quy trình tinh urease hiệu từ đậu nành nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm

Chính vì vậy, các kỹ thuật chiết rút, tinh sạch vànghiên cứu protein luôn ở vị trí trung tâm của các nghiên cứu hóa sinh và luôn được cậpnhật và hiện đại hóa [2] Protein tinh sạch chúng

Đất nước ngày càng phát triển, mức sống của người dân cũng được nâng cao nênnhu cầu về ăn, mặc, đáp ứng các dịch vụ cũng tăng lên Để đáp ứng đầy đủ nhu cầudinh dưỡng thì cơ thể cần cung cấp đầy đủ các acid amin nên protein là nguồn dinhdưỡng rất quan trọng cho con người nói riêng và vi sinh vật nói chung Ngoài raprotein còn là chất xúc tác quan trọng cho các phản ứng sinh học trong sản xuất vàđược gọi là enzyme.

Từ trước tới nay chúng ta thường bảo quản thực phẩm bằng các loại hóa chất điềunày có thể gây nguy hiểm đối với người tiêu dùng, do đó việc bảo quản thực phẩmbằng enzyme đã đem lại ý nghĩa hết sức to lớn vì nó có độ an toàn cao, tuy nhiên quytrình thực hiện để thu nhận và bảo quản enzyme cho việc sử dụng vẫn còn khó khăn,

nó đòi hỏi công nghệ tiên tiến và kỹ thuật cao Bên cạnh đó, enzyme được dùng tronglĩnh vực y dược để chuẩn đoán bệnh như: tiểu đường, bệnh thận qua các phép địnhlượng sinh hóa

Enzyme urease là một loại enzyme thuỷ phân ure hình thành NH3 và CO2, đượcứng dụng rất nhiều trong Y học và Công nghiệp thực phẩm để định lượng ure trongcác mẫu bệnh phẩm và nước chấm Hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease và kiturease từ nước ngoài với giá thành rất cao Do đó chúng tôi tìm hiểu đề tài này nhằmtìm ra một quy trình tinh sạch urease hiệu quả nhất từ đậu nành, một nguồn nguyênliệu rẻ tiền và dễ kiếm

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kỹ thuật tinh sạch protein

1.2.1 Khái niệm

Trong các tổ chức của cơ thể sống, protein có thể ở dưới dạng tự do trong các dịchsinh vật hoặc dưới dạng kết hợp, hoặc bị cầm trong các tế bào Hơn nữa, trong tế bào cóchứa hàng nghìn loại protein khác nhau, nếu ta cần nghiên cứu từng loại protein, trướchết phải chiết rút và tinh sạch chúng Chính vì vậy, các kỹ thuật chiết rút, tinh sạch vànghiên cứu protein luôn ở vị trí trung tâm của các nghiên cứu hóa sinh và luôn được cậpnhật và hiện đại hóa [2]

Protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ vềtiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh

hóa của các protein đó [2]

Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinhsạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị

chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X [2]

1.2.2 Nguyên tắc

Protein được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những đặc tính căn bản như

độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực [3]

Hỗn hợp protein trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch [3]

1.2 Giới thiệu một số kỹ thuật phân tách protein

1.2.1 Phương pháp ly tâm [3]

Một trong những kỹ thuật không thể thiếu được trong việc tách chiết và tinh chếprotein là ly tâm Máy ly tâm được sử dụng để tách các phần khác nhau khỏi dungdịch, sự ly tâm tăng tốc độ kết tủa của những tiểu phần rắn nhờ lực ly tâm Sự saikhác về tỷ trọng của nguyên liệu lơ lửng so với chất lỏng càng lớn thì tốc độ kết tủa sẽcàng cao

Máy ly tâm hoạt động theo nguyên tắc cân bằng đối xứng khi ly tâm và thăng

Do tính chất không bền với nhiệt của phần lớn các protein enzyme, khi tách chiếttinh chế chúng, cần sử dụng máy ly tâm lạnh hoặc duy trì mẫu ở nhiệt độ thấp trướckhi ly tâm…

