quy trình tinh urease hiệu từ đậu nành nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm

Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Đất nước ngày phát triển, mức sống người dân nâng cao nên nhu cầu ăn, mặc, đáp ứng dịch vụ tăng lên Để đáp ứng đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng thể cần cung cấp đầy đủ acid amin nên protein nguồn dinh dưỡng quan trọng cho người nói riêng vi sinh vật nói chung Ngoài protein chất xúc tác quan trọng cho phản ứng sinh học sản xuất gọi enzyme Từ trước tới thường bảo quản thực phẩm loại hóa chất điều gây nguy hiểm người tiêu dùng, việc bảo quản thực phẩm enzyme đem lại ý nghĩa to lớn có độ an toàn cao, nhiên quy trình thực để thu nhận bảo quản enzyme cho việc sử dụng khó khăn, đòi hỏi công nghệ tiên tiến kỹ thuật cao Bên cạnh đó, enzyme dùng lĩnh vực y dược để chuẩn đoán bệnh như: tiểu đường, bệnh thận qua phép định lượng sinh hóa Enzyme urease loại enzyme thuỷ phân ure hình thành NH CO2, ứng dụng nhiều Y học Công nghiệp thực phẩm để định lượng ure mẫu bệnh phẩm nước chấm Hiện phải nhập chế phẩm urease kit urease từ nước với giá thành cao Do tìm hiểu đề tài nhằm tìm quy trình tinh urease hiệu từ đậu nành, nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kỹ thuật tinh protein 1.2.1 Khái niệm Trong tổ chức thể sống, protein dạng tự dịch sinh vật dạng kết hợp, bị cầm tế bào Hơn nữa, tế bào có chứa hàng nghìn loại protein khác nhau, ta cần nghiên cứu loại protein, trước hết phải chiết rút tinh chúng Chính vậy, kỹ thuật chiết rút, tinh nghiên cứu protein vị trí trung tâm nghiên cứu hóa sinh cập nhật đại hóa [2] Protein tinh xác định trình tự acid amin, mối liên hệ tiến hóa protein cá thể khác khảo sát chức sinh hóa protein [2] Hơn nữa, việc tinh thể hóa protein thực với protein tinh từ tinh thể biết cấu trúc bậc đơn vị chức protein thông qua liệu chiếu xạ tia X [2] 1.2.2 Nguyên tắc Protein tinh dạng có hoạt tính dựa đặc tính độ hòa tan, kích thước, điện tích liên kết lực [3] Hỗn hợp protein trải qua nhiều giai đoạn phân tách, giai đoạn dựa đặc tính định, để cuối protein tinh [3] 1.2 Giới thiệu số kỹ thuật phân tách protein 1.2.1 Phương pháp ly tâm [3] Một kỹ thuật thiếu việc tách chiết tinh chế protein ly tâm Máy ly tâm sử dụng để tách phần khác khỏi dung dịch, ly tâm tăng tốc độ kết tủa tiểu phần rắn nhờ lực ly tâm Sự sai khác tỷ trọng nguyên liệu lơ lửng so với chất lỏng lớn tốc độ kết tủa cao Máy ly tâm hoạt động theo nguyên tắc cân đối xứng ly tâm thăng máy ly tâm hoạt động Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Do tính chất không bền với nhiệt phần lớn protein enzyme, tách chiết tinh chế chúng, cần sử dụng máy ly tâm lạnh trì mẫu nhiệt độ thấp trước ly tâm… 1.2.2 Phương pháp thẩm tích Thẩm tích khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm chất keo hòa tan (protein, số polysaccharid) thấm dạng dịch tinh thể Các protein enzyme khuếch tán qua màng theo định luật Fick Nước khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp (thường dung dịch rửa) vào dung dịch keo, ion (cation anion) chất phân tử nhỏ chuyển vào dung dịch có nồng độ thấp (thường chuyển vào dung dịch rửa) Tiến hành: cho dung dịch protein vào túi đặc hiệu làm nguyên liệu bán thấm (túi colodion cellophane) sau đặt túi vào bình chứa lượng lớn nước lượng lớn dung dịch đệm pha loãng (đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M) Khi muối khuyếch tán vào nước dung dịch đệm loãng, nước đệm loãng di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein Protein đại phân tử vượt qua túi thẩm tích giữ lại túi Bằng cách thay đổi thường xuyên dung dịch rửa tẩy muối ammonium sulphate khỏi protein Hình 1.1 Thẩm tích để loại muối (NH 4)2SO kết tủa protein - Ưu điểm: Kỹ thuật dùng để loại bỏ muối hay tách phân tử nhỏ - Nhược điểm: Kỹ thuật không phân biệt loại protein với 2.3 Phương pháp sắc ký 2.3.1 Phương pháp sắc ký lọc gel Sắc ký lọc gel kỹ thuật sắc ký cột dùng phổ biến tách chiết tinh