Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung
Trang 1MỞ ĐẦU
Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinhhọc đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung Thế kỷ 21được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học, được coi là thời điểm lịch sử màcon tầu vũ trụ mang tên “ công nghệ sinh học” đã rời khỏi bệ phóng để bay đến tầmcao mới.Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự pháttriển của thực vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn hợp chất tựnhiên và nguồn nguyên liệu để phát triển ngành công nghệ sinh học nước nhà
Trong những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất từ thực vật đãkhông ngừng phát triển và và bước đầu đạt được những thành quả đáng kể Trên thếgiới từ rất lâu người ta đã ứng dụng những công nghệ này để sản xuất các chất cóhoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất và phục vụ lợi ích của conngười Những nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học ở thực vật phát triển từnhững năm 1950 Có khoảng hơn 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật cóhoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống Những hợp chất này như các alkaloid,terpenoid, phenolic… được biết đến như là các hợp chất thứ cấp Các hợp chất nàythường chỉ được tạo ra ở một số loại tế bào nhất định như các tế bào rễ tơ, biểu mô,hoa, lá…
Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiềuhợp chất có hoạt tính sinh học (thường gọi là các chất thứ cấp) vẫn còn khó tổnghợp hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt Chẳng hạn, một số hỗn hợpphức tạp như tinh dầu hoa hồng là không thể tổng hợp hóa học được
Ngày nay, những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây
cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sócsức khoẻ con người Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ
Trang 2dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệtdược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ tửvong rất nhiều song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất
đi chỗ đứng trong Y học Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trựctiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìmkiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các bệnh thông thường cũng như cácbệnh nan y
Xuất phát từ thực tế trên, tôi đã tiến hành tìm hiểu đề tài: Nghiên cứu alkaloid
& quy trình tách chiết một số chất có bản chất là alkaloid.
Mục tiêu của đề tài:
- Tìm hiểu về alkaloid, cấu tạo hóa học và phân loại của alkaloid, các phươngpháp chiết xuất các alcaloid
- Đưa ra một số quy trình tách chiết hoạt chất có bản chất là alcaloid
Trang 3CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT THỨ CẤP & ALKALOID
I Hợp chất thứ cấp trong thực vật.
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ giathực phẩm có giá trị Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứcấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổichất chưa được biết đầy đủ Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóahọc của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật vàđộng vật
Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển
từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002) Các chất trao đổi thứ cấp cóthể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside [3]
1.1 Những nghiên cứu về hợp chất thứ cấp trên thế giới.
Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có
khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia) [38] Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm
Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồngtrứng Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thưbuồng trứng và ung thư vú Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân
có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác và nó được xem như làchất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư [11] Tuy nhiên, sử dụngtaxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của câythông đỏ tự nhiên Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khốilượng khô Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mgtaxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư Sở dĩ nguồn taxol
Trang 4những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăngtrong y học
Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để
cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của [32] Hiện nay, việc sản xuất
taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng dụng
rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn.Fett-Neto và cộng sự (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và
một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T Cuspidata [14].
Srinivasan và cộng sự (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế
bào của T Baccata [34]. Lee và cộng sự (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng
nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở
độ cao 2000 m so với mực nước biển Các dòng tế bào thu được từ callus có nguồngốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vàomôi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng
200 mg taxol [21]
Tsay và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào
huyền phù của cây Angelica dahurica var Formosana Đây là một loài cây bản địa
lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến.Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da
Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var formosana bằng phương pháp nhân giống
truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được nhu cầu Vì vậy,phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sửdụng Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sảnphẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày Benzylaminopurine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệthích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-
2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose
và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin Vai trò của elicitor cũng đã được khảo
Trang 5sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin,quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào Bổ sung vanadyl sulphate ởnồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy.Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổnghợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10 Hàm lượng imperatorinsản xuất bởi phương thức này đạt 460 μg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140g khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140lần [37]
Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica
và vỏ của cây Phellondendron amurense Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6
năm Yamada và Sato (1981) đã chọn dòng tế bào có khả năng có khả năng sản xuất
berberine cao của loài C japonica [42] Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản)
đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10-8 M gibberellic acid vào môitrường, hiệu suất berberine đã tăng lên rất nhiều tới 1,66 g/L [24]
Merkli và cộng sự (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes Các rễ tơ
foenum-này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp synthesis) của các hormone steroid Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8tháng tuổi (0,024 %) Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pHmôi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin Kết quả cho thấy bổ sung
(semi-40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3lần so với đối chứng [23]
Yeh và cộng sự (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào
huyền phù của cây Dioscorea doryophora Phương pháp này được sử dụng như một
cách thay thế quá trình tổng hợp steroid Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lậpbằng cách đưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
Trang 6diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khốilượng khô Sản xuất
diosgenin từ cây D doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được
ứng dụng trên quy mô công nghiệp [44]
Gentiana davidii var formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan.
Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền TrungQuốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc [45].Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi
Gentiana [29] Chueh và cộng sự (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
tế bào huyền phù của G davidii var formosa để sản xuất gentipicroside và
swertiamarin, hai dược chất quan trọng Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khinuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin
và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy[10]
Miyasaka và cộng sự (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi
cấy callus cây Salvia miltiorrhiza Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae
và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân
gian Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy
callus S.miltiorrhiza đã được khảo sát Callus sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh
lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D Callus sau đó phát triểnnhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA Kết quả phân tíchHPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượngkhô) Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượngcryptotanshinone trong callus tăng lên Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thuđược trong callus nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59mg/g khối lượng khô [25], [41]
Shikonin, một loại sắc tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây
Lithospermum erythrorhizon Tuy nhiên, người ta đã tạo được dòng tế bào rễ cây
Trang 7Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ
nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôicấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm nhiều giá thành của shikonin
Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u được tìm thấy ở các
cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum Nó cũng được dùng để
tổng hợp các dẫn xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chốngkhối u [17] Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế
đã hạn chế việc cung cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới mộtphương thức thay thế khác Nuôi cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã đượcKadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1981 và 1982 [19], [20].Woerdenberg và cộng sự (1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferylalcohol và b-cyclodextrin bổ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù của
P hexandrum Bổ sung phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất
podophyllotoxin lên 0.013% theo khối lương khô, trong khi các nuôi cấy không cóprecursor chỉ sản xuất được 0.0035% podophyllotoxin [40] Smollny và cộng sự
(1992) đã thông báo callus và tế bào huyền phù của Lilium album đã sản xuất được
0.3% podophyllotoxin [33]
Việc sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa họcthực vật Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biếtngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trìnhchuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thươngmại [3]
Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y-dược ngày càng tăng nhưngsản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triểnkhông ngừng của công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh [3]
1.2 Vài nét về tình hình nghiên cứu hợp chất thứ cấp ở Việt Nam.
Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết các hợp chất thứu cấp chủ yếu gắn liền với
Trang 8đã đạt được nhiều thành công, đáng kể nhất chính là quy trình sản xuất sâm NgọcLinh do Học viện Quân y khai thác Chỉ với một vài tế bào từ rễ củ sâm Ngọc Linh,bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào, các nhà khoa học của Học viện Quân y đã có thể sảnxuất sâm Ngọc Linh với số lượng lớn trong vòng 10-20 ngày Cụ thể là đã hoànchỉnh quy trình nuôi cấy tế bào, xây dựng được quy trình định tính và định lượngcác thành phần ginsenosid trong sinh khối sâm Ngọc Linh bằng sắc kí lỏng hiệunăng cao (HPLC), so sánh với sâm Ngọc Linh tự nhiên và chất chuẩn; đánh giá tính
an toàn và tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh, bào chế thành công được một sốchế phẩm từ hoạt chất chiết xuất từ sâm Ngọc Linh sinh khối như nước uống tănglực và viên nang mềm Các công nghệ này đang được Công ty Nước khoáng TiềnHải (Thái Bình) đề xuất chuyển giao để sản xuất nước tăng lực Phương pháp sảnxuất sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh được cấp bằng độc quyền sáng chế số 7523vào ngày 11/02/2009 tại Việt Nam [6]
Việt Nam cũng đang triển khai các dự án nuôi cấy và chiết xuất taxol từ câythông đỏ ở Lâm Đồng Ngoài ra còn có “Nghiên cứu sản xuất arteminisin dùng kỹthuật nuôi cấy tế bào từ cây thanh hao hoa vàng” của Viện Sinh học Nhiệt đới trongnghị định thư hợp tác với Malaysia (2007-2010) hay đại học Huế “Nghiên cứu khả
năng tích lũy glycoalkaloid ở callus cây cà gai leo Solanum hainanense” Tuy
nhiên, những dự án nói trên vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm Phát triển các kỹthuật nuôi cấy trong các bioreactor ở quy mô công nghiệp để sản xuất các hợp chất
có hoạt tính sinh học vẫn còn là một con đường đầy tiềm năng chưa được khai pháhết của nền công nghệ tách chiết các hợp chất thứu sinh từ thực vật ở Việt Nam [6]
II Alkaloid.