1.2.2 Phương pháp thẩm tích

Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chấtkeo hòa tan (protein, một số các polysaccharid) nhưng thấm đối với các dạng dịch cáctinh thể Các protein enzyme có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick

Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa)vào dung dịch keo, trong khi đó các ion (cation và anion) và các chất phân tử nhỏ sẽchuyển vào dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường chuyển vào dung dịch rửa)

Tiến hành: cho dung dịch protein vào túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm(túi colodion hoặc cellophane) sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặclượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M).Khi đó muối sẽ khuyếch tán vào nước hoặc dung dịch đệm loãng, còn nước hoặc đệmloãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein Protein là những đại phân tửkhông thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi Bằng cách thay đổi thườngxuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ammonium sulphate ra khỏi protein

Hình 1.1 Thẩm tích để loại muối (NH 4 ) 2 SO 4 trong kết tủa protein.

- Ưu điểm: Kỹ thuật này dùng để loại bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ

- Nhược điểm: Kỹ thuật này không phân biệt được các loại protein với nhau

2.3 Phương pháp sắc ký

2.3.1 Phương pháp sắc ký lọc gel

Sắc ký lọc gel là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trongtách chiết và tinh sạch protein

Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng

và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra

Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chấttrơ, không phản ứng với protein enzyme, không hòa tan và tương đối bền với các yếu

tố về cơ học cũng như sinh học Chất được sử dụng để lọc phân tử phải là chất không

có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước

Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên Sephadex là chế phẩm dextran docác loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được nuôi cấy trên môitrường chứa saccharose hoặc sucrose

Phương pháp lọc phân tử trên Sephadex được tiến hành như trên: cho Sephadexvào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định Sau đó chodung dịch protein enzyme lên cột Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân

tử có trọng lượng phân tử nhỏ (các muối) sẽ khuyếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏcủa các hạt Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn(protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt Sephadex và sẽđược chiết nhanh ra khỏi cột Vì vậy ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tửcao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có phân tử lượng nhỏ

Phương pháp lọc rây phân tử trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng cònđược sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme

Hình 1.2 Hoạt động của lọc phân tử sephadex

Hình 1.3 Tách các phân tử theo kích thước bằng sắc ký lọc gel

Hình 1.4 sắc ký lọc gel [6]

2.3.2 Phương pháp sắc ký trao đổi ion

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số củacác protein enzyme Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở củaphản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng vàcác tác nhân trao đổi ion Tác nhân (nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa cótích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit Đây là những chất giá trơ, không tan trongnước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex,Molselect) hoặc là chất nhựa polistirol Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm

ion hóa Các chất trao đổi ion có chất giá là cellulose, Sephadex, molselect thôngthường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá làpolistirol chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.

Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose

+ Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose) là một dẫn xuất este củacellulose

+ Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là dẫn xuất estecủa cellulose

Nếu chất giá là Sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion Sephadex

+ DEAE – sephadex

+ CM - sephadex

- Ưu điểm: vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein enzyme

Hình 1.5 Sắc ký trao đổi ion

Hình 1.6 Cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion

(a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm Protein tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó

(b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein

2.3.3 Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái lực (affinity Chromatography) [5]

Sắc ký ái lực là một phương pháp dùng để tách hỗn hợp các chất dựa vào tươngtác đặc hiệu cao

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký ái lực là dựa vào cấu hình không gian củaprotein

Sau khi protein liên kết với chất có cấu hình không gian khớp với nó Dùng đệm

để rửa bỏ những liên kết không đặc hiệu Ta thu sản phẩm mục tiêu bằng cách thayđổi pH, lúc này liên kết ái lực sẽ bị phá vỡ

Phương pháp này cho hiệu quả tinh sạch cao

- Các tương

kháng nguyên -kháng

- Ở trên cột giá thể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể táchđược protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch

- Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein

và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao

Hình 1.7 Cơ chế tinh sạch Concanavalin A bằng sắc ký ái lực

2.3.4 Sắc ký lỏng cao áp (sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC) [7]

Sắc ký hiệu năng cao là một phương pháp chia tách, trong đó pha động là chấtlỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phânhoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổibằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơchế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC): HPLC là một sắc ký cột (columnchromatograph ) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ratrong quá trình chạy sắc ký Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector đã chuyển sắc kýcột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao Loại này cần phải có hệthống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạodòng chảy với lưu lương vài ml/ phút Số lượng mẫu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng

Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

- Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký vàloại sắc ký

+ Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo+ Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

+ Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử

* Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có mộtpha động

* Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phđn tích gồm hỗn hợp chất phđn tích A, B, C

… văo cột phđn tích, kết quả câc chất A, B, C … sẽ tâch ra khỏi nhau sau khi đi quacột Quyết định hiệu quả của sự tâch sắc ký ở đđy lă tổng hợp câc tương tâc

* Tổng của 3 tương tâc năy sẽ quyết định chất năo được rửa giải ra khỏi cộttrước tiín khi lực lưu giữ trín cột lă nhỏ nhất (F1) vă ngược lại

* Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong đó F1

vă F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 lă yếu tố ảnh hưởng không lớn

* Ở đđy F1 lă lực giữ chất phđn tích trín cột F2 lă lực kĩo của pha động đốivới chất phđn tích ra khỏi cột

* Như vậy với câc chất khâc nhau thì F1 vă F2 lă khâc nhau, kết quả lă câc chấtkhâc nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khâc nhau vă tâch ra khỏi nhau khi rakhỏi cột

Chất phân tích A +B+C

F2 F1

Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi làtủa bằng muối (salting out) Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất định.

Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein Ví dụ nhưfibrinogen tủa ở nồng độ muối ammonium sulfate 0.8 M trong khi phải đến nồng độ2.4 M, albumin mới kết tủa Hiện tượng này được sử dụng để tăng nồng độ của mộtdung dịch protein loãng chứa các phân đoạn có hoạt tính của các bước tinh sạch trước.Nếu cần thiết, lượng muối có thể được loại bỏ bằng sự thẩm tách

Phương pháp này đơn giản cho kết quả kết tủa sạch Tuy nhiên muốn có sản phẩmsạch, tinh khiết phải tiến hành các biện pháp phân đoạn theo những phương pháp hóa

lý riêng

Pha âäüng

2.5 Phương pháp kết tinh protein

Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giaiđoạn tinh chế cuối cùng

Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trường hợpriêng biệt, người ta có thể tiến hành kết tinh chúng Một điều cần chú ý là proteinenzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là bằng chứng về sự tinh khiết Cáctinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và cóthể chứa các protein enzyme khác Người ta thường tiến hành kết tinh protein enzymetrong dung dịch (NH4)2SO4 Quá trình kết tinh có thể tiến hành từ từ kéo dài vài ngàythậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tốt Thông thường là thêm muối(NH4)2SO4 vào dung dịch protein enzyme khá đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục nhẹnhàng dung dịch Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ từ nồng độmuối trong dung dịch Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêmdung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch protein enzyme theo từng giọt, thêmmuối qua màng bán thấm hoặc có thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch proteinenzyme Trong quá trình kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ Để kết tinhprotein enzyme được dễ dàng, ở những giai đoạn trước đó, người ta thường tách từngphần các protein enzyme bằng các dung môi hữu cơ Điều này có lẽ liên quan đến việccác chất cơ bản, chất lipid bị loại ra khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốtcho quá trình kết tinh

2.6 Làm khô và bảo quản chế phẩm protein

Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kết nước củachúng Nếu dung dịch protein enzyme bị khô ở nhiệt độ trong phòng thì đa số proteinenzyme bị biến tính Protein enzyme chỉ có thể được giữ ở dạng khô trong trường hợpnếu việc sấy khô được tiến hành vô cùng nhanh hoặc ở nhiệt độ thấp Nhiều proteinnhư chúng ta đã biết, ở nhiệt độ thấp có thể được kết tủa bằng rượu hoặc acetone Nếukết tủa thu được bằng cách đó đem xử lý bằng rượu tuyệt đối, bằng acetone hoặc bằngether và sau đó làm khô thật nhanh thì protein sẽ không bị biến tính Ở dạng khô, bột

protein có thể giữ một thời gian lâu, khi hòa tan nó trong nước nó thể hiện những tínhchất ban đầu của mình.

