Chọn lựa môi trường dinh dưỡng cho việc tạo màng BC của vi khuẩn acetobacter xylinum BHN2

Nội dung cần tiến hành - Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn đường và nồng độ đường đến quá trình tạo màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trong môi trường nuôi cấy tĩnh.. - Nghiên cứu ản

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Màng BC có bản chất là cellulose liên kết với các tế bào vi khuẩn

A.xylinum Do vậy, màng BC vừa có cấu trúc và đặc tính cơ học rất giống với

cellulose thực vật nhưng lại có thêm một số đặc tính hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học cao, đường kính cơ học nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polyme hóa lớn

Trên thế giới màng BC đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau như:công nghiệp thực phẩm, y học, công nghệ mỹ phẩm, khoa học vật liệu…

Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã phân lập tuyển chọn được chủng

A.xylinum BHN2 có khả năng tạo màng BC với năng suất và chất lượng tốt Tuy nhiên, do chưa có được môi trường thích hợp cho quá trình tạo màng BC

nên năng suất và chất lượng màng BC do vi khuẩn A.xylinum BHN2 tạo ra chưa cao và chưa ổn định

Xuất phát từ thực tế đòi hỏi phải tìm ra được môi trường dinh dưỡng

phù hợp nhất cho quá trình tạo màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2, tôi quyết định tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu : “Chọn lựa môi trường

dinh dưỡng cho việc tạo màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum

BHN 2”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng đến quá trình

hình thành màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2 Từ đó tìm ra được môi

trường dinh dưỡng thích hợp cho quá trình tạo màng của vi khuẩn A.xylinum

BHN2

3 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Tìm được môi trường dinh dưỡng tối ưu nhất và kinh tế nhất cho sự tạo

màng của vi khuẩn A.xylinum BHN2 Từ đó tạo cơ sở cho việc ứng dụng sản

xuất màng BC trên quy mô công nghiệp với giá thành rẻ và hiệu quả cao

4 Nội dung cần tiến hành

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn đường và nồng độ đường đến

quá trình tạo màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trong môi trường nuôi

cấy tĩnh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ và nồng độ nitơ đến quá

trình tạo màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trong môi trường nuôi cấy

tĩnh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ hợp chất phospho đến quá trình tạo

màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trong môi trường nuôi cấy tĩnh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung nồng độ axit axetic và rượu

etylic đến quá trình tạo màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trong môi

trường nuôi cấy tĩnh

NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 1 Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của A.xylinum

Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.xylinum thuộc

giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes [4] A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều BC nhất trong tự nhiên Mỗi tế bào A.xylinum có thể chuyển

hóa 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ [21, 27]

A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay

không di động, không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi Trên môi trường

thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, A.xylinum dễ dàng sinh ra

những tế bào có hình thái đặc biệt (tế bào có thể phình to hoặc kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh) Tế bào thường được tìm thấy nhiều trong dịch hoa quả, giấm, dịch rượu, trong đất…[7]

Hình 1.1 Vi khuẩn A.xylinum

Khuẩn lạc của A.xylinum có kích thước nhỏ (đường kính khuẩn lạc đạt

1 - 2mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn

1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A.xylinum

Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH = 4 – 6 [4] Vì

A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ sung thêm

acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [11]

Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A.xylinum bao gồm: Oxy

hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính; Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid; Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp cellulose [11]

1.3 Bacterial cellulose (BC)

1.3.1 Cấu trúc

BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PC – plant cellulose) Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4 glucopynanose Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau [30]

Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo

thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi

lớn hơn - sợi vĩ mô ( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000) Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1 - 9nm Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy [21]

1.3.2 Một số tính chất của màng BC

A.J Brown (1986), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn A.xylinum

tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất là hemicellulose Hemicellulose là những polysaccharid không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính [7, 21]

Một số tính chất của màng BC:

 Độ tinh sạch: Màng BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn

 Độ bền cơ học: Màng BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước

 Tính hút nước: Màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính xốp, độ ẩm cao

1.3.3 Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn A.xylinum

Khi nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum trong môi trường có nguồn dinh

dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12… và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần

để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên

bề mặt trong môi trường nuôi cấy [16] Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo

thành cellulose như sau: Các tế bào A.xylinum khi sống trong môi trường lỏng

sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose [29]

Hình 1.2 Quá trình tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn A.xylinum

Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được

điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều

loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hòa ( hình 1.3)

Các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp BC ở vi khuẩn

UDPGlc: Uridine diphosphoglucose CS: Cellulose synthase

GK: glucokinase FK: fructokinase

FBP: fructose -1,6 - biphosphate phosphatase

G6PDH: glucose – 6 - phosphate dehydrogenase

Hình 1.3 Con đường chuyển hóa cácbon trong vi khuẩn A.xylinum 1.3.4 Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn A.xylinum

Màng BC nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác dụng như

một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn A.xylinum trước các nhân tố có hại

của môi trường Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn

bảo vệ chúng khỏi tia cực tím Khoảng 23% số tế bào A.xylinum được bao bọc

bởi BC sống sót sau 1 giờ xử lí bằng tia cực tím Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3% [29]

Ngoài ra, màng BC còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi khuẩn đồng thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dưỡng từ môi trường một cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose [21]

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC

1.4.1 Nguồn cácbon

Cácbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzim, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Chính vì vậy, những hợp chất hữu cơ có chứa cácbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh vật Ảnh hưởng của nguồn cácbon đến năng suất sản xuất màng BC được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của nguồn cácbon đến năng suất sản xuất màng BC

Nguồn cácbon

Monosaccharide

Năng suất tổng hợp cellulose

Nguồn cácbon

Disaccharide

Năng suất tổng hợp cellulose

16

7

33 7-11

1.4.2 Nguồn nitơ

Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho cơ thể sinh vật nguyên liệu để hình thành các nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất [4]

Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+ Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ Do đó

khi nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum người ta thường sử dụng nguồn nitơ vô cơ là

(NH4)2SO4 , NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men [4]

Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về BC là môi trường do Hestrin

và Scharamm thiết lập [29]

1.4.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng

Phospho bao giờ cũng chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật Phospho có mặt ở trong hầu hết các thành phần của tế bào Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta sử dụng các loại phospho vô cơ như KH2PO4, K2HPO4, KNO3…[4]

Việc bổ sung phosphat (nhất là phosphat kali) vào các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường [4]

Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến

sinh trưởng của vi khuẩn A.xylinum và quá trình hình thành màng BC như

Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các nguyên tố vi lượng

thì vi khuẩn A.xylinum không thể sinh trưởng và phát triển bình thường được

Đối với A.xylinum nguyên liệu chủ yếu hiện nay được sử dụng là nước dừa già, dịch hoa quả, rỉ đường… thì khi nuôi cấy không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng nữa [4]

1.4.4 Các chất kích thích sinh trưởng

Các vitamin pyrodoxine, acid nicotinic, p–aminobenzoic acid (pABA), biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại [23]

Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy

A.xylinum thu màng BC Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành

phần hoá học trong nước dừa có khác nhau Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau

đó giảm dần) Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol Ngoài ra, trong nước dừa còn có nhiều khoáng chất, vitamin, acid amin… phù hợp cho quá trình sinh trưởng và quá trình hình thành màng BC của vi khuẩn

A.xylinum [14]

1.4.5 Điều kiện nuôi cấy

1.4.5.1 Độ pH

Vi khuẩn A.xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp

Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá môi trường Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn

sự phát triển của vi sinh vật có hại [22]

1.4.5.2 Nhiệt độ

Theo Beyger nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn A.xylinum vào khoảng

25 - 300C Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ

sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [11]