2.1 Lịch sử phát hiện.
Năm 1804- 1805, pháp và Đức đã phân lập được morphin và điều chế đượcdạng muối của nó Đồng thời đã chứng minh được morphin là hoạt chất chính củacây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt
Trang 9Năm 1980, từ vỏ cây canhkina, đã chiết và kết tinh được một chất đặt tên là
“cinchonino” sau đó hai nhà hóa học pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp củahai alcaloid là quinin và cinchonin
Năm 1918, phát hiện ra alcaloid của hạt mã tiền là strycnin và bruxin
Năm 1918 phát hiện ra được cafein trong chè, cà phê rồi sau đó là nicotin trongthuốc lá, atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốcphiện, cocain trong lá coca
Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 Alcaloid khác nhau trong đó
có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học Hiện nay đã phát hiện ra được rấtnhiều số lượng Alcaloid và cũng đã đưa vào ứng dụng trong y học ngày một tăng[5]
2.2 Khái quát về Alkaloid [1][5][26].
2.2.1 Khái niệm.
Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm Alkaloid là:
- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ởtrong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật
- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh
- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng
- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng.Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt Đặc biệt tronglĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độcđáo
2.2.2 Cấu tạo hóa học.
Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành mộtchuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạpchí thông tin về hóa học Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi
vì chúng có hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủ yếu
Trang 10Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủyếu nằm trong vòng Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin,Hordenin, là các protoalkaloid Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyếtđịnh tính bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trongnghiên cứu alkaloid.
2.2.3 Phân loại.
Đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500 hợp chấtalkaloid trong tự nhiên Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản trướcđây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) xét ra chưa đáp ứng nên ngày càng có xu hướngchia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin, Yohimbin,Strychnin, Echitamin Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chia thành cácnhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin, Benzophenanthridin…
Bảng 1:Một số dạng cấu trúc nhóm Alkaloid
Trang 11Purin Cafein, Theophylin
Trang 12nhiều Alkaloid hơn cây lưu niên (Levin, 1976) Alkaloid không có trong loài sống ởnước ngoại trừ họ sen (Nympheaceae) (Mc.Nair.1943).
Thực ra rất nhiều loài có Alkaloid nhưng chỉ ở mức độ dạng vết hoặc ở tỷ lệphần vạn, mười vạn Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là cóAlkaloid phải chứa ít nhất là 0.05% Alkaloid so với dược liệu khô
Mối liên quan giữa Alkaloid với các chất khác trong 1 cây cũng đã đượcnghiên cứu Cây có chứa Alkaloid đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại(Trelibs,1955) Hiện tượng này đưa đến ý kiến cho rằng chức năng của 2 nhóm hợpchất này đối với cây cỏ là giống nhau
Một vài nhận xét khác là sự có mặt của axit amin thông thường và 1 vài loạiaxit amin đặc biệt (tiền chất của Alkaloid) trong các loài với nồng độ song song vớinồng độ Alkaloid (Michels – Nyomorkay, 1970; Paris và Girre, 1969) Điều nàykhẳng định thêm quá trình tổng hợp Alkaloid trong cây bắt nguồn từ các axit amin
Có thể nói giai đoạn quan trọng đầu tiên trong sự chuyển hóa axit amin thànhAlkaloid là sự khử Cacboxyl thành một amin và tiếp đến là sự oxy hóa amin nàythành andehyt bởi men oxydaza amin Việc ngưng tụ một nhóm amin bởi Andehytdẫn đến tạo các vòng đặc trưng cho Alkaloid
Mặc dù đại đa số Alkaloid dẫn xuất của axit amin nhưng một số Alkaloid kháclại bắt nguồn từ một số tiền chất riêng Bằng phương pháp dùng axit amin cónguyên tố đồng đánh dấu người ta chứng minh rõ ràng về các tiền chất Alkaloid