protein Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Cơ sở phương pháp lọc gel dựa vào khác kích thước, hình dạng phân tử lượng protein enzyme có hỗn hợp để tách chúng Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme tốt, chất rây phân tử phải chất trơ, không phản ứng với protein enzyme, không hòa tan tương đối bền với yếu tố học sinh học Chất sử dụng để lọc phân tử phải chất tính đàn hồi (không co) phải chất ưa nước Gel sephadex chất thỏa mãn yếu tố Sephadex chế phẩm dextran loài vi sinh vật khác Leuconostoc tạo chúng nuôi cấy môi trường chứa saccharose sucrose Phương pháp lọc phân tử Sephadex tiến hành trên: cho Sephadex vào cột thủy tinh dài cân bằng dung dịch đệm có pH định Sau cho dung dịch protein enzyme lên cột Khi lọc chiết dung môi thích hợp, phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (các muối) khuyếch tán chậm chạp qua lỗ nhỏ hạt Sephadex bị trương phồng, chất có trọng lượng phân tử lớn (protein enzyme) khả vào mà lách nhanh qua hạt Sephadex chiết nhanh khỏi cột Vì ta tách chất có trọng lượng phân tử cao thoát khỏi cột gel trước so với chất có phân tử lượng nhỏ Phương pháp lọc rây phân tử trình tinh chế protein enzyme, chúng sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme Hình 1.2 Hoạt động lọc phân tử sephadex Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Hình 1.3 Tách phân tử theo kích thước sắc ký lọc gel Hình 1.4 sắc ký lọc gel [6] 2.3.2 Phương pháp sắc ký trao đổi ion Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào khác điện tích tổng số protein enzyme Hay nói cách khác, phương pháp dựa sở phản ứng trao đổi ion protein tan nước dung dịch đệm loãng tác nhân trao đổi ion Tác nhân (nguyên liệu) trao đổi ion chất nhựa có tích nhóm sinh ion chất ionit Đây chất giá trơ, không tan nước, có chất cellulose chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) chất nhựa polistirol Chất giá thể thường kết hợp với nhóm Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT ion hóa Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose, Sephadex, molselect thông thường dùng để tách protein enzyme, chất trao đổi ion có chất giá polistirol dùng để tách peptid có trọng lượng phân tử nhỏ Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose + Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose) dẫn xuất este cellulose + Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) dẫn xuất este cellulose Nếu chất giá Sephadex có chất trao đổi ion Sephadex + DEAE – sephadex + CM - sephadex - Ưu điểm: vừa tách protein enzyme kích thước điện tích tổng số protein enzyme Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Hình 1.5 Sắc ký trao đổi ion Hình 1.6 Cơ chế protein hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương trao đổi ion âm với dung dịch đệm Protein tích điện âm ion dương tương tác với (b) Khi protein gắn với hạt, protein thay ion âm tương tác với hạt hạt thay ion dương tương tác với protein 2.3.3 Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học phương pháp sắc ký lực (affinity Chromatography) [5] Sắc ký lực phương pháp dùng để tách hỗn hợp chất dựa vào tương tác đặc hiệu cao Nguyên tắc phương pháp sắc ký lực dựa vào cấu hình không gian protein Sau protein liên kết với chất có cấu hình không gian khớp với Dùng đệm để rửa bỏ liên kết không đặc hiệu Ta thu sản phẩm mục tiêu cách thay đổi pH, lúc liên kết lực bị phá vỡ Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Phương pháp cho hiệu tinh cao - Các tương tác kháng nguyên kháng thể; enzyme - chất; thụ thể - chất gắn thụ thể - Cơ sở phương pháp người ta gắn phân tử gắn (ligand) vào chất mang rắn (chất giá) liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách tương tác đặc hiệu với Những chất chất (Substrate) chất ức chế (inhibitor) cạnh tranh - Ở cột giá thể hay chất mang chứa chất cố định pH lực ion phù hợp cách thêm chất ức chế cạnh tranh hòa tan vào tách protein enzyme khỏi cột trạng thái - Sắc ký lực phương pháp tinh hiệu tương tác protein