đề taì nuôi cấy tế bào đơn

Đầu những năm 1970 đến nay, các nhà khoa học đã công bố hàng loạt các công trình về nuôi cấy tế bào đơn của các loài thực vật khác nhau để thu nhận các sản phẩm thứ cấp.. Khái niệm: Tế

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN

1.1 Khái quát lịch sử tế bào đơn:

Năm 1954, Muir và các cộng sự bắt đầu nghiên cứu về sự phát triển của tế bào đơn trong môi trường nhân tạo Tuy nhiên những nghiên cứu của họ chưa hoàn chỉnh và chỉ mang tính thăm dò

Năm 1960 Melcher và Berman là người đầu tiên tách, nuôi cấy thành công tế bào đơn thực vật trong bình lên men với môi trường nhân tạo

Đầu những năm 1970 đến nay, các nhà khoa học đã công bố hàng loạt các công trình về nuôi cấy tế bào đơn của các loài thực vật khác nhau để thu nhận các sản phẩm thứ cấp

1.2 Tế bào đơn:

1.2.1 Khái niệm:

Tế bào đơn là những tế bào riêng rẻ được tách ra từ các mô, các tế bào này có thể được nuôi trong môi trường dinh dưỡng và được lắc liên tục để các tế bào không thể liên kết lại với nhau, dung dịch lúc bấy giờ được gọi là dịch treo tế bào (cell suspension), khi cần thiết các tế bào này sẽ được đưa vào môi trường thích hợp để tiếp tục nuôi cấy

Hình 1.1 Tế bào đơn.

Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lí enzym Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kĩ thuật nuôi cấy khác nhau

1.2.2 Tại sao phải nuôi cấy tế bào đơn:

Thực vật bậc cao là một nguồn cung cấp các hợp chất hóa học và dược liệu rất quan trọng Tuy nhiên trong những năm gần đây, sản lượng những thực vật đó không ổn định, mà nguyên nhân là do một số yếu tố chính sau:

- Điều kiện tự nhiên không thuận lợi.

- Chi phí lao động ngày càng tăng

- Khó khăn kĩ thuật và kinh tế trong trồng trọt

Phương pháp nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng) của thực vật có khả năng góp phần giải quyết những khó khăn trên Những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy và tăng trưởng trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào

1.2.3 Đặc điểm dòng tế bào

- Khả năng tách tế bào cao

- Phát sinh hình thái đồng nhất

- Nhân to và tế bào chất đậm đặc

- Nhiều hạt tinh bột

- Có những dẫn kiệu tạo cơ quan

- Có khả năng nhân đôi trong 24 ÷ 72 giờ

- Mất tính toàn năng

- Tăng mức đa bội thể

1.3 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù

1.3.1 Dịch huyền phù là gì

Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi trường lỏng và được chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy

Quá trình này là sự tiến triển từ thực vật tới mẫu vật , tới callus , và cuối cùng tới dịch huyền phù tế bào Trong đó dịch nuôi cấy chứa các tế bào và các khối tế bào , sinh trưởng phân tán trong môi trưởng lỏng

Có thể nuôi cấy một mảnh mô sẹo biệt hóa vào trong môi trường , mặc dù thời gian nuôi cấy kéo dài nhưng những tế bào nuôi cấy sẽ ở trạng thái tự do Tuy nhiên không có dịch huyền phù nào chỉ có những tế bào đơn mà chúng thường kết dính lại với nhau tạo dạng xốp

Mức độ tách rời tế bào phụ thuộc khả năng tạo nhiều tế bào xốp và được điều khiển bởi môi trường Tăng tỉ lệ cytokinin/auxin sẽ sản xuất ra nhiều tế bào xốp Huyền phù tế bào được cấy chuyển định kỳ Sau một số lần cấy chuyển độ phân tán của nó tăng lên Điều quan trọng là môi trường nuôi cấy phải được khuấy liên tục hoặc lắc, rung liên tục với tốc độ 100-150 vòng/phút

Các mô sẹo nuôi cấy trên môi trường 2,4-D là nguồn nguyên liệu thích hợp để tạo huyền phù tế bào và để nhận 100 ml huyền phù tế bào thường cần 2÷3 gam callus tươi