2.3 Tính chất của Alkaloid [1][26].
2.3.1 Tính bazơ.
Trang 13Alkaloid là các bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử N Nhưng độ kiềm củaAlkaloid không giống nhau do ảnh hưởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử Ngây ra và ảnh hưởng của các nhóm chức khác Nói chung tính bazơ giảm dần theothứ tự Amoni bậc 4, Amoni bậc 1, Amoni bậc 2, Amoni bậc 3 Tính bazơ phản ánhở pKa khác nhau của các Alkaloid Các bazơ yếu (trị số pKa thấp) sẽ cần môitrường axit mạnh hơn để tạo thành muối trong dung dịch nước Vì vậy ở môi trườngaxit yếu một số Alkaloid bazơ mạnh có thể chuyển thành muối trong khi các bazơyếu vẫn tồn tại trong dung dịch dưới dạng bazơ Đặc tính này được ứng dụng trongviệc tách các nhóm Alkaloid có trị số pKa khác nhau bởi hỗn hợp của chúng.
Bảng 2: Giá trị pKa của một số Alkaloid ở cây thuốc lá.
2.3.2 Tính hòa tan.
Hầu hết các Alkaloid bazơ thực tế không tan trong nước nhưng tan trong cácdung môi hữu cơ như CHCl3, ete và các ancol bậc thấp (MeOH, EtOH, PrOH,BuOH)
Trang 14Một số nhóm Alkaloid có thêm các nhóm phân cực nên tạo được một phầntrong nước hoặc trong kiềm Ví dụ: Mocphin, Cephalin, do có nhóm OH phenol nêntan trong dung dịch kiềm và các bazơ của chúng thi gần như là không tan trong ete.Ngược lại với bazơ, các muối Alkaloid nói chung tan được trong nước và cồnnhưng hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: CHCl3 ete, benzene.
Có một số trường hợp ngoại lệ như Ephedrin, Colchixin, Ecgovonin, các bazơcủa chúng tan được trong nước nhưng cũng khá tan trong dung môi hữu cơ và cácmuối của chúng thì ngược lại
* Alkaloid có N – Bậc 4 và N – Oxit
Bazơ của Alkaloid có N – Bậc 4 và N – Oxit khác tan trong nước và trongkiềm ít tan trong dung môi hữu cơ Các muối của chúng có độ hòa tan khác nhautùy thuộc vào gốc axit tạo ra chúng Vì vậy có thể chiết chúng bằng dung dịch kiềm
và kết tủa dưới dạng muối có độ hòa tan thấp nhất
Đối với các Alkaloid N – Oxit thì dùng phản ứng khử Oxy bằng bột kẽm trongmôi trường HCl để chúng chuyển thành Alkaloid dạng thường sau đó kết tủa bằngkiềm và chiết bằng dung môi hữu cơ
2.4 Cơ sở và nguyên tắc tách chiết Alkaloid [1][26]
2.4.1 Cơ sở và nguyên tắc.
- Dựa vào những định luật chi phối của quá trình chiết xuất là khuếch tán, thẩmthấu, thẩm tích, độ hòa tan
- Dựa vào khă năng hòa tan của các Alkaloid trong các dung môi hữu cơ, vô cơ
và nước mà ta tiến hành tách chiết các Alkaloid ra khỏi nguyên luyện
- Dựa vào các tính chất lý hóa của các Alkaloid mà ta tiến hành tác chiết vàtinh sạch chúng
2.4.2 Một số đặc tính khác cần chú ý trong quá trình chiết xuất.
Trong cây, Alkaloid tồn tại dưới dạng muối của các axit hữu cơ nhưng một sốkết hợp với tanin (nhất là những cây có nhiều tanin) vì vậy đối với dược liệu có
Trang 15nhiều tanin thì cần dùng dung môi có độ phân cực mạnh hơn hoặc chiết nóng đểtách Alkaloid ra khỏi tanin và hòa tan vào dung môi.