phân tử dùng mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Hình 1.7 Cơ chế tinh Concanavalin A sắc ký lực 2.3.4 Sắc ký lỏng cao áp (sắc ký lỏng hiệu cao HPLC) [7] Sắc ký hiệu cao phương pháp chia tách, pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến đổi liên kết hóa học với nhóm chức hữu Quá trình sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử) Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC): HPLC sắc ký cột (column chromatograph ) kèm với detector nhạy để phát chất tách trình chạy sắc ký Với tiến kỹ thuật cột, detector chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh hiệu suất cao Loại cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lương vài ml/ phút Số lượng mẫu phân tích HPLC cần khoảng 20 microlit [7] Phương pháp sắc ký khí: điểm phân biệt sắc ký lỏng cao áp (HPLC) sắc ký khí (GC) phương pháp HPLC, mẫu cần làm hoà tan mà không cần làm bay hơi, HPLC phân tích chất mà không sợ gây phân hủy nhiệt độ trình phân tích [7] Nguyên tắc trình sắc ký cột - Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất trình sắc ký loại sắc ký + Nếu pha tĩnh chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo + Nếu pha tĩnh chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion + Nếu pha tĩnh chất lỏng ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết + Nếu pha tĩnh Gel ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử * Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích khỏi cột, cần có pha động Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT * Như nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C … vào cột phân tích, kết chất A, B, C … tách khỏi sau qua cột Quyết định hiệu tách sắc ký tổng hợp tương tác Cháút phán têch A +B+C F1 Pha ténh F2 F3 Pha âäüng * Tổng tương tác định chất rửa giải khỏi cột trước tiên lực lưu giữ cột nhỏ (F1) ngược lại * Đối với chất, lưu giữ quy định lực F1, F2, F3 Trong F1 F2 giữ vai trò định, F3 yếu tố ảnh hưởng không lớn * Ở F1 lực giữ chất phân tích cột F2 lực kéo pha động chất phân tích khỏi cột * Như với chất khác F1 F2 khác nhau, kết chất khác di chuyển cột với tốc độ khác tách khỏi khỏi cột 10 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Chương 3: ỨNG DỤNG KHẢO SÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH UREASE TỪ ĐẬU NÀNH [1] 3.1 Urease Urease loại enzym thuỷ phân urea hình thành NH CO 2, ứng dụng nhiều Y học Công nghiệp thực phẩm để định lượng urea mẫu bệnh phẩm nước chấm Trước đây, có nhiều nghiên cứu enzyme urease đưa nhiều phương pháp tinh urease, nhiên chưa có nghiên cứu so sánh phương pháp tinh khác Ở nước ta, có số nghiên cứu tinh enzym urease từ đậu nành chưa đưa quy trình tinh hiệu chưa ứng dụng sản xuất chế phẩm urease Ngành Y học Thực Phẩm nước ta phải nhập chế phẩm urease kit urease từ nước với giá thành cao Do thực đề tài nhằm tìm quy trình tinh urease hiệu từ đậu nành, nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm Đồng thời sử dụng phương pháp điện di gel acrylamide để nghiên cứu thành phần enzyme urease từ đậu nành 3.2 Urease 20 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT 3.2.1 Khái niệm Urea sản phẩm trao đổi đạm thải với nước tiểu người, động vật có vú, bò sát vài loài cá Urea hình thành gan Urease protein tìm thấy vi khuẩn, nấm men số thực vật bậc cao 3.2.2 Tính chất Urease enzyme xúc tác thủy phân urea thành carbon dioxide amoniac (NH 2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3 Urease đặc biệt tìm thấy Helicobacter pylori, kết hợp bốn sáu enzyme thường xuyên tiểu đơn vị lắp ráp tứ diện tồn thể 24 tiểu đơn vị α12β12 - Có thể tác dụng với kim loại như: Nikel - Phân tử khối: 480 kDa 545 kDa o - Độ pH thuận lợi: 60 C Hình 3.1 Cấu tạo urea - - Chất ức chế: kim loại nặng Pb Pb 2+ - Enzyme đặc thù: urease hydroxyurease 21 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Hình 3.2 Trung tâm hoạt động urease Quá trình thủy phân urea qua bước sau: Hình 3.3 Cơ chế phân hủy urea Sau cacbamil