1.4.5.3 Độ thông khí

Vi khuẩn A.xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc [4] Do đó, điều kiện

tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí Trong thực tế độ

thông khí quyết định đến năng suất tổng hợp BC

1.4.5.4 Thời gian nuôi cấy

Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên Sau 36 –

48 giờ, hình thành một lớp trong và ngày càng dày

Theo Thesis Holmes (2004), hàm lượng glucose trong môi trường giảm nhất sau 150 giờ nuôi cấy Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi khuẩn bắt đầu sử dụng acid gluconic và 5 – keto acid gluconic trong quá trình trao đổi chất Tác giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt đến trạng thái tốt nhất [25, 31]

1.4.5.5 Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V)

Theo tác giả Trần Như Quỳnh khả năng hình thành màng tốt nhất ở tỷ

lệ S/V = 0,8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ lên men h =1,25 cm

[26]

1.5 Ứng dụng của màng BC

Màng BC của chúng đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học

trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: Trong công nghệ môi trường, các nhà khoa học đã dùng màng BC làm màng phân tách để xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989), Jonas và Farad (1998) đã dùng màng như một chất đặc biệt để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học Trong công nghiệp giấy, màng BC được sử dụng để sản xuất giấy điện tử có chất

lượng cao Trong công nghiệp thực phẩm, nó được ứng dụng để sản xuất thạch dừa, một món ăn được ưa chuộng ở Đông Nam Á…

Đặc biệt, Wan đã được đăng ký bản quyền về làm màng BC từ

A.xylinum dùng trong trị bỏng Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaija và

cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ

1.6.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về A.xylinum và màng BC còn khá mới mẻ Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc của màng Về ứng dụng thực tiễn, mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng, và được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [7, 11, 15, 16, ] Hiện nay chưa có một nghiên cứu nào đi sâu vào tìm ra một công thức môi trường tối ưu cho quá trình tạo

màng của vi khuẩn A.xylinum

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vi sinh vật

Đối tượng nghiên cứu là các chủng A.xylinum BHN2 được phòng thí nghiệm Thực vật - Vi Sinh khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

2.1.2.1 Hoá chất

Nguồn hóa chất được phòng thí nghiệm Thực vật – Vi sinh khoa Sinh KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp

Nguồn cácbon: Rượu etylic, glucose, saccharose, acid acetic

- Nguồn nitơ: Peptone, (NH4)2SO4, NH4Cl, NH4NO3

- Các muối khoáng: KH4PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH, CuSO4

- Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nấm men, cao ngô

- Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol

- Thuốc nhuộm: Tím Gentian, Fucshin, Lugol

- Ngoài ra còn sử dụng: Nước dừa già, nước máy

2.1.2.2 Thiết bị

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

Nồi hấp Tommy (Nhật)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20l – 10ml

Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40

Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ)

Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn…

Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Nước máy: 1000ml

2.1.3.3 Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng cơ bản (MT3)

Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g

KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g

Peptone: 4g

Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Bổ sung nước dừa: 500 ml

Nước máy: 500 ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng

Sau khi nhận giống A.xylinum BHN2 gốc của phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, tôi tiến hành cấy truyền giống trên môi trường thạch nghiêng và để trong tủ ấm khoảng 72 giờ ở nhiệt độ 28 - 300C Khi kiểm tra thấy các khuẩn lạc mọc đều

và có kích thước khoảng từ 1 - 2 mm thì tiến hành bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4oC cho nghiên cứu tiếp theo Cấy truyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh

dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng A.xylinum BHN2

2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường đến quá trình tạo màng BC

của chủng A.xylinum BHN2,tôi tiến hành sử dụng môi trường nghiên cứu tạo màng chuẩn sau đó thay đổi nguồn đường, còn các thành phần khác của môi trường giữ nguyên theo tỷ lệ của môi trường lên màng cơ bản (MT3) Nguồn đường sử dụng nghiên cứu là glucose, saccharose, rượu etylic với hàm lượng như nhau là 20g/l dịch nuôi cấy Sau 5 ngày tiến hành thu màng và kiểm tra ảnh hưởng của các nguồn cácbon tới độ dày và khối lượng của màng Sau đó tiến hành so sánh chất lượng màng ở các môi trường, chọn ra nguồn đường tốt

nhất cho quá trình tạo màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2 để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo

Sau khi chọn được nguồn đường thích hợp nhất tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nguồn đường đó đến quá trình tạo màng BC của vi

khuẩn A.xylinum BHN2 Sau 5 ngày tiến hành thu màng và so sánh độ dày và khối lượng tươi và khối lượng khô của màng thu được ở các môi trường thí nghiệm, sau đó chọn ra môi trường có hàm lượng đường cho màng tốt nhất để làm hàm lượng đường cố định cho các thí nghiệm sau

Tiến hành cố định hàm lượng và nguồn đường đó để sử dụng làm nguồn cácbon cho môi trường tạo màng BC ở các thí nghiệm sau này

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ rượu etylic đến quá trình tạo

màng BC của vi khuẩn A.xylinum BHN2 , tôi sử dụng môi trường có nồng độ rượu etylic 700 thay đổi từ 0% - 2% ; nguồn đường, nitơ, phospho, acid acetic với thành phần và nồng độ theo kết quả của các thí nghiệm ở phương pháp phần 2.2.2 Còn các thành phần còn lại của môi trường giữ nguyên như ở môi trường lên màng cơ bản Sau 5 ngày thu màng và so sánh màng thu được ở các môi trường có nồng độ rượu etylic khác nhau Từ đó, chọn ra nồng độ rượu etylic thích hợp nhất cho quá trình tạo màng BC Nồng độ đó sẽ được cố

định và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ tôi sử dụng là peptone và (NH4)2SO4, (NH4)Cl, NH4NO3 tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ bằng cách thay đổi nguồn nitơ của môi trường cơ bản những cùng được bổ sung vào môi trường theo hàm lượng bằng nhau (2g/l) Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành thu màng và so sánh chất lượng màng của các môi trường và chọn ra môi trường có nguồn nitơ thích hợp nhất

Sau đó, tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến quá trình tạo màng BC của vi khuẩn Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường tạo màng cơ bản có sự thay đổi hàm lượng nitơ; nguồn nitơ sử dụng là nguồn cho màng tốt nhất ở thí nghiệm trên Các yếu tố còn lại của môi trường giữ nguyên theo môi trường lên màng cơ bản (MT3), riêng nguồn đường và nồng độ ethanol được bổ sung theo kết quả thí nghiệm nghiên cứu

đã thu được theo phương pháp ở phần 2.2.2.1

Sau khi tìm ra được hàm lượng nitơ thích hợp nhất, tôi tiến hành tiếp thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng pepton bổ sung đến sự tạo màng BC Hàm lượng peptone được thay đổi từ 0 – 0,5g trong 1 lít dịch lên màng, các yếu tố còn lại của môi trường giữ nguyên theo môi trường lên màng cơ bản, riêng nguồn đường và nguồn nitơ thì sẽ sử dụng với hàm lượng theo kết quả nghiên cứu đã thu được theo phương pháp ở phần 2.2.2.1 và 2.2.2.2

Sau đó tiến hành so sánh chất lượng màng ở các môi trường, chọn ra hàm lượng peptone bổ sung tốt nhất cho quá trình tạo màng BC của vi khuẩn

A.xylinum BHN2 để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo

2.2.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng khoáng

Nguồn phospho tôi sử dụng là KH2PO4 giống như ở môi trường cơ bản (MT3) nhưng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng của KH2PO4 đến khả năng tạo màng BC Tôi tiến hành thay đổi hàm lượng

KH2PO4 từ 0 - 5 g/l trong các môi trường lên màng Các yếu tố còn lại của môi trường giữ nguyên theo môi trường tạo màng cơ bản riêng nguồn đường

và nitơ thì sử dụng nguồn đường và nitơ với thành phần và hàm lượng theo kết quả thí nghiệm nghiên cứu đã thu được ở phương pháp phần 2.2.2.1 và

2.2.2.2 Sau 5 ngày thu màng và so sánh màng thu được ở các môi trường có hàm lượng KH2PO4 khác nhau Từ đó, chọn ra hàm lượng KH2PO4 thích hợp nhất cho quá trình tạo màng BC Hàm lượng đó sẽ được cố định và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Tương tự, đối với MgSO4.7H2O tôi cũng tiến hành các bước tương tự như khi nghiên cứu KH2PO4

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu khả năng tạo màng BC của môi trường tuyển chọn (MT4)

Sau khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC và chọn ra được các nguồn dinh dưỡng và hàm lượng thích hợp của chúng cho quá trình tạo màng BC Tôi tiến hành xây dựng công thức môi trường tuyển chọn cho quá trình tạo màng BC của vi khuẩn

A.xylinum BHN2 Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường tuyển chọn tiến hành thu màng và đánh giá chất lượng màng thu được, so sánh với kết quả màng thu được ở môi trường cơ bản ( MT3)

2.2.4 Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC

Sau khi nuôi cấy, màng được lấy ra, để màng ráo nước khoảng 4 - 5 giờ, trên khay nhựa của nhiệt độ phòng thí nghiệm Tiến hành cân màng trên cân điện tử Trọng lượng tươi của màng được tính bằng hiệu số của trọng lượng khay nhựa lúc có và chưa có màng

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” [13], và “Thống kê và ứng dụng” [20] như:

* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp

lại thí nghiệm

1

i i

n

i i

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của nguồn cácbon và hàm lượng cácbon tới khả năng tạo

màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2

3.1.1 Ảnh hưởng của các nguồn cácbon tới khả năng tạo màng BC

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường đến quá trình tạo màng BC

của chủng A.xylinum BHN2 tôi tiến hành sử dụng môi trường nghiên cứu tạo màng cơ bản (MT3), sau đó thay đổi nguồn đường, còn các thành phần khác của môi trường giữ nguyên

Nguồn cácbon sử dụng là: glucose, saccharose, rượu etylic Sau 5 ngày, tiến hành thu màng, kiểm tra ảnh hưởng của các nguồn cácbon đến khả năng tạo màng BC Kết quả thu được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các nguồn cácbon đến màng BC

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nguồn cácbon đến khả năng tạo màng BC

Từ bảng 3.1 và hình 3.1 trên ta thấy ở môi trường có sử dụng nguồn cácbon là glucose khối lượng màng thu được là lớn nhất Như vậy, nguồn cácbon từ glucose là tốt nhất cho quá trình tạo màng BC của vi khuẩn

A.xylinum BHN2 Có thể giải thích kết quả thí nghiệm như sau:

Các vi sinh vật chủ yếu sử dụng nguồn thức ăn cácbon là hidratcacbon Trong đó quá trình trao đổi hidratcacbon đáp ứng ba nhu cầu của tế bào: sản sinh ra năng lượng, tạo thành những tiền chất, tạo ra quá trình oxy hóa - khử

để biến đổi tiền chất thành những sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuối cùng để xây dựng tế bào, đồng thời tích tụ trong môi trường một hoặc vài sản phẩm sinh tổng hợp Trong tất cả các nguồn hidratcacbon thì glucose được coi

là nguồn cácbon vạn năng đối với vi sinh vật [4] Tất cả các nguồn cácbon khác, muốn sử dụng được thì tế bào vẫn cần phải có một bước chuyển hóa hoặc cả một chuỗi các phản ứng chuyển hóa để trở về dạng D-glucose mà tế