Một số loại Alkaloid là các este như Atropin, Cocain, Heliotrin có thể bị thủyphân trong quá trình chiết xuất nên rất hạn chế sử dụng nhiệt độ cao Ngược lại một
số Alkaloid tồn tại trong cây dưới dạng Glycozit (Glycoancaloit) như Solamacgin,solasonin trong các loài Solanum Để chiết các Alkaloid này cần có giai đoạn thủyphân
Nói chung, một số Alkaloid là một chất tương đối bền vững so với nhiều chất
tự nhiên khác Nhưng một số hợp chất thuộc nhóm indol rất dễ bị thủy phân hoặcbiến chất bởi ánh sáng và các tác nhân oxy hóa – khử khác nên cần chú ý khống chếcác yếu tố có thể làm hỏng Alkaloid trong quá trình chiết xuất trong khí quyển nitơ.Đại đa số các Alkaloid là chất kết tinh không màu và có điểm chảy xác định,chỉ có một số ít Alkaloid có màu vàng (Becberin, Palmatin, Secpentin…) có thể lợidụng chúng trong quá trình chiết tách
2.5 Chiết xuất Alkaloid [1][5][26].
Nói chung Alkaloid có thể chiết từ dược liệu khô tán bột Để hạn chế khó khăntrong quá trình chiết tách, đối với dược liệu nhiều chất béo, chất màu nên có giaiđoạn loại tạp Có 2 cách :
- Ngâm bột dược liệu với ete dầu hoặc ete trong vài giờ hoặc 1 ngày
- Chiết liên tục bằng Soxhlet hoặc hồi lưu với ete dầu trong 1 – 2 giờ Bột loạitạp xong, để khô tự nhiên
Có 2 phương pháp chính để chiết xuất Alkaloid: Chiết bằng dung môi hữu cơ vàchiết bằng dung dịch nước axit hoặc cồn
2.5.1 Chiết bằng dung môi hữu cơ.
Để chiết Alkaloid bằng dung môi hữu cơ, trước hết bột dược liệu phải đượctẩm dung dịch kiềm để chuyển Alkaloid muối trong dược liệu thành dạng bazơ.Kiềm thường dùng là vôi, NaOH, NH4OH
Trang 16Dung môi có thể là clorofoc, ete, benzen, Etyl clorua Clorofoc là dung môithích hợp nhất cho hầu hết các loại Alkaloid bazơ (trừ Alkaloid có N – Bậc 4 và N –Oxit có cách xử lý riêng).
- Dịch chiết clorofoc, cất thu hồi dung môi còn khoảng độ 1/2 hoặc 1/3 Sau đó lắcvới dung dịch axit hữu cơ hoặc vô cơ 1 – 2 % Các axit có thể dùng là : tactic,axetic, sunfuric, HCl Như đã nói ở trên, cần xem xét pKa của các Alkaloid địnhchiết để cho đủ lượng axit cần thiết để chuyển Alkaloid bazơ trong dung dịch chiếtCHCl3 thành muối hòa tan trong nước Nếu không đủ axit Alkaloid sẽ nằm lại tronglớp CHCl-3
Lượng dung dịch axit mỗi lần chiết không cần nhiều nhưng cần chiết nhiềulượt Với 100 ml dung dịch CHCl-3 thì lần đầu dùng 20 – 30 ml dung dịch axit vàcác lần sau (5 – 7 lần) chỉ cần dùng 15 ml Theo dõi bằng thuốc thử Alkaloid trongquá trình tách chiết
Chú ý kỹ thuật chiết rất quan trọng Phải chiết kiệt nhưng đồng thời không đểdung dịch bị nhũ hóa Thường mỗi lần chiết, lắc bình chiết qua lại 100 lần là đủ.Nếu bị nhũ hóa không nhiều ta có thể xử lý bằng cách ly tâm hoặc lọc qua lớp giấylọc thô Nếu nhũ hóa nhiều phải để một thời gian trong tủ lạnh
- Để loại tạp như Clorophyl, chất màu, nhựa thì lắc dung dịch axit Alkaloid vớidung môi hữu cơ như ete, ete dầu, CHCl-3 một vài lần
Trang 17- Cho dung dịch axit Alkaloid vào bình gạn rót vào đó một lượng CHCl-3 (hoặc ete)sau đó cho từ từ dung dịch NH4OH 10 % (hoặc loại kiềm khác) đến pH đã chọn tùytheo yêu cầu định chiết.