acid tự động phân hủy để tạo thành amoniac carbon dioxide Sử dụng thuốc thử phenolphtalein dung dịch vừa tạo có màu đỏ có xuất ion OH - Người ta sử dụng urease để xác định hàm lượng urea máu Từ phương trình phản ứng ta định lượng hàm lượng urea dựa vào sản phẩm tạo thành CO NH dùng NH tác dụng với cetoglutarate NH + NADH → glutaric acid / NAD Định lượng glutaric acid hay NAD để suy lượng urea máu Phương trình tổng quát Urea bị thủy phân enzyme urease hình thành nên amoniac carbon dioxide Từ phản ứng kiểm soát thay đổi độ dẫn điện ion theo 22 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT thời gian Độ dẫn điện tương ứng với nồng độ ion hình thành suốt trình phản ứng 3.3 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Nguyên liệu Đậu nành loại bỏ hạt xấu, bỏ sâu mọt, xay mịn, loại lipid, bảo quản lạnh Hoá chất: Urease chuẩn (urease Jack bean), Albumin bovine, Etherpetrolium, acetone, glycine, Tris(base), Coomassie Brilliant Blue – G250 (Merck), Nessler, EDTA, L-Cystein.HCl, Acrylamide bisacrylamide, SDS, TEMED, Amonium persulfate, Sephadex G 50, DEAE – Cellulose (Merck)… 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tủa sunfat amon + Phương pháp 1: tủa phân đoạn nồng độ 65% 55% bão hoà + Phương pháp 2: tủa phân đoạn nồng độ 20% 55% bão hoà - Phương pháp sắc ký: tách liên tục vi phân hỗn hợp chất + Sắc ký rây phân tử gel Cephadex G-50 (6×12cm) + Sắc ký trao đổi ion gel DEAE-Cellullose - Phương pháp Bradford: xác định hàm lượng protein - Phương pháp Nessler: xác định hoạt tính urease - Phương pháp điện di: kiểm tra hiệu tinh sạch, điện di gel 10% polyacrylamid với tốc độ dòng 20mA, gel nhuộm với Coomassie Blue R-250 - Phương pháp siêu lọc: sử dụng thiết bị lọc membrane Vivaflow 3.3.3 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Chiết xuất lấy enzyme: Nghiền kỹ bột đậu dung dịch HCl 0,4% có thêm -3 -3 EDTA (trilon B, complexon III) 5.10 M L cystein 5.10 M Sau ly tâm tách bã lấy dịch chiết o Xử lý nhiệt: Nâng nhiệt nhanh đến 60 C, giữ 30 phút đem ly tâm tách bỏ cặn kết tủa Siêu lọc: Dịch ly tâm lọc qua màng siêu lọc để loại bỏ peptid polypeptid có trọng lượng phân tử bé (M>500) 23 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Kết tủa aceton: Dịch lọc xử lý aceton lạnh (tỷ lệ 1:1), ly tâm tách kết tủa Phần kết tủa đem hòa tan trisbuffer 0,1M, pH = chứa EDTA L -3 cystein 5.10 M Sắc ký trao đổi ion: Dịch enzyme chạy sắc ký trao đổi ion cột chứa DEAE - cellulose với gradien nồng độ NaCl từ 0-1M Phân đoạn chứa enzyme sấy thăng hoa (đông khô) với chất saccharose làm chất ổn định với tỷ lệ 2,5mg/1mg enzyme Chế phẩm thu có hoạt tính tăng 25 lần so với ban đầu hiệu suất thu hồi 43% 3.4 Kết 3.4.1 Khảo sát phương pháp tinh urease từ đậu nành 3.4.1.1 Khảo sát nồng độ aceton để kết tủa enzyme Kết so sánh độ tinh hiệu suất thu hồi enzym urease tủa với nồng độ aceton từ 30% - 60% trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết so sánh hiệu tủa enzym nồng độ aceton khác Giai đoạn Trích ly Aceton 30% Aceton 40% Aceton 50% Aceton 60% V dịch , ml P, mg/ml m bột , mg (mg/mg) 150.00 882.75 2976.00 3313.24 3788.25 19.69 0.21 0.46 0.45 0.44 Pt, mg 2953.50 185.38 1368.96 1490.96 1666.83 A, UI/ml (UI/mg) 104.40 1.36 1.79 1.87 2.91 At, UI 15660.00 1200.54 5327.04 695.76 11023.81 Ap UI/mg Pr 5.30 6.48 3.89 4.16 6.61 Độ tinh H, % 1.00 1.22 0.73 0.78 1.25 100 7.67 34.02 39.55 70.39 Kết bảng 3.1 cho thấy độ tinh mẫu tủa 30% 60% aceton gần lớn 1, hiệu suất thu hồi nồng độ aceton 60% nhiều gấp 10 lần so với nồng độ aceton 30% Ở mẫu tủa 40% 50% aceton có độ tinh thấp nhỏ hiệu suất thu hồi enzym không cao Kiểm tra mẫu qua điện di gel acrylamid 10%, kết trình bày hình 3.1 24 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Hình 3.4 Kết điện di urease tủa nồng độ aceton khác Điện di đồ hình 3.4 cho thấy: urease đậu rựa dù dạng tinh khiết xuất vạch rõ ràng, điều chứng tỏ urease đậu rựa loại enzyme heterogeneous Điện di đồ đậu nành chứa đủ vệt có điện di đồ đậu rựa Ngoài điện di đồ đậu nành chứa số vạch khác rõ ràng, đặc biệt vạch thứ với độ đậm tăng dần từ nồng độ aceton 30% - 60% Kết chạy điện di cho thấy phương pháp tủa aceton có hiệu tinh chưa cao, lẫn nhiều protein tạp nên mẫu điện di chưa có phân tách rõ ràng Như từ kết kiểm tra hiệu tinh cho thấy nồng độ aceton 60% nồng độ dung môi làm tủa enzyme urease có hiệu độ tinh hiệu suất thu hồi enzyme 3.3.1.2 Khảo sát kết tủa phân đoạn (NH 4)2SO4 Kết xác định độ tinh hiệu suất thu hồi hai phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 So sánh hiệu tinh phương pháp tủa phân đoạn (NH 4)2SO4 Giai đoạn Trích ly P Pháp P Pháp V dịch , ml P, mg/ml m bột , mg 150.00 1896.72 1214.25 (mg/mg) 19.69 0.19 0.19 Pt, mg A, UI/ml (UI/mg) 104.40 1.60 1.36 2953.50 360.38 230.71 A t, UI Ap , UI/mg pr Tinh H, % 15660.00 3034.75 1651.38 5.30 8.42 7.16 1.00 1.59 1.35 100 19.38 10.55 Các số liệu thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ tinh enzyme hiệu suất thu hồi enzyme cao so với phương pháp Tuy nhiên hiệu suất thu 25 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT hồi enzyme phương pháp thấp, 10 – 20% Kiểm tra mẫu qua điện di gel acrylamid 10%, kết trình bày hình 3.5 Hình 3.5 Kết chạy điện di mẫu urease thu từ hai phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon Kết điện di cho thấy, hai mẫu tủa Sunfate amonium xuất vạch tương đồng với mẫu chuẩn chứa vạch so với mẫu trích ly Ở mẫu tủa theo phương pháp loại bớt protein tạp vạch số số 4, nhiên sót thể thành vạch mờ Ở mẫu tủa sunfat amon theo phương pháp loại hoàn toàn protein tạp vạch 2, so với mẫu trích ly Điện di đồ mẫu tủa theo phương pháp lại vạch Như vậy, phương pháp tủa phân đoạn Sunfate amonium theo phương pháp đem lại hiệu tinh tốt phương pháp Do chọn tủa Sunfate amonium theo phương pháp để tiếp tục bước nghiên cứu sau 3.3.1.3 Khảo sát trình tinh urease phương pháp sắc ký cột Sephadex G-50 Lấy 0,5ml dịch trích ly điều chỉnh pH = cho lên cột Sephadex G-50) Rửa cột đệm phosphate pH = 7; 1/15M Kiểm tra hàm lượng protein hoạt tính enzyme phân đoạn 26 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Biểu đồ 3.1 Sắc ký đồ dịch trích ly từ đậu nành qua cột Sephadex G - 100 Hình 3.6 Kết điện di mẫu qua cột qua cột SephadexG-50Sephadex, phân đoạn Từ sắc ký đồ cho thấy vị trí cực đại peak protein vị trí cực đại peak enzyme phân đoạn Để kiểm tra hiệu tinh sạch, tiến hành chạy điện di gel acrylamide 10% với chất chuẩn urease từ đậu rựa Kết trình bày hình 3.6 Sắc ký đồ gel acrylamide cho thấy tất vạch mẫu trích ly xuất mẫu qua tinh Sephadex Điều có nghĩa trước sau chạy sắc ký lọc gel cột Sephadex G-50 chưa có hiệu mặt tinh sạch, Sephadex G-50 không phù hợp nên chưa thể loại bỏ số tạp chất 3.3.1.4 Siêu lọc 27 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Dịch trích ly cho qua thiết bị lọc màng membrane có kích cỡ lỗ 10000 Da, áp suất lọc 2.5 bar, lọc 2h Sau qua siêu lọc, nồng độ enzyme mẫu cao Bảng 3.3 Kết đánh giá hiệu tinh phương pháp siêu lọc Giai đoạn Trích ly Dung dịch siêu lọc Siêu lọc đk V dịch , ml P, mg/ml m bột , mg 150.00 (mg/mg) 27.28 90.00 6876.40 A, UI/ml Pt, mg Độ tinh A p , UI/mg pr 4029.00 (UI/mg) 68.40 A t, UI 10260.00 2.51 1.00 H, % 29.34 2640.60 78.14 7032.60 2.66 1.06 68.54 0.43 2956.85 0.76 5226.06 1.77 0.71 50.94 100 Khi sử dụng màng lọc 10000 Da nhỏ so với phân tử Urease nên hiệu tinh không cao, làm dịch enzyme đậm đặc Dịch siêu lọc sau đông khô bị giảm hoạt tính, số chất ổn định hoạt tính urease L-Cystein, EDTANa bị loại siêu lọc 3.3.2 So sánh phương pháp tinh Kết so sánh phương pháp tinh sơ enzym urease trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 So sánh hiệu tinh phương pháp Giai đoạn Trích ly Dung dịch lọc SK Cephadex (NH 4) SO 65% Aceton 60% V dịch , ml P, mg/ml m bột , mg 150.00 90.00 (mg/mg) 27.28 29.34 300.00 Pt, mg A, UI/ml A p , UI/mg pr 4029.00 2640.60 (UI/mg) 68.40 78.14 A t, UI 10260.00 7032.60 7.88 2362.50 23.08 1906.00 0.39 743.34 4837.13 