1.3.2 Môi trường nuôi cấy

Về bản chất các tế bào huyền phù là các tế bào callus, do đó môi trường nuôi cấy callus có thể được sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy dịch huyền phù bằng việc điều chỉnh hàm lượng và tỉ lệ auxin/cytokinin phù hợp để có được các tế bào phân tán tốt trong môi trường lỏng lắc

Huyền phù được cấy chuyển ở đầu pha ổn định và thời điểm khi sự kết dính của tế bào là lớn nhất

1.3.2.1 Môi trường nuôi cấy tạo callus (cây lúa)

- MS đầy đủ

- Saccaroza 3%

- Agar 0,8%

- 2,4-D 5 mg/L

- KIN 0,1 mg/L

- pH môi trường ~ 5,8

1.3.2.2 Môi trường nuôi cấy dịch tế bào lỏng (cây lúa)

Thành phần môi trường tương tự môi trường tạo callus nhưng không bổ sung agar

1.3.3 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy:

1.3.3.1 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng rất lớn đến sinh lý tế bào trong quá trình nuôi cấy:

- Phần lớn các chất điều hòa sinh trưởng làm tăng quá trình phân bào

- Tăng quá trình biệt hóa tế bào để tạo những cơ quan như rễ, thân, lá…

- Ảnh hưởng đến việc tạo ra những sản phẩm thứ cấp

1.3.3.2 Nguồn dinh dưỡng

- Nguồn đạm: từ các muối nitrat thường được tế bào dễ hấp thu hơn cả Đôi khi người ta sử dụng nguồn đạm từ hỗn hợp nitrat và ammonium Cũng có nhiều trường hợp người ta sử dụng nguồn đạm hữu cơ Nhưng về căn bản các nguồn đạm từ muối vô cơ hòa tan thường thích hợp nhất cho nuôi cấy tế bào đơn

- Nguồn cacbon: thường sử dụng saccharose như nguồn carbon trong nuôi cấy

tế bào đơn thực vật Điều này cũng còn tùy thuộc vào từng loại cây mà ta thu nhận

tế bào Đối với nhiều loại thực vật tế bào lại cần mannose, galactose hay glucose hơn

- Ánh sáng: tế bào thực vật là tế bào tự dưỡng nên trong quá trình phát triển chúng cần ánh sáng cho sự quang hợp Chu kỳ sáng-tối có ảnh hưởng rất lớn đến thành phần và số lượng các sản phẩm trao đổi chất bậc 2 Do đó trong quá trình nuôi cấy việc điều khiển cường độ sáng, thời gian chiếu sáng đặc biệt quan trọng

- Các chất vi lượng và các chất khác: tùy theo loài thực vật mà nhu cầu về các nguyên tố vi lượng, vitamin và các chất khác sẽ khác nhau Do đó khi nuôi cấy phải chú ý đến nhu cầu sinh lý của chúng để tạo ra môi trường nuôi cấy thích hợp

1.3.4 Kĩ thuật nuôi cấy dịch huyền phù

1.3.4.1 Quy trình nuôi cấy dịch huyền phù

Chọn mẫu thực vật để tiến hành nuôi cấy, tiến hành quá trình xử lý như trong

vi nhân giống

Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, người ta cấy mô sẹo vào môi trường lỏng dùng

để nuôi cấy tế bào đơn Môi trường có thành phần khoáng MS, ngoài ra còn phải

bổ sung thêm nước dừa, auxin, dịch chiết nấm men, saccharose…tùy theo loài thực vật và loại mô cấy

Hình 1.2 : Callus (A) và tái sinh chồi từ callus (B) của chi Lilium

Đầu tiên mô sẹo đuợc nuôi cấy trong các bình tam giác và đặt trên máy lắc

Cứ 2-3 ngày lấy mẫu ra kiểm tra bằng cách đếm dưới kính hiển vi sau đó xây dựng đuờng cong tăng trưởng của tế bào