- Nếu trong dung dịch axit có nhiều nhóm Alkaloid cần sơ bộ tách phân đoạn thìtrước tiên cho dung dịch pH: 2 – 3 để chiết lấy riêng các Alkaloid bazơ yếu Sau khichiết lấy Alkaloid bazơ yếu xong, nâng pH dung dịch lên 6 – 7 để chiết lấy cácAlkaloid bazơ trung bình Sau cùng nâng dung dịch lên pH: 10 – 12 để chiết lấy cácAlkaloid bazơ mạnh
- Nếu chỉ chiết lấy Alkaloid toàn phần thì kiềm hóa dung dịch axit đến pH : 10 – 12
và chiết với CHCl-3 như trên
- Dịch chiết CHCl-3 tách riêng, làm khan bằng Na2SO4 khan (thường dùng 1 – 2 gcho 60 ml CHCl-3 hoặc 50 ml ete và lắc trong 15 phút )
Nếu có điều kiện để dung dịch CHCl-3 này vào bình hút ẩm qua đêm, sau đólọc và cất thu hồi dung môi, được Alkaloid
Bột dược liệu được tẩm kiềm chiết nóng CHCl 3
Trang 18Dung dịch axit lần lượt chiết CHCl 3 ở pH khác
nhau Dịch chiết CHCl 3 cất dung
môi
pH2= Alkaloid bazơ
yếu
pH7= Alkaloid bazơ trung bình
pH12 = Alkaloid bazơ mạnh Alkaloid toàn phần
Hình 1: Sơ đồ chiết bằng dung môi hữu cơ
2.5.2 Chiết bằng dung dịch nước axit hoặc bazơ.
Khác với phương pháp trên, phương pháp này dùng dung dịch axit vô cơ hoặchữu cơ để chiết Alkaloid dưới dạng muối hòa tan Axit thường dùng là: tactic,axetic, sunfuric, HCl, tùy theo loại Alkaloid Cách chọn axit là dựa vào độ hòa tancủa muối Alkaloid trong nước
Ví dụ : - Stricnin bazơ có độ hòa tan trong nước ở 250c là 0.016%
- Stricnin sunfat có độ hòa tan trong nước ở 250c là 3.2 %
- Stricnin nitrat có độ hòa tan trong nước ở 250c là 2.3 %
Như vậy để chiết Stricnin trong hạt mã tiền nên dùng axit sunfuric Nồng độaxit thường là 0.5 – 1 %
Dung dịch nước axit là dung môi rẻ tiền và thích hợp cho sản xuất Alkaloidhiện nay Nhưng có một nhược điểm cơ bản là nước khó bốc hơi vì vậy khi cần côđặc dung dịch để kết tủa dung dịch Alkaloid dạng bazơ được triệt để thì vệc thựchiện sẽ khó khăn nhất là trong điều kiện chưa có đủ trang thiết bị hệ thống cô bằng
áp suất giảm
với CHCl 3
Trang 19Vì vậy điều kiện cho phép thì thay nước axit bằng cồn axit Cồn có thể dùng làcồn metylic, etylic, hoặc propylic Cồn axit có khả năng hòa tan Alkaloid mạnh hơnnước axit đồng thời ít hòa tan tạp chất ( protein thực vật, hydratcarbon…) hơn nước.