0.46 2225.08 Độ tinh H, % 2.51 2.66 1.00 1.06 100 68.54 6924.00 2.93 1.17 57.88 1.48 2820.88 3.79 1.51 27.49 1.47 7110.58 3.19 1.27 69.30 Kết cho thấy tủa phân đoạn (NH 4)2SO4 theo phương pháp cho độ tinh cao (1,51), hiệu suất thu hồi lại tương đối thấp (18,01%) Ở phương pháp siêu lọc sắc ký Cephadex hiệu suất thu hồi cao, hiệu tinh lại không cao Phương pháp tủa aceton 69% thực đơn giản, thời gian tủa ngắn dễ thu hồi, trình không ổn định, enzyme dễ biến tính Hơn nữa, bột sau đông khô độ hoà tan Bột đông khô thu từ mẫu tủa sunfat amon có độ tan tốt Kiểm tra mẫu qua điện di gel acrylamid 10%, kết trình bày hình 3.7 28 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Hình 3.7 Kết điện di urease qua phương pháp tinh Kết điện di hoàn toàn phù hợp với số liệu thực nghiệm bảng 3.4 Các phương pháp sắc ký rây phân tử, siêu lọc, tủa aceton không đem lại hiệu tinh cao, điều thể qua điện di đồ nhiều vạch tạp chất Ở mẫu tủa sunfat amon theo phương pháp có hiệu tinh cao nhất, điện di đồ vạch rõ ràng, vạch tương ứng với vạch điện di đồ urease đậu rựa vạch thứ đậm Từ nhận xét trên, định chọn phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon theo phương pháp để tiếp tục qua sắc ký trao đổi ion 3.3.3 Kết tinh cột sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose Trong phần này, thực thí nghiệm song song: 1) Mẫu enzyme urease đậu nành sau tinh phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon qua thẩm tích đối nước qua cột trao đổi ion DEAE – cellulose, dùng hệ đệm phosphat pH = 1/15M, gradient muối NaCl nồng độ từ – 1M Sắc ký đồ trình bày biểu đồ 3.2 2) Dung dịch sau thẩm tích đông khô chạy sắc ký trao đổi ion cột DEAE cellulose Sắc ký đồ trình bày biểu đồ 3.3 29 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Biểu đồ 3.2 Sắc ký đồ DEAE-Cellullose dịch tủa (NH 4)2SO phương pháp Biểu đồ 3.3 Sắc ký đồ DEAE-cellulose bột tủa (NH 4)2SO phương pháp đông khô Sắc ký đồ cho thấy tách phân đoạn dung dịch enzyme sau tủa (NH 4)2SO4 nhờ sắc ký trao đổi ion thu peak protein peak enzyme Vị trí cực đại peak enzyme trùng với vị trí cực đại peak protein thứ nồng độ muối 0,3M Enzyme tủa phân đoạn (NH 4)2SO4 sau đông khô qua sắc ký trao đổi ion có sắc ký đồ tương tự sắc ký đồ mẫu chưa đông khô, gồm peak protein peak enzyme Peak enzyme trùng với peak protein thứ 3, hoạt tính enzyme tập trung ống 11 12, ống 12 có hoạt tính cao Như vậy, mẫu dung dịch tủa (NH 4)2SO4 tủa (NH 4)2SO4 qua đông khô, enzyme urease đẩy nồng độ 30 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT muối 0,3M Peak chứa enzyme urease thu sau sắc ký trao đổi ion kiểm tra độ tinh qua điện di, kết trình bày hình 3.8 Hình 3.8 Kết tinh qua giai đoạn tinh Kết điện di cho thấy, hiệu tinh kết tách phân đoạn qua cột sắc ký cao, loại bỏ gần toàn protein tạp Nhờ vậy, điện di đồ vạch rõ Kết hoàn toàn phù hợp với kết số nghiên cứu trước Từ đó, kết luận: urease đậu nành (Glycine max) đậu rựa (jackbean) có hoạt lực thuỷ phân nguyên liệu đặc hiệu khác phân tử lượng thành phần cấu tạo, cụ thể kết sắc ký đồ điện di đồ thí nghiệm công trình nghiên cứu trước urease đậu rựa (jackbean) loại enzyme heterogeneous, urease đậu nành (Glycine max) homogeneous Bảng 3.5 Kết tổng kết qua giai đoạn tinh Giai đoạn Trích ly Dung dịch (NH 4) SO DEAE -Cell dung dịch (NH ) 2SO đk DEAE – Cell đk V dịch , ml P, mg/ml m bột , mg 150.00 (mg/mg) 24.66 75.00 Pt, mg A, UI/ml Độ tinh A p , UI/mg pr 3669.00 (UI/mg) 62.47 A t, UI 9370.50 2.55 1.00 14.25 1068.75 55.29 4146.75 3.88 1.52 44.25 225.00 2.46 553.50 10.13 2279.25 4.12 1.62 24.32 1897.23 0.35 664.03 1.34 2542.29 3.83 1.50 27.13 379.45 0.98 371.86 5.07 1923.81 5.17 2.03 20.53 31 H, % 100 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Như vậy, qua cấp tinh urease tách khỏi protein tạp khác Ở mẫu tủa (NH 4)2SO4 qua đông khô qua cột DEAE-cellulose hoạt tính chủ yếu tập trung ống, độ tinh cao mẫu dịch tủa (NH 4)2SO4 đạt 2,03 với hiệu suất thu hồi enzyme 20,53 Kết Luận Các phương