Nghiên cứu hóa học dịch chiết cloroform cây chiết cánh (mallotus glabriusculus)

Đặc điểm chung của chiết - Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà tan với nó... - Mục đ

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Dược liệu Biển, Viện Hóa sinh Biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Th.S Nguyễn

Xuân Cường và các anh chị phòng Dược liệu Biển, Viện Hoá sinh Biển, Viện

Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới lãnh đạo Viện Hoá sinh Biển đã tạo điều kiện cho em được học tập và sử dụng các thiết bị tiên tiến của Viện để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra của khóa luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn thầy giáo Trưởng khoa Hóa học T.S Nguyễn Văn Bằng

và cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Hóa học, các thầy cô giáo trong trường ĐHSP Hà Nội 2 đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình em học tập tại trường

Khoá luận tốt nghiệp không tránh khỏi một số thiếu sót vì vậy em rất mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của các thầy cô và các bạn sinh viên quan tâm

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Lê Thị Hòa

LỜI CAM ĐOAN

Khóa luận “ Nghiên cứu hóa học dịch chiết cloroform cây Chiết cánh

(Mallotus glabriusculus)” được hoàn thành dưới sự hướng dẫn trực tiếp của

Th.S Nguyễn Xuân Cường Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu

của riêng tôi Các số liệu kết quả nêu trong khóa luận là trung thực, không trùng với các khóa luận khác đã được công bố

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Lê Thị Hòa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Chiết cánh 3

1.1.1 Mô tả 3

1.1.2 Phân bố, sinh thái 4

1.1.3 Công dụng 4

1.2 Lớp chất Flavonoid 4

1.1.2 Giới thiệu chung 4

1.2.2 Các nhóm flavonoid 5

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 8

1.3.1 Đặc điểm chung của chiết 8

1.3.2 Cơ sở của quá trình chiết 9

1.3.3.Quá trình chiết thực vật 9

1.4 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ 13

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 13

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký 13

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc ký 14

1.5 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 16

1.5.1 Điểm nóng chảy (M p ) 16

1.5.2 Độ quay cực ([α] D ) 17

1.5.3 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) 17

1.5.4 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy) 18

1.5.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) 18

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Mẫu thực vật 21

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 21

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 21

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 21

2.2.3 Sắc ký cột (CC) 21

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 22

2.3.1 Điểm nóng chảy (M p ) 22

2.3.2 Phổ khối lượng (ESI- MS) 22

2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 22

2.3.4 Độ quay cực [α] D 22

2.4 Dụng cụ và thiết bị 22

2.4.1 Dụng cụ và thiết bị chiết 22

2.4.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc 23

2.5 Hóa chất 23

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất 24

3.2 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất 25

3.2.1 Hợp chất 1: Myricitrin 25

3.2.2 Hợp chất 2: Kaempferin 26

3.3 Kết quả xác định cấu trúc 27

3.3.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1: Myricitrin 27

3.3.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2: Kaempferin 33

KẾT LUẬN 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

[α]D Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

C – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Carbon – 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H – 1H COSY 1H – 1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Two – Dimensional NMR

CC Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI – MS Phổ khối lượng va chạm electron

Electron Impact Mass Spectroscopy

FAB – MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh

Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Connectivity

HR – FAB – MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao

High Resolation Fast Atom Bombardment Mass

Spectroscopy

IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me Nhóm metyl

MS Phổ khối lượng

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU

Trang

Hình 1.1 Lá Chiết cánh 3

Hình 1.2 Flavan (2_phenyl chromen) 5

Hình 1.3 Flavon 5

Hình 1.4 Flavonol 5

Hình 1.5 Flavanon 5

Hình 1.6 Flavanonol_3 6

Hình 1.7 Chalcon 6

Hình 1.8 Auron 6

Hình 1.9 Antoxianidrin 7

Hình 1.10 Leucoantoxianidrin 7

Hình 1.11 (+) Catechin 7

Hình 1.12 (-) Catechin 7

Hình 1.13 3_phenylchromen 8

Hình 1.14 3_phenylchromen_4_one 8

Hình 1.15 Retonoid 8

Hình 3.1 Sơ đồ chiết phân đoạn cây Chiết cánh Mallotus glabriusculus 24

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết cloroform 25

Hình 3.3 Phổ 1H-NMR của 1 27

Hình 3.4 Phổ 13C-NMR của 1 28

Hình 3.5 Cấu trúc của hợp chất 1 28

Hình 3.6 Phổ DEPT của 1 29

Hình 3.7 Phổ HMBC của 1 31

Hình 3.8 Các tương tác HMBC (H  C) chính của 1 31

Hình 3.9 Phổ ESI-MS positive của hợp chất 1 31

Hình 3.10 Phổ ESI-MS nagative của hợp chất 1 33

Hình 3.11 Phổ ESI-MS positive của 2 34

Hình 3.12 Phổ ESI-MS negative của 2 35

Hình 3.13 Cấu trúc của hợp chất 2 35

Hình 3.14 Phổ 1H-NMR của 2 36

Hình 3.15 Phổ 13C-NMR của 2 38

Hình 3.16 Phổ DEPT của 2 39

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của 1 30

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của 2 37

MỞ ĐẦU

Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa tương đối lớn, độ ẩm cao (khoảng trên 80%), Việt Nam hiện có một hệ thống thực vật rất phong phú với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta làm thảo dược cùng với các mục đích khác phục vụ cuộc sống con người [1] Cùng với bề dày phát triển 4000 năm lịch sử của dân tộc, ngành đông y

