Đề tài: Nuôi cấy tế bào đơn Nhóm NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN 1.1 Khái quát lịch sử tế bào đơn: Năm 1954, Muir cộng bắt đầu nghiên cứu phát triển tế bào đơn môi trường nhân tạo Tuy nhiên nghiên cứu họ chưa hoàn chỉnh mang tính thăm dò Năm 1960 Melcher Berman người tách, nuôi cấy thành công tế bào đơn thực vật bình lên men với môi trường nhân tạo Đầu năm 1970 đến nay, nhà khoa học công bố hàng loạt công trình nuôi cấy tế bào đơn loài thực vật khác để thu nhận sản phẩm thứ cấp 1.2 Tế bào đơn: 1.2.1 Khái niệm: Tế bào đơn tế bào riêng rẻ tách từ mô, tế bào nuôi môi trường dinh dưỡng lắc liên tục để tế bào liên kết lại với nhau, dung dịch lúc gọi dịch treo tế bào (cell suspension), cần thiết tế bào đưa vào môi trường thích hợp để tiếp tục nuôi cấy Hình 1.1 Tế bào đơn Tế bào đơn nhận đường nghiền mô, xử lí enzym Mỗi loại cây, loại tế bào khác đòi hỏi kĩ thuật nuôi cấy khác 1.2.2 Tại phải nuôi cấy tế bào đơn: Thực vật bậc cao nguồn cung cấp hợp chất hóa học dược liệu quan trọng Tuy nhiên năm gần đây, sản lượng thực vật không ổn định, mà nguyên nhân số yếu tố sau: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trang Đề tài: Nuôi cấy tế bào đơn Nhóm - Điều kiện tự nhiên không thuận lợi - Chi phí lao động ngày tăng - Khó khăn kĩ thuật kinh tế trồng trọt Phương pháp nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng) thực vật có khả góp phần giải khó khăn Những tế bào trải qua trình nuôi cấy tăng trưởng dịch huyền phù gọi dòng tế bào 1.2.3 Đặc điểm dòng tế bào - Khả tách tế bào cao - Phát sinh hình thái đồng - Nhân to tế bào chất đậm đặc - Nhiều hạt tinh bột - Có dẫn kiệu tạo quan - Có khả nhân đôi 24 ÷ 72 - Mất tính toàn - Tăng mức đa bội thể 1.3 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù 1.3.1 Dịch huyền phù Dịch huyền phù tạo nuôi cấy mảnh mô sẹo khả biệt hóa, môi trường lỏng chuyển động suốt thời gian nuôi cấy Quá trình tiến triển từ thực vật tới mẫu vật , tới callus , cuối tới dịch huyền phù tế bào Trong dịch nuôi cấy chứa tế bào khối tế bào , sinh trưởng phân tán môi trưởng lỏng Có thể nuôi cấy mảnh mô sẹo biệt hóa vào môi trường , thời gian nuôi cấy kéo dài tế bào nuôi cấy trạng thái tự Tuy nhiên dịch huyền phù có tế bào đơn mà chúng thường kết dính lại với tạo dạng xốp Mức độ tách rời tế bào phụ thuộc khả tạo nhiều tế bào xốp điều khiển môi trường Tăng tỉ lệ cytokinin/auxin sản xuất nhiều tế bào xốp Huyền phù tế bào cấy chuyển định kỳ Sau số lần cấy chuyển độ phân tán tăng lên Điều quan trọng môi trường nuôi cấy phải khuấy liên tục lắc, rung liên tục với tốc độ 100-150 vòng/phút Các mô sẹo nuôi cấy môi trường 2,4-D nguồn nguyên liệu thích hợp để tạo huyền phù tế bào để nhận 100 ml huyền phù tế bào thường cần 2÷3 gam callus tươi 1.3.2 Môi trường nuôi cấy Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trang Đề tài: Nuôi cấy tế bào đơn Nhóm Về chất tế bào huyền phù tế bào callus, môi trường nuôi cấy callus sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy dịch huyền phù việc điều chỉnh hàm lượng tỉ lệ auxin/cytokinin phù hợp để có