pháp tinh protein có ưu nhược điểm riêng ứng dụng vào sản phẩm cụ thể So sánh phương pháp tinh sơ enzyme urease kiểm tra độ tinh điện di gel acrylamide nhận thấy phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon 65% 55% hiệu so với phương pháp siêu lọc, tủa aceton, sắc ký rây phân tử Sắc ký trao đổi ion DEAE - cellulose thu peak protein peak enzyme urease ứng với nồng độ muối 0,3M Quy trình thu nhận tinh enzyme urease từ đậu nành loại bỏ gần toàn protein tạp, độ tinh đạt 2,03 hiệu suất thu hồi enzyme 20,53 Sử dụng điện di để kiểm tra độ tinh enzyme xác định urease đậu nành loại homogeneous So sánh phương pháp tinh sơ enzyme urease: tủa phân đoạn sunfat amon, tủa aceton, sắc ký rây phân tử siêu lọc Dựa vào kết xác định độ tinh sạch, hiệu suất tinh enzyme kết kiểm tra độ tinh điện di gel acrylamid phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon nồng độ 65% 55% bão hoà hiệu Tiếp tục thực tinh qua sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose, sắc ký đồ cho thấy có peak protein có peak enzyme urease ứng với nồng độ muối 0,3 M Thu nhận peak enzyme, kiểm tra điện di gel acrylamid xác định urease đậu nành loại homogeneous 32 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Tài liệu tham khảo 1/ Tài liệu tiếng việt Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Đạt Trường Đại học Bán công Tôn Đức Thắng; Nghiên cứu thu nhận, tinh urease từ đậu nành; Tạp chí phát triển khoa học công nghệ, tập 9, số - 2006 2/ Tài liệu internet http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=3019 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/tinh-sach-protein-p-2-.319278.html http://www.wattpad.com/1223494-cau6%2B7cnpe?p=2 http://www.wattpad.com/1223494-cau6%2B7cnpe?p=3 Giáo trình công nghệ enzyme http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/341029/cm_id/887927 http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn /vn /portal/ InfoDetai l.jsp?a rea=58& cat=1092 &ID=1528 http://www.wattpad.com/1223445-cau2cnpe?p=2 10 http://www.wattpad.com/1223445-cau2cnpe?p=1 11 http://www.wattpad.com/820300-protein?p=10 12 http://docs.google.com/viewer? a=v&q=cache:dbcDp_YLhOoJ:mt.lhu.edu.vn/Data/News/388/file/Chuong_3(1).pdf +thu+nh%E1%BA%ADn+protein+b%E1%BA%B1ng+t%E1%BB %A7a&hl=vi&gl=vn&pid=bl&srcid=ADGEESiRdMGsKxdGlS9tAdMT7IfenAMB 0s5Wj9n4WCeRjOVJnYNDyQ5JP9xROkxDBcY134LkZvbjO7M2kuCM9RGi3R9zwAaaL7_IyjkUwDy947-P4SBVgu91JCUgduQy_dIUk MaVOl7&sig =AHIEtbTHWdMFv1M5Igq3VB3kxGCGgSE3xQ 13 http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?cateid=8&id=32 14 http://d.violet.vn/uploads/resources/162/410788/preview.swf 33 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT MỤC LỤC Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC): HPLC sắc ký cột (column chromatograph ) kèm với detector nhạy để phát chất tách trình chạy sắc ký Với tiến kỹ thuật cột, detector chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh hiệu suất cao Loại cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lương vài ml/ phút Số lượng mẫu phân tích HPLC cần khoảng 20 microlit [7] Phương pháp sắc ký khí: điểm phân biệt sắc ký lỏng cao áp (HPLC) sắc ký khí (GC) phương pháp HPLC, mẫu cần làm hoà tan mà không cần làm bay hơi, HPLC phân tích chất mà không sợ gây phân hủy nhiệt độ trình phân tích [7] 34 [...]... nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease và kit urease từ nước ngoài với giá thành rất cao Do đó tôi thực hiện đề tài này nhằm tìm ra một quy trình tinh sạch urease hiệu quả nhất từ đậu nành, một nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm Đồng thời sử dụng phương pháp điện di trên gel acrylamide để nghiên cứu thành phần enzyme urease từ đậu nành 3.2 Urease 20 Đồ án công nghệ 1 Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT... enzyme urease và đã đưa ra nhiều phương pháp tinh sạch urease, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào so sánh giữa các phương pháp tinh sạch khác nhau Ở nước ta, cũng