Sau 1-2 tuần nuôi cấy tùy theo loài thực vật trong bình nuôi cấy sẽ tạo huyền phù tế bào Trong huyền phù tế bào có 2 loại tế bào: tế bào có khả năng sinh phôi

và tế bào không có khả năng sinh phôi

Theo kinh nghiệm nuôi cấy của các nhà nghiên cứu, sinh khối thu được cao nhất ở ngày thứ 8 Ta chuyển toàn bộ sinh khối này sang quá trình nuôi cấy kế tiếp Dung tích mỗi lần nuôi sau nhiều hơn lần nuôi trước khoảng 10-15 lần.Cứ như vậy ta nhân giống cho đến khi đủ lượng giống cho sản xuất lớn Tỉ lệ tiếp giống trong sản xuất lớn khoảng 1-5%

Hình 1.3 Quy trình nuôi cấy dịch huyền phù

Trong nhiều trường hợp không cần tạo mô sẹo để nuôi cấy tế bào đơn mà trực tiếp sử dụng tế bào nguyên thủy của mẫu cấy để nuôi cấy tế bào đơn Cách này tiết kiệm được thời gian, công sức và chi phí rất nhiều

1.3.4.2 Sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng bioreactor

Tulecke và Nickel là những người đầu tiên sử dụng bioractor trong nuôi cấy

tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp

Trong phương pháp này, các tế bào nuôi cấy không tái sinh thành cây hoàn chỉnh nhưng chúng tăng sinh khối và kết quả chúng sản sinh liên tục hợp chất trao đổi thứ cấp với số lượng lớn

Có 2 lợi thế lớn của nuôi cấy bioreactor:

- Hệ thống nuôi được thông khí hoặc trao đổi khí

- Môi trường nuôi cấy có thể dễ dàng thay mới từng thời kì

Vì tế bào thực vật nhạy cảm với stress hơn là vi khuẩn nên hệ thống bioractor cho nuôi cấy tế bào thực vật phải thường xuyên được cải thiện hệ thống thông khí và hệ thống trộn môi trường

Tế bào thực vật cần ánh sáng cho quang hợp nên cần có sự liên kết giữa bioractor với hệ thống chiếu sáng

1.3.4.3 Sơ đồ thiết bị nuôi cấy bằng bioreactor

Hình 1.3 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật trong bioreactor

1.3.4.4 Những phương pháp nuôi cấy:

 Nuôi cấy không liên tục:

Nguyên liệu thực vật được nuôi cấy trong hệ thống kín, cả môi trường nuôi cấy và tế bào thực vật không được chuyển đổi

Phương pháp này yêu cầu phải cấy chuyển các tế bào thực vật sang môi trường tươi sau một chu kì

 Nuôi cấy liên tục mở và khép kín:

Nuôi cấy liên tục là kĩ thuật trong đó môi trường nuôi cấy được cung cấp mới theo chu kì để tổng thể tích môi trường không đổi Có nghĩa là tổng thể tích của môi trường tươi được bổ sung tương đương với tổng số môi trường cũ bị dùng hết

 Nuôi cấy bán liên tục:

Trong phương pháp nuôi cấy này sau một giai đoạn đều đặn cả tế bào và một phần môi trường được lấy ra khỏi hệ thống nuôi cấy Sau đó một lượng môi trường tươi được bổ sung để tổng lượng môi trường vẫn được giữ nguyên như ban đầu Phần tế bào còn lại tiếp tục sinh trưởng và lại tăng số lượng

Lợi thế của phương pháp này là một phần sinh khối được tái sử dụng khi cấy chuyển

Ví dụ: Sản xuất β-methyldigito từ Digitalis lanata

1.3.4.2 Chu kì sinh trưởng của tế bào huyền phù

Chu kì sinh trưởng của các tế bào huyền phù có dạng hình cong chữ S với các pha sinh trưởng sau:

- Pha tiềm sinh (lag phage): ở pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng và

số lượng tế bào

- Pha số mũ (log phage): ở pha này có sự phân chia và sự tăng khối lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất Ngoài ra sự tăng trưởng tế bào cũng tăng nhanh

- Pha tuyến tính (linear phage): được đặc trưng bởi sự sinh trưởng của tế bào diễn ra liên tục

- Pha ổn định (stationary phage): ở pha này hoạt tính phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế bào ổn định

- Pha suy thoái (dead phage): sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm xuống và dẫn đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển

Giai đoạn sinh trưởng pha số mũ (log phage) sẽ bị kéo dài nếu mật độ tế bào khi khởi đầu sự nuôi cấy là thấp Mật độ ban đầu của huyền phù tế bào khi nuôi cấy thường là 0,5÷2,5.105 tế bào/ml

1.3.4.4 Các chỉ tiêu sinh trưởng

- Tổng số tế bào (mật độ tế bào)

- Khối lượng tươi của tế bào

- Khối lượng khô của tế bào

- Chỉ số phân bào (%) =(Tổng số tế bào phân bào.100) / Tổng số tế bào kiểm tra

- Khả năng sống của tế bào: nhuộn bằng flourescein diacetae (0,01%) và quan sát thấy màu xanh dưới sự chiếu tử ngoại

1.4 Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào

1.4.4 Các ứng dụng chính

- Sản xuất các hợp chất thứ cấp

- Sử dụng trong công tác chọn giống cây trồng

- Dùng để tách protoplast hoặc là nguồn sản xuất các phôi vô tính

- Sử dụng để chọn lọc các dòng tế bào mong muốn qua các test thanh lọc Sau

đó tái sinh các tế bào đã chọn lọc thành cây hoàn chỉnh để có thể thu nhận được các vật liệu khởi đầu trong công tác chọn giống

Sản phẩm của nuôi cấy huyền phù tế bào thường đặc trưng là những chất có giá trị cao và cần ở lượng nhỏ Các sản phẩm của tế bào thực vật có thể đơn giản

là đường tới các hợp chất cao phân tử phức tạp hơn như các chất thơm, chất nhuộm màu, dược liệu, chất trừ sâu

1.4.5 Ứng dụng nuôi cấy dịch huyền phù thu sản phẩm thứ cấp

1.4.5.1 Khái niệm hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật

Hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật là những hợp chất có chức năng quan

trọng trong đời sống thực vật được sản xuất trong khi sinh tổng hợp những hợp chất trao đổi cơ sở như hydrocarbon, lipit, axit amin…

Nuôi cấy tế bào và mô thực vật cho phép sản xuất các sản phẩm trao đổi thứ cấp được thực hiện trong điều kiện invitro Quá trình này dễ dàng được chuẩn hóa (không phụ thuộc vào các nhân tố phi sinh học như khí hậu, quang chu kì, nhiệt

độ, mùa vụ…)

Các hợp chất trao đổi thứ cấp được chia thành 4 nhóm:

- Hợp chất trao đổi thứ cấp trong y học

- Hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật trong nông nghiệp

- Hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật trong công nghiệp thực phẩm

- Hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật trong mỹ phẩm

1.4.5.2 Ưu –nhược điểm của việc nuôi cấy dịch huyền phù thu sản phẩm

thứ cấp

Đa số các hợp chất trao đổi thứ cấp được sản xuất từ nguyên liệu thu hái trong tự nhiên hay một số loài cây trồng Quá trình này thể hiện một số bất lợi như:

- Tàn phá môi trường hay sự xói mòn di truyền

- Sự cung cấp nguồn nguyên liệu không vững chắc, không vững chắc và chất lượng không ổn định của nguyên liệu thô

- Các thực vật có thể bị nhiễm bẩn bởi thuốc trừ sâu bệnh, chất phóng xạ hay kim loại nặng khi chúng được thu hái từ những vùng bị nhiễm bẩn bởi các hợp chất này

Một số lợi thế của sản xuất hợp chất trao đổi thứ cấp:

- Có thể sản xuất các hợp chất thứ cấp theo yêu cầu với số lượng thấp hoặc với

số lượng rất lớn mà những phương pháp công nghiệp và thương mại không thể sản xuất được

- Có thể sản xuất được nhiều hợp chất khác ngoài những hợp chất yêu cầu chính Khi điều kiện nuôi cấy biến đổi , các tế bào, mô nuôi cấy có thể biến đổi thế năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất bao gồm khả năng cảm ứng những hợp chất mới hoặc những chất chưa biết

- Có thể biến đổi những hợp chất trao đổi thứ cấp và những dẫn xuất của chúng trong quá trình sinh trưởng của tế bào thực vật Điều đó dẫn đến sự chuyển đổi trong hoạt tính sinh học của các hợp chất