tế bào phân tán tốt môi trường lỏng lắc Huyền phù cấy chuyển đầu pha ổn định thời điểm kết dính tế bào lớn 1.3.2.1 Môi trường nuôi cấy tạo callus (cây lúa) - MS đầy đủ - Saccaroza 3% - Agar 0,8% - 2,4-D mg/L - KIN 0,1 mg/L - pH môi trường ~ 5,8 1.3.2.2 Môi trường nuôi cấy dịch tế bào lỏng (cây lúa) Thành phần môi trường tương tự môi trường tạo callus không bổ sung agar 1.3.3 Những yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy: 1.3.3.1 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng lớn đến sinh lý tế bào trình nuôi cấy: - Phần lớn chất điều hòa sinh trưởng làm tăng trình phân bào - Tăng trình biệt hóa tế bào để tạo quan rễ, thân, lá… - Ảnh hưởng đến việc tạo sản phẩm thứ cấp 1.3.3.2 Nguồn dinh dưỡng - Nguồn đạm: từ muối nitrat thường tế bào dễ hấp thu Đôi người ta sử dụng nguồn đạm từ hỗn hợp nitrat ammonium Cũng có nhiều trường hợp người ta sử dụng nguồn đạm hữu Nhưng nguồn đạm từ muối vô hòa tan thường thích hợp cho nuôi cấy tế bào đơn - Nguồn cacbon: thường sử dụng saccharose nguồn carbon nuôi cấy tế bào đơn thực vật Điều tùy thuộc vào loại mà ta thu nhận tế bào Đối với nhiều loại thực vật tế bào lại cần mannose, galactose hay glucose - Ánh sáng: tế bào thực vật tế bào tự dưỡng nên trình phát triển chúng cần ánh sáng cho quang hợp Chu kỳ sáng-tối có ảnh hưởng lớn đến thành phần số lượng sản phẩm trao đổi chất bậc Do trình nuôi cấy việc điều khiển cường độ sáng, thời gian chiếu sáng đặc biệt quan trọng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trang Đề tài: Nuôi cấy tế bào đơn Nhóm - Các chất vi lượng chất khác: tùy theo loài thực vật mà nhu cầu nguyên tố vi lượng, vitamin chất khác khác Do nuôi cấy phải ý đến nhu cầu sinh lý chúng để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp 1.3.4 Kĩ thuật nuôi cấy dịch huyền phù 1.3.4.1 Quy trình nuôi cấy dịch huyền phù Chọn mẫu thực vật để tiến hành nuôi cấy, tiến hành trình xử lý vi nhân giống Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, người ta cấy mô sẹo vào môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tế bào đơn Môi trường có thành phần khoáng MS, phải bổ sung thêm nước dừa, auxin, dịch chiết nấm men, saccharose…tùy theo loài thực vật loại mô cấy Hình 1.2 : Callus (A) tái sinh chồi từ callus (B) chi Lilium Đầu tiên mô sẹo đuợc nuôi cấy bình tam giác đặt máy lắc Cứ 2-3 ngày lấy mẫu kiểm tra cách đếm kính hiển vi sau xây dựng đuờng cong tăng trưởng tế bào Sau 1-2 tuần nuôi cấy tùy theo loài thực vật bình nuôi cấy tạo huyền phù tế bào Trong huyền phù tế bào có loại tế bào: tế bào có khả sinh phôi tế bào khả sinh phôi Theo kinh nghiệm nuôi cấy nhà nghiên cứu, sinh khối thu cao ngày thứ Ta chuyển toàn sinh khối sang trình nuôi cấy Dung tích lần nuôi sau nhiều lần nuôi trước khoảng 10-15 lần.Cứ ta nhân giống đủ lượng giống cho sản xuất lớn Tỉ lệ tiếp giống sản xuất lớn khoảng 1-5% Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trang Đề tài: Nuôi cấy tế bào đơn Nhóm Hình 1.3 Quy trình nuôi cấy dịch huyền phù Trong nhiều trường hợp không cần tạo mô sẹo để nuôi cấy tế bào đơn mà trực tiếp