đã có một số nghiên cứu tinh sạch enzym urease từ đậu nành nhưng cũng chưa đưa được quy trình tinh sạch hiệu quả và chưa được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm urease Ngành Y học và Thực Phẩm ở nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease. .. được trình bày ở hình 3.1 24 Đồ án công nghệ 1 Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT Hình 3.4 Kết quả điện di urease tủa ở các nồng độ aceton khác nhau Điện di đồ trên hình 3.4 cho thấy: urease đậu rựa dù đã ở dạng rất tinh khiết vẫn xuất hiện 3 vạch rõ ràng, điều đó chứng tỏ urease của đậu rựa là một loại enzyme heterogeneous Điện di đồ đậu nành chứa đủ các vệt có trong điện di đồ đậu rựa Ngoài ra điện di đồ đậu nành. .. Từ đó, chúng tôi có thể kết luận: urease đậu nành (Glycine max) và đậu rựa (jackbean) mặc dù có hoạt lực thuỷ phân nguyên liệu đặc hiệu như nhau nhưng khác nhau về phân tử lượng cũng như thành phần cấu tạo, cụ thể là kết quả trên sắc ký đồ và điện di đồ trong thí nghiệm của chúng tôi cũng như trong các công trình nghiên cứu trước đây thì urease đậu rựa (jackbean) là loại enzyme heterogeneous, còn urease. .. tinh sạch sơ bộ enzyme urease và kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di trên gel acrylamide và nhận thấy phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon 65% và 55% là hiệu quả nhất so với các phương pháp siêu lọc, tủa aceton, sắc ký rây phân tử Sắc ký trao đổi ion trên DEAE - cellulose thu được 3 peak protein và 1 peak enzyme urease ứng với nồng độ muối 0,3M Quy trình thu nhận và tinh sạch enzyme urease từ đậu nành. .. tạp, độ tinh sạch đạt được là 2,03 và hiệu suất thu hồi enzyme là 20,53 Sử dụng điện di để kiểm tra độ tinh sạch enzyme và xác định được urease đậu nành là loại homogeneous So sánh các phương pháp tinh sạch sơ bộ enzyme urease: tủa phân đoạn sunfat amon, tủa bằng aceton, sắc ký rây phân tử và siêu lọc Dựa vào kết quả xác định độ tinh sạch, hiệu suất tinh sạch enzyme và kết quả kiểm tra độ tinh sạch... nhỏ so với phân tử Urease nên hiệu quả tinh sạch không cao, chỉ làm dịch enzyme đậm đặc hơn Dịch siêu lọc sau đông khô bị giảm hoạt tính, có thể do một số chất ổn định hoạt tính urease như L-Cystein, EDTANa 2 đã bị loại khi siêu lọc 3.3.2 So sánh các phương pháp tinh sạch Kết quả so sánh các phương pháp tinh sạch sơ bộ enzym urease trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4 So sánh hiệu quả tinh sạch của các phương... độ NaCl từ 0-1M Phân đoạn chứa enzyme được sấy thăng hoa (đông khô) với chất saccharose làm chất ổn định với tỷ lệ 2,5mg/1mg enzyme Chế phẩm thu được có hoạt tính tăng 25 lần so với ban đầu và hiệu suất thu hồi 43% 3.4 Kết quả 3.4.1 Khảo sát các phương pháp tinh sạch urease từ đậu nành 3.4.1.1 Khảo sát nồng độ aceton để kết tủa enzyme Kết quả so sánh độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi enzym urease khi... 6 với độ đậm tăng dần từ nồng độ aceton 30% - 60% Kết quả chạy điện di cho thấy phương pháp tủa bằng aceton có hiệu quả tinh sạch chưa cao, còn lẫn nhiều protein tạp nên các mẫu điện di chưa có sự phân tách rõ ràng Như vậy từ kết quả kiểm tra hiệu quả tinh sạch trên cho thấy nồng độ aceton 60% là nồng độ dung môi làm tủa enzyme urease có hiệu quả nhất về độ tinh sạch cũng như hiệu suất thu hồi enzyme... dịch trích ly từ đậu nành khi qua cột Sephadex G - 100 Hình 3.6 Kết quả điện di mẫu đã qua cột khi qua cột SephadexG-50Sephadex, ở phân đoạn 4 Từ sắc ký đồ cho thấy vị trí cực đại của peak protein cũng chính là vị trí cực đại của peak enzyme ở phân đoạn 4 Để kiểm tra hiệu quả tinh sạch, chúng tôi tiến hành chạy điện di trên gel acrylamide 10% với chất chuẩn là urease từ đậu rựa Kết quả trình bày ở hình ... http://www.wattpad.com/1223494-cau6%2B7cnpe?p=2 http://www.wattpad.com/1223494-cau6%2B7cnpe?p=3 Giáo trình công nghệ enzyme http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/341029/cm_id/887927 http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn /vn