Ưu điểm cơ bản của cồn là dễ bốc hơi nên dễ dàng cô đặc để kết tủa triệt đểAlkaloid vì vậy hiệu suất thu được bằng chiết cồn axit bao giờ cũng cao hơn chiếtbằng nước axit
Phương pháp chiết tốt nhất đối với dung môi nước hoặc cồn axit là chiết ngâmkiệt và áp dụng kỹ thuật chiết ngược dòng, lấy một phần dịch chiết đầu để riêng,phần dịch chiết sau làm dung môi để chiết mẻ mới
Dịch chiết thu được tiến hành các giai đoạn tiếp theo như sau:
- Nếu là dịch chiết nước : Để yên 1 – 3 ngày (có điều kiện nên để lạnh) để lắng tạp.Sau đó gạn lọc, nếu hàm lượng Alkaloid trong dung dịch quá thấp, cần cô đặc thìchuyển pH dung dịch bằng 7 – 8 trước khi cô đặc, vì môi trường axit Alkaloid dễ bịhỏng bởi nhiệt độ hơn là môi trường trung tính hoặc kiềm
- Nếu là dịch chiết cồn axit : trung hòa axit (pH =7) rồi cất thu hồi cồn Sau đó hòacặn vào dung dịch axit 1% Để yên 1 – 3 ngày như trên
- Cách loại tạp (nhựa, clorophyl, protein, hydrat cacbon) đơn giản nhưng đòi hỏithời gian, là để dung dịch axit ở lạnh 1 đêm sau đó đưa ra để ở nhiệt độ thường 1ngày, lại để lạnh một đêm… lập lại nhiều lần như vậy, sau đó lắng gạn lọc lấy dungdịch trong
- Dịch lọc xong tiếp tục tiến hành như mục e, f, g của phương pháp chiết bằng dungmôi hữu cơ
Trong sản xuât hiện nay do chưa có đủ dung môi hữu cơ để chiết Alkaloidbazơ thì phương pháp thích hợp nhất là kết tủa dung dịch chiết bằng cồn Lọc lấytủa Lại hòa tan Alkaloid bazơ vào dung dịch axit, lại kết tủa bằng kiềm Lập đi lậplại nhiều lần như vậy sẽ thu được Alkaloid thô Cuối cùng tinh chế và kết tinh trongcồn
Trang 20Một kỹ thuật nhỏ cần lưu ý là để kết tủa được tốt hơn và dễ lắng nên tủa ởnhiệt độ 60 – 700 Kết tủa xong không lọc ngay mà đển yên 1 – 2 ngày Alkaloid sẽtiếp tục kết tủa trong quá trình này Khi lọc lấy tủa, dùng dung dịch ammoniac hoặckiềm loãng để rửa tủa và cuối cùng rửa bằng nước.
Hiện nay trong quá trình sản xuất Alkaloid tại nhiều nước người ta dùng nhựatrao đổi ion để tách các Alkaloid ra khỏi dung dịch chiết
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.20
Dược liệu chiết cồn hoặc nước axit
Nếu chiết cồn, cất
thu hồi cồn
Cô còn 1/3 – 1/5 thể tích
Nếu chiết cồn, cất thu hồi cồn
Dung dịch axit qua
cột cationt Dung dịch cô(axit)để yên 1 – 3 ngày
Lọc
Dung dịch axit để lạnh loại tạp Hoàn tan tủa vào
Trang 21Hình 2: Sơ đồ tách chiết bằng dung dịch axit
CHƯƠNG II QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ BẢN
CHẤT LÀ ALKALOID TỪ THỰC VẬT
I Tách chiết, tinh sạch Salanin từ nhân hạt cây xoan Ấn Độ (Azadirachta indica A juss) trồng tại Việt Nam [2].
Cây xoan Ấn Độ còn gọi là cây neem (Azadirachta indica A juss) họ
Meliaceae được sử dụng là thuốc trừ sâu rất có hiệu quả ở nhiều nơi trên thế giới
Trang 22năng gây ngán ăn và xua đuổi côn trùng từ hạt và lá neem [7][8] [15] [30] [31][39]
Ở nước ta, cây neem đang được trồng nhiều tại các tỉnh Nam Trung Bộ như NinhThuận, Bình Thuận để phủ xanh vùng đất cát cằn cỗi và cải tạo đất bị hoang hóanhờ khả năng chịu hạn cao của cây
Hình 3: Cây xoan Ấn Độ
Dưới đây là quy trình phân lập và xác định cấu trúc Salanin từ nhân hạt câyneem
Loại vỏ, thịt quảSấy khô, nghiền
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.22
Hạt cây neem
Bột neem