Tuy nhiên, nhiều protein không chịu được cách xử lý như vậy Vì vậy, người ta sửdụng phương pháp làm đông khô là phương pháp làm khô protein thận trọng nhất,phương pháp này có thể sử dụng được cho hầu hết protein

Dung dịch protein đã được thẩm tích được làm đóng băng và làm thăng hoa băng

ở áp suất 0,01-0,001 mm thuỷ ngân (được tạo ra nhờ máy hút chân không mạnh) Nơinước được tạo ra đều được đóng băng trong bầu dự trữ ở độ nhiệt thấp hơn (-70,-80oC) Sau một vài giờ chỉ còn lại bột protein Sau đó bột này (trong chân không) cóthể được giữ ở độ nhiệt cao hơn Protein đã được làm đông khô bằng cách như thế khihoà tan trong nước cất sẽ cho dung dịch protein (nguyên thể) ngay sau một vài năm.Người ta đã bảo quản huyết thanh máu bằng phương pháp như thế, huyết thanh khônày có thể được sử dụng trong mục đích truyền máu

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH PROTEIN BẰNG (NH 4 ) 2 SO 4

2.1 Cơ sở lý thuyết kết tủa protein [13]

2.1.1 Khái niệm

Đây là phương pháp đơn giản được dùng để tủa protein Khả năng hòa tan của proteintùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ củamuối…

Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in) Tuy nhiên, ở nồng độmuối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out)

Đầu tiên, giả thuyết salting in ở nồng độ muối thấp được giải thích bởi Debye - Huckel.Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích tráidấu Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử proteinkhông mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi Giả thuyết củaDebye – Huckel cho rằng: tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarid, giá trịcủa hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch

Thuật ngữ salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởiKirkwood Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa,giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa

Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:

log S = B - KI

Trong đó

S: độ hòa tan của protein

B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)

K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch)

I: cường độ ion của muối

Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối:

Hình 2.1 Độ tan theo nồng độ muối

Những đường biểu diễn khác nhau tùy theo từng protein khác nhau Vì thế, khi muốntách 1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta có thể lựa chọn nồng độmuối thích hợp sao cho phù hợp nhất với protein mục tiêu

Độ dốc của đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein vànồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tửcủa protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống

Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ

tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate >thiocyanate

2.1.3 Cơ chế của quá trình kết tủa protein bằng dung dịch muối có nồng độ cao [14]

Hầu hết enzyme tồn tại trong dịch tế bào đều là những protein ở dạng hòa tan do

đó chúng tan tốt trong dung dịch muối sinh lý có nồng độ ion khoảng 0,5-0,2M và ở

pH trung tính Khi tiến hành tách chiết protein ra khỏi tế bào thì các điều kiện môitrường thay đổi dẫn đến protein bị kết tủa

Độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác có cực của protein với dungmôi, sự tương tác ion của protein với các phân tử muối hiện diện trong dung dịch và

sự tương tác tĩnh điện giữa phân tử mang điện tích hay những nhóm phân tử mangđiện tích của protein kết dính lại với nhau Quá trình kết tủa protein bằng dung dịchmuối có nồng độ cao phụ thuộc rất lớn vào tính kỵ nước của phân tử protein

Trong dung dịch, các gốc kỵ nước của phân tử protein tập trung trên bề mặt, tiếpxúc trực tiếp với các phân tử nước Các phân tử nước này ngăn cản quá trình hìnhthành liên kết để tạo kết tủa giữa các phân tử protein như nhau

