc 20 Trn Th Thanh (2003) Cụng ngh Vi sinh Nxb Giỏo dc TING NC NGOI 21 Brown.E (2007) Bacterial cellulose/Themoplastic polymer nanocomposites Master of sience in chemical engineering, Washington state university Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 41 Lớp K33B_Sinh - KTNN Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.Phương Phú Công 22 Dieter Klemm, Dieter Schumann ,Ulrike Udhardt, Silvia Marsch (2001) Bacterial synthesized cellulose-artificial blood vessels for microsurgery Vol 26, Inssue 9, Progress in polymer science, , p 1561-1603 23 Embuscado M.E., Marks J.S., BeMiller J.N (1994) Bacterial cellulose I.Factors affecting the production of cellulose by Acetobacter xylinum, Food Hydrocolloids (5), p 407-418 24 Hong Jon Son, Moon Su Heo, Yong Gyun Kim, Sang Joon Lee Optimization of fermetation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp A9 in shaking cultures Vol 33, Biotechnol.Appl Biochem, 2001, p 1-5 25 Thesis Homles (2004) Bacterial cellulose Department of chemical and process Engineering University of Canterbury Christchurch, New Zealand, p 1-65 26 Zippora Gromet - Elhanan, Shlomo Hestrin (1996) Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum VI Vol 85, N o 2, J Bacteriol, p 284292 TI LIU INTERNET 27 http://www.botany.utexas.edu/facstaff/facpages/mbrown/position1.htm 28 http://www.en.wikipedia.org/wiki/Microbial_cellulose 29 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1200212/ 30 http://www.res.titech.ac.jp/~junkan/english/cellulose/ 31 http://www.sinhhocvietnam.com 32 http://www.wiley-vch.de/books/biopoly/pdf_v05/bpol5003_37_46.pdf Sinh viên: Nguyễn Thị Hiển 42 Lớp K33B_Sinh - KTNN [...]... các nguồn dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC và chọn ra được các nguồn dinh dưỡng và hàm lượng thích hợp của chúng cho quá trình tạo màng BC Tôi tiến hành xây dựng công thức môi trường tuyển chọn cho quá trình tạo màng BC của vi khuẩn A .xylinum BHN2 Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường tuyển chọn tiến hành thu màng và đánh giá chất lượng màng thu được, so sánh với kết quả màng thu được ở môi trường cơ... hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng A .xylinum BHN2 2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường đến quá trình tạo màng BC của chủng A .xylinum BHN2, tôi tiến hành sử dụng môi trường nghiên cứu tạo màng chuẩn sau đó thay đổi nguồn đường, còn các thành phần khác của môi trường giữ nguyên theo tỷ lệ của môi trường. .. 3.1 Ảnh hưởng của nguồn cácbon và hàm lượng cácbon tới khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn A .xylinum BHN2 3.1.1 Ảnh hưởng của các nguồn cácbon tới khả năng tạo màng BC Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường đến quá trình tạo màng BC của chủng A .xylinum BHN2 tôi tiến hành sử dụng môi trường nghiên cứu tạo màng cơ bản (MT3), sau đó thay đổi nguồn đường, còn các thành phần khác của môi trường giữ nguyên... nhất cho quá trình tạo màng BC của vi khuẩn A .xylinum BHN2 để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo Sau khi chọn được nguồn đường thích hợp nhất tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nguồn đường đó đến quá trình tạo màng BC của vi khuẩn A .xylinum BHN2 Sau 5 ngày tiến hành thu màng và so sánh độ dày và khối lượng tươi và khối lượng khô của màng thu được ở các môi trường thí nghiệm, sau đó chọn. .. cần thiết của chu trình glioxilat ở vi khuẩn A .xylinum [1] Khi nuôi cấy, người ta thường bổ sung thêm một lượng nhỏ rượu etylic và acid acetic nhằm làm giảm độ pH của môi trường tạo ra môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn A .xylinum BHN2 Trong giới hạn đề tài, tôi chỉ nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng ethanol bổ sung đến khả năng tạo màng BC của vi khuẩn A .xylinum BHN2 Tôi... thí nghiệm, sau đó chọn ra môi trường có hàm lượng đường cho màng tốt nhất để làm hàm lượng đường cố định cho các thí nghiệm sau Tiến hành cố định hàm lượng và nguồn đường đó để sử dụng làm nguồn cácbon cho môi trường tạo màng BC ở các thí nghiệm sau này Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ rượu etylic đến quá trình tạo màng BC của vi khuẩn A .xylinum BHN2 , tôi sử dụng môi trường có nồng độ rượu etylic... sống của tế bào do đó sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng và làm tăng nhanh khả năng tạo màng BC của tế bào vi khuẩn Tuy nhiên, giá thành của nguồn nitơ hữu cơ đắt hơn rất nhiều so với nguồn nitơ vô cơ, hơn nữa màu sắc của màng BC không được trắng Do đó, trong nghiên cứu của mình tôi quyết định sử dụng nguồn nitơ là (NH4)2SO4 cho quá trình tăng sinh khối và tạo màng BC của vi khuẩn A .xylinum BHN2 Sinh vi n:... hưởng của hàm lượng nitơ đến khả năng tạo màng BC 3.2.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khả năng tạo màng BC Để kiểm tra ảnh hưởng của nguồn nitơ tới khả năng tạo màng BC ở chủng A .xylinum BHN2 tôi quyết định sử dụng môi trường tiêu chuẩn (MT3) có sự thay đổi hàm lượng của (NH4)2SO4 Kết quả thu được thể hiện qua bảng sau: Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khối lượng tươi của màng BC. .. màng BC 2 1 0 0,2 0,3 0,4 0,5 Hàm lượng pepton Hình 3.8 Ảnh hưởng vi c bổ sung hàm lượng peptone đến khối lượng tươi của màng BC Ở thí nghiệm bổ sung peptone vào môi trường ở hàm lượng 0,4 g/l sẽ cho màng BC dày nhất Hàm lượng peptone 0,2 g/l có thể là ít, không đủ để kích thích sự sinh trưởng ban đầu của vi khuẩn A .xylinum BHN2 Còn hàm lượng peptone lớn hơn 0,4 g/l có thể là thừa cho nhu cầu của vi. .. dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [31] 1.6 Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay 1.6.1 Trên thế giới Vi khuẩn A .xylinum BHN2 và màng BC của chúng đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: trong công nghệ môi trường, trong công nghiệp giấy, trong công nghiệp thực phẩm…[31] Các nghiên cứu hiện nay về màng BC ... trng dinh dng thớch hp cho quỏ trỡnh to mng ca vi khun A .xylinum BHN2 í ngha khoa hc ca ti Tỡm c mụi trng dinh dng ti u nht v kinh t nht cho s to mng ca vi khun A .xylinum BHN2 T ú to c s cho vic... mng BC ca vi khun A .xylinum BHN2 mụi trng nuụi cy tnh - Nghiờn cu nh hng ca nng hp cht phospho n quỏ trỡnh to mng BC ca vi khun A .xylinum BHN2 mụi trng nuụi cy tnh - Nghiờn cu nh hng ca vic... chuyn húa cỏcbon vi khun A .xylinum 1.3.4 Chc nng ca cellulose i vi vi khun A .xylinum Mng BC nm mt thoỏng ca mụi trng nuụi cy cú tỏc dng nh mt lp bo v cho cỏc t bo vi khun A .xylinum trc cỏc nhõn