sử dụng tế bào nguyên thủy mẫu cấy để nuôi cấy tế bào đơn Cách tiết kiệm thời gian, công sức chi phí nhiều 1.3.4.2 Sản xuất hợp chất thứ cấp bioreactor Tulecke Nickel người sử dụng bioractor nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp Trong phương pháp này, tế bào nuôi cấy không tái sinh thành hoàn chỉnh chúng tăng sinh khối kết chúng sản sinh liên tục hợp chất trao đổi thứ cấp với số lượng lớn Có lợi lớn nuôi cấy bioreactor: - Hệ thống nuôi thông khí trao đổi khí - Môi trường nuôi cấy dễ dàng thay thời kì Vì tế bào thực vật nhạy cảm với stress vi khuẩn nên hệ thống bioractor cho nuôi cấy tế bào thực vật phải thường xuyên cải thiện hệ thống thông khí hệ thống trộn môi trường Tế bào thực vật cần ánh sáng cho quang hợp nên cần có liên kết bioractor với hệ thống chiếu sáng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trang Đề tài: Nuôi cấy tế bào đơn 1.3.4.3 Nhóm Sơ đồ thiết bị nuôi cấy bioreactor Hình 1.3 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật bioreactor 1.3.4.4 Những phương pháp nuôi cấy: Nuôi cấy không liên tục: Nguyên liệu thực vật nuôi cấy hệ thống kín, môi trường nuôi cấy tế bào thực vật không chuyển đổi Phương pháp yêu cầu phải cấy chuyển tế bào thực vật sang môi trường tươi sau chu kì Nuôi cấy liên tục mở khép kín: Nuôi cấy liên tục kĩ thuật môi trường nuôi cấy cung cấp theo chu kì để tổng thể tích môi trường không đổi Có nghĩa tổng thể tích môi trường tươi bổ sung tương đương với tổng số môi trường cũ bị dùng hết Nuôi cấy bán liên tục: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trang Đề tài: Nuôi cấy tế bào đơn Nhóm Trong phương pháp nuôi cấy sau giai đoạn đặn tế bào phần môi trường lấy khỏi hệ thống nuôi cấy Sau lượng môi trường tươi bổ sung để tổng lượng môi trường giữ nguyên ban đầu Phần tế bào lại tiếp tục sinh trưởng lại tăng số lượng Lợi phương pháp phần sinh khối tái sử dụng cấy chuyển Ví dụ: Sản xuất β-methyldigito từ Digitalis lanata 1.3.4.2 Chu kì sinh trưởng tế bào huyền phù Chu kì sinh trưởng tế bào huyền phù có dạng hình cong chữ S với pha sinh trưởng sau: - Pha tiềm sinh (lag phage): pha không xảy tăng khối lượng số lượng tế bào - Pha số mũ (log phage): pha có phân chia tăng khối lượng tế bào diễn với tốc độ lớn Ngoài tăng trưởng tế bào tăng nhanh - Pha tuyến tính (linear phage): đặc trưng sinh trưởng tế bào diễn liên tục - Pha ổn định (stationary phage): pha hoạt tính phân bào giảm mạnh, số lượng khối lượng tế bào ổn định - Pha suy thoái (dead phage): sinh trưởng tế bào khỏi đỉnh cao, giảm xuống dẫn đến ngừng sinh trưởng không cấy chuyển Giai đoạn sinh trưởng pha số mũ (log phage) bị kéo dài mật độ tế bào khởi đầu nuôi cấy thấp Mật độ ban đầu huyền phù tế bào nuôi cấy thường 0,5÷2,5.105 tế bào/ml Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trang Đề tài: Nuôi cấy tế bào đơn Nhóm 1.3.4.4 Các tiêu sinh trưởng - Tổng số tế bào (mật độ tế bào) - Khối lượng tươi tế bào - Khối lượng khô tế bào - Chỉ số phân bào (%) =(Tổng số tế bào phân bào.100) / Tổng số tế bào kiểm tra - Khả sống tế bào: nhuộn flourescein diacetae (0,01%) quan sát thấy màu xanh chiếu tử ngoại 1.4 Ứng dụng nuôi cấy huyền phù tế bào 1.4.4 Các ứng dụng - Sản xuất hợp chất thứ cấp - Sử dụng công tác chọn giống trồng - Dùng để tách protoplast nguồn sản xuất phôi vô tính - Sử dụng để chọn lọc dòng tế bào mong muốn qua test lọc Sau tái sinh tế bào chọn lọc thành hoàn chỉnh để thu nhận vật liệu khởi đầu công tác chọn giống Sản phẩm nuôi cấy huyền phù tế bào thường đặc trưng chất có giá trị cao cần lượng nhỏ Các sản phẩm tế bào thực vật đơn giản đường tới hợp chất cao phân tử phức tạp chất thơm, chất nhuộm màu, dược liệu, chất trừ sâu 1.4.5 Ứng dụng nuôi cấy dịch huyền phù thu sản phẩm thứ cấp 1.4.5.1 Khái niệm hợp chất trao đổi thứ cấp thực vật Hợp chất trao đổi thứ cấp thực vật hợp chất có chức quan trọng đời sống thực vật sản xuất sinh tổng hợp hợp chất trao đổi sở hydrocarbon, lipit, axit amin… Nuôi cấy tế bào mô thực vật cho phép sản xuất sản phẩm trao đổi thứ cấp thực điều kiện invitro Quá trình dễ dàng chuẩn hóa (không phụ thuộc vào nhân tố phi sinh học khí hậu, quang chu kì, nhiệt độ, mùa vụ…) Các hợp chất trao đổi thứ cấp chia thành nhóm: - Hợp chất trao đổi thứ cấp y học - Hợp chất trao đổi thứ cấp thực vật nông nghiệp - Hợp chất trao đổi thứ cấp thực vật công nghiệp thực phẩm - Hợp chất trao đổi thứ cấp thực vật mỹ phẩm 1.4.5.2 Ưu –nhược điểm việc nuôi cấy dịch huyền phù thu sản phẩm thứ cấp Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trang Đề tài: Nuôi cấy tế bào đơn Nhóm Đa số hợp chất trao đổi thứ cấp sản xuất từ nguyên liệu thu hái tự nhiên hay số loài trồng Quá trình thể số bất lợi như: - Tàn phá môi trường hay xói mòn di truyền - Sự cung cấp nguồn nguyên liệu không vững chắc, không vững chất lượng không ổn định nguyên liệu thô - Các thực vật bị nhiễm bẩn thuốc trừ sâu bệnh, chất phóng xạ hay kim loại nặng chúng thu hái từ vùng bị nhiễm bẩn hợp chất Một số lợi sản xuất hợp chất trao đổi thứ cấp: - Có thể sản xuất hợp chất thứ cấp theo yêu cầu với số lượng thấp với số lượng lớn mà phương pháp công nghiệp thương mại sản xuất - Có thể sản xuất nhiều hợp chất khác hợp chất yêu cầu Khi điều kiện nuôi cấy biến đổi , tế bào, mô nuôi cấy biến đổi sinh tổng hợp nhiều hợp chất bao gồm khả cảm ứng hợp chất chất chưa biết - Có thể biến đổi hợp chất trao đổi thứ cấp dẫn xuất chúng trình sinh trưởng tế bào thực vật Điều dẫn đến chuyển đổi hoạt tính sinh học hợp chất Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trang ... với tốc độ 10 0 -15 0 vòng/phút Các mô sẹo nuôi cấy môi trường 2,4-D nguồn nguyên liệu thích hợp để tạo huyền phù tế bào để nhận 10 0 ml huyền phù tế bào thường cần 2÷3 gam callus tươi 1. 3.2 Môi trường... thời điểm kết dính tế bào lớn 1. 3.2 .1 Môi trường nuôi cấy tạo callus (cây lúa) - MS đầy đủ - Saccaroza 3% - Agar 0,8% - 2,4-D mg/L - KIN 0 ,1 mg/L - pH môi trường ~ 5,8 1. 3.2.2 Môi trường nuôi cấy... khoảng 10 -15 lần.Cứ ta nhân giống đủ lượng giống cho sản xuất lớn Tỉ lệ tiếp giống sản xuất lớn khoảng 1- 5% Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trang Đề tài: Nuôi cấy tế bào đơn Nhóm Hình 1. 3