đã dành được những thành tựu rực rỡ, nhiều phương thuốc cây cỏ, động vật

đã được ứng dụng hiệu quả và lưu truyền cho đến nay

Sử dụng cây cỏ làm thuốc luôn gắn liền với lịch sử tồn tại và phát triển của xã hội loài người Việc sử dụng các hợp chất thiên nhiên và các sản phẩm

có nguồn gốc thiên nhiên dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như cộng đồng bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp

Chi ba bét (Mallotus) là một chi khá lớn, gồm khoảng 150 loài phân bố

tại các khu vực Ấn Độ, Sri Lanka đến Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam

và khắp vùng Malesian Về phía Nam, chúng phân bố tới miền Đông Fiji, miền Bắc và Đông Australia Lên phía Bắc, có thể bắt gặp khá nhiều loài phân bố tại Trung Quốc, Triều Tiên và Nhật Bản Rất nhiều loài Mallotus đã được sử dụng làm thuốc để chữa nhiều loại bệnh khác nhau

Cây Chiết cánh (Mallotus glabriusculus), thuộc họ Thầu dầu

(Euphorbiaceae) là một loài cây thuộc chi ba bét đã được sử dụng từ lâu trong dân gian làm thuốc chữa bệnh, như rễ cây được dùng làm thuốc bổ phổi và chữa ho, viêm đau họng, kiết lỵ và một số bệnh ngoài da…

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi đã chọn đề tài cho khóa luận

tốt nghiệp là: “Nghiên cứu hóa học dịch chiết cloroform cây Chiết cánh

Mallotus glabriusculus”

Luận văn này tập trung nghiên cứu thành phần hóa học từ lá cây Chiết cánh bao gồm những nội dung chính là:

1 Thu mẫu lá cây Chiết cánh (Mallotus glabriusculus), xử lý mẫu và tạo

dịch chiết cloroform

2 Phân lập một số hợp chất Flavonoid từ cây Chiết cánh

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Chiết cánh

1.1.1 Mô tả [2]

Chiết cánh (Kiết cánh) – Mallotus glabriusculus (Kurz) Pax et Hoffm (Coelodiscus glabriusculus Kurz, C.coudercii Gagn, Mallotus coudercii (Gagn), Airy Shaw, thuộc họ Thầu dầu – Euphorbiaceae)

Cây bụi cao tới 1m, có khi là cây gỗ cao 8-10 m Nhánh nhẵn, hơi dẹp

Lá mọc đối, hình trái xoan- ngọn giáo, gốc tròn, chóp nhọn, lúc non có lông hình sao, về sau không lông, khi khô màu gỉ sắt, dài 11-20 cm, rộng 5-9 cm, mép nguyên, gân gốc 3, các gân bên chỉ đến giữa chiều dài của phiến, gân phụ 4-5 đôi, cuống lá ở mỗi mắt, có một dài, một ngắn (có một lá lớn hơn lá kia), lá kèm 5 mm Cụm hoa ở nách, rất ngắn, gần như hình xim co, cỡ 1 cm Hoa đực có 3 lá dài, 30 nhị hoặc hơn Cụm hoa cái ở nách lá, dài 2,5-3 cm, mang 1-2 hoa ở ngọn Hoa cái có 3 lá dài và bầu hình cầu cỡ 5-6 mm Quả nang cỡ 12 mm, tròn, có nhiều gai Hoa tháng 5-8

Hình 1.1 Lá Chiết cánh

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Tại Việt Nam: Cây phân bố tại Kon Tum, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận (Phan Giang), Đồng Nai (Biên Hòa, Bảo Chánh), Bà Rịa – Vũng Tàu (Côn Đảo), Kiên Giang (Phú Quốc)

Trên thế giới: Lào, Campuchia, Myanma

Cây ưa sáng, mọc trong rừng thường xanh, trên đất sa phiến thạch ở độ cao 100 – 500 m

1.1.3 Công dụng

Nhân dân dùng rễ cây làm thuốc bổ phổi và chữa ho với công dụng như

vị thuốc Cát cánh (chữa ho có đờm hôi tanh, ho ra máu, viêm đau họng, khản tiếng, hen suyễn, tức ngực, khó thở, nhọt ở phổi, kiết lỵ, chế thuốc mỡ dùng ngoài để chữa một số bệnh ngoài da)