Khi nồng độ dung dịch muối tăng, các phân tử muối bị solvate hóa làm giảm sốphân tử nước xung quanh bề mặt các phân tử protein tạo điều kiện cho các bề mặt kỵnước tiến đến gần nhau và kết tủa xuống

Mặc dù quá trình kết tủa bằng dung dịch muối có nồng độ cao phụ thuộc nhiềuvào các phần tử kỵ nước của protein nhưng các yếu tố khác như pH, nhiệt độ cũng gâyảnh hưởng đến quá trình này Ở pH gần điểm đẳng điện pI thì quá trình kết tủa xảy ra

dễ dàng hơn và khi nhiệt độ tăng ở nồng độ muối cao thì độ hòa tan của protein cũnggiảm

Ngoài ra, trong quá trình kết tủa protein bằng muối có nồng độ cao cần lưu ý đếnbản chất của muối dùng để kết tủa Những loại muối có gốc anion tích nhiều điện tích

âm như: SO42-, PO43- là những loại muối làm tăng hiệu quả của quá trình kết tủa.Gốc cation tuy không ảnh hưởng lắm nhưng cần lưu ý không sử dụng các ion phứchoặc các ion có khả năng hình thành liên kết với phân tử protein Do đó, những ion

NH4 , Na+, K+ thường được sử dụng

2.1.3 Đặc điểm của muối trung tính (NH 4 ) 2 SO 4

Dùng muối (NH4)2SO4 để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hòa điện (do cácion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân

tử protein Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy cóthể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng

Protein được kết tủa thuận nghịch và kết tủa không thuận nghịch Khi dùng muối(NH4)2SO4 để kết tủa protein thì khi không còn tác nhân muối thì protein trở lại trạng tháihòa tan [2]

Muối trung tính có ảnh hưởng rõ tới độ hòa tan của protein hình cầu, với nồng độ thấpchúng làm hòa tan nhiều protein Tác động của muối trung tính không phụ thuộc vào bảnchất của muối trung tính mà phụ thuộc vào nồng độ muối và số điện tích của mỗi ion trongdung dịch Các muối có ion hóa trị 2 (MgCl2, MgSO4, (NH4)2SO4 ) làm tăng đáng kể độtan của protein hơn các muối có ion hóa trị 1 (NaCl, KCl ) Khi tăng đáng kể nồng

độ muối trung tính thì độ tan của protein bắt đầu giảm và ở nồng độ muối rất cao,protein có thể bị tủa hoàn toàn [10]

Các protein khác nhau bị kết tủa ở những nồng độ muối trung tính khác nhau Người ta

sử dụng tính chất này để chiết xuất và tách riêng protein khỏi hỗn hợp Ví dụ dùng muối

(NH4)2SO4 50% bão hòa kết tủa globulin và dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa để kết tủaalbumin từ huyết thanh [11]

Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 Tuy nhiên, người

ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làmbền) hầu hết các loại protein enzyme Loại muối này lại rẻ tiền và phổ biến Độ hòatan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 25oC) Nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủaprotein enzyme khác nhau thì khác nhau

Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bão hòa [12]+ Dạng bột: khi dùng bột người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein enzyme.Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme Khi chomuối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối [12]+ Dung dịch bão hòa: trong nhiều sách về phương pháp nghiên cứu, người ta đưa

ra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ bão hòa khác nhau ởnhững nhiệt độ nhất định [12]

Nếu thêm từng phần các dung môi hữu cơ hoặc từng phần muối (NH4)2SO4 (cónồng độ bão hòa khác nhau) thì ta có thể tách từng phần hỗn hợp protein enzyme Tuynhiên, để phân chia hoàn toàn những hỗn hợp phức tạp, phương pháp này không chokết quả tốt vì độ hòa tan của một số protein bị tăng lên Mặc dầu vậy, cách kết tủatừng phần này cũng rất có lợi, đặc biệt là đối với giai đoạn đầu của việc tách chiết vàlàm sạch protein enzyme, vì phương pháp khá đơn giản

2.2 Thí nghiệm kết tủa enzyme Bromelain từ thân Dứa