1.2 Lớp chất Flavonoid

1.1.2 Giới thiệu chung [3,4,6,7,9]

Các Flavonoid là lớp chất phổ biến có trong thực vật

Chúng là hợp chất có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A, B được nối với nhau bởi một dị vòng C với bộ khung cacbon C6 – C3 – C6

Việc phân loại các flavonoid dựa trên sự khác nhau của nhóm C3 (các glicozit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà, antoxianin và antoxianidrin màu đỏ, xanh, tía và các dạng không màu, isoflavon, catecin và leucoantoxianidrin là các chất tan trong nước và thường nằm trong không bào)

Các flavonoid là các dẫn xuất của 2_phenyl chromen (flavan)

8 9 7

O

O RO

OR

Hình 1.5 Flavanon

Hình 1.12 (-) Catechin

O

OMe OMe

H

H

Hình 1.15 Retonoid 1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật

1.3.1 Đặc điểm chung của chiết

- Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà tan với

nó

- Mục đích của chiết:

+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu

+ Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện chiết thích hợp Thường dùng trong phân lập các hợp chất thiên nhiên

1.3.2 Cơ sở của quá trình chiết

- Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hoà lẫn với nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng

- Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst:

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tùy thuộc vào đối tượng chất

có trong các mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.3.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận

Điều kiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy

Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các điankylphtalat, tri_n_butyl_axetylcitrat và tributylphotphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa

Methanol và clorofom thường chứa đioetylphtalat [ đi_(2_etylhexyl) phtalat hoặc bis_2_etylheylphtalat ] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Cloroform, metylenclorit va methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, rễ, thân, củ, hoa, quả…

Những tạp chất của cloroform như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm khác

Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit HCl cũng có thể gây ra

sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác Cloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận, ở nơi thoáng và cần đeo mặt nạ phòng độc Metylenclorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn cloroform

Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực của

cloroform thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết [5] Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechonaetes aciniata được chuyển hóa thành trechlonolide B bằng quá trình phân hủy 1-hidroxy tropacocain cũng xảy ra khi erythroxylumnovogranatense được chiết trong methanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dung dịch chiết thô từ cây

mà thay vào đó là dung dịch nước của methanol

Đietyl ete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ

nổ, peroxit của đietyl ete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không

có khả năng tạo cholesterol như các carotenoit Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2_cis_điol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết, dung môi được cất bằng máy cất ở nhiệt độ không quá

30-400C, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

1.3.3.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết xoclet

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi vì nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi

có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thủy tinh Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau

Ví dụ:

+ Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân: Đragendroff và tác nhân Mayer

+ Các flavonoid thường là những chất không màu, vì vậy khi dịch chiết chảy ra không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết + Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và

sự xuất hiện của cặn chiết tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết + Các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với

anilinaxetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hidratcacbon, và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số chất ngay trong quá trình chiết

1.4 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ [8,9]

Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử cả hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan) Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh

sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất có tương tác yếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha tĩnh và động Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch

(hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử

đẳng nhiệt Langmuir:

C b

C b n n

1

.



Với:

n_ lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n∞_ lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào

đó

b_ hằng số

C_ nồng độ của chất bị hấp phụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái

khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hay rắn Dựa

vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành 2 nhóm lớn:

sắc ký khí và sắc ký lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia thành

các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

1.4.3.1 Sắc ký cột (C.C)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm

các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,

ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh

hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hết

sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp

phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng

tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt

càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp nếu lực trọng

trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy

được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình(MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là

Rf, với mỗi chất sẽ có một giá trị Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỷ

lệ này thấp (từ 1/5 đến 1/10), còn nếu tách tinh thì tỷ lệ này cao hơn và tăng vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau về Rf của các chất) mà hệ số này vào khoảng 1/20 đến 1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan trọng Có 2 cách đưa chất hấp phụ lên cột:

+ Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi cột còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

+ Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần vào cột đến khi

đủ lượng cần thiết

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chảy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gãy, dò

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách, còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.4.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thủy tinh

Ngoài ra SKLM còn được dùng để điều chế thu chất trực tiếp

Bằng việc sử dụng SKLM điều chế (bản được tráng silica gel dày hơn),

có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất phát hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

1.5 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu

kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng rất ít mẫu thử

Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,50C thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh khiết Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu

1.5.2 Độ quay cực ([α] D )

Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đẳng hướng, trong điều kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện trường chỉ còn dao động theo một phương nhất định được gọi là ánh sáng phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần

Mặt phẳng chứa tia sáng và phương dao động của vectơ điện trường được gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phẳng chứa tia sáng và vuông góc với mặt phẳng dao động gọi là mặt phẳng phân cực

Khi cho ánh sáng phân cực thẳng đi qua dung dịch một chất quang hoạt thì mặt phẳng phân cực sẽ bị quay một góc α Tuỳ theo chất quang hoạt mà góc quay này có thể sang phải (+) hay sang trái (-) Độ lớn của góc quay α phụ thuộc vào nồng độ C (g/100ml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung môi) l, nhiệt độ t và chiều dài sóng λ:

1.5.3 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau