BÀI GIẢNG các PP sắc kí

Tài liệu này giúp bạn có được toàn bộ các lí thuyết liên quan đến các phương pháp sắc kí khí, sắc kí lỏng, sắc khí lỏng hiệu năng cao, GCMS. Được biên soạn công phu và kĩ lưỡng dùng để giảng dạy và tham khảo khi làm luận văn về Hóa lí, Hóa phân tích. Có thể dùng nó để làm cơ sở khoa học trong các luận văn của mình.

Chương1 ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÍ

I LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:

Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà thực vật hoc ngườiNga Michael C.Txvet Ông thực sự là người đầu tiên có công tìm ra phương pháp, giảiquyết vấn đề tách các chất có tính chất giống nhau theo một cơ chế độc đáo, hoàn toànkhác với phương pháp tách đã từng có trước đây, tuy nhiên phát hiện này đã bị lãngquên nhiều năm

Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra lýthuyết đĩa để giải thích các quá trình sắc ký, các tác giả đã ứng dụng để tách các ancaloit

từ các cây thuốc phục vụ cho chế tạo dược phẩm Do có công trong việc phát triển lýthuyết của phương pháp cho nên năm 1952 hai ông được nhận giải thưởng Nobel về hoáhọc

Cũng từ năm 1952 những máy sắc ký mới ra đời tỏ ra có ưu thế do có hiệu quảtách rất cao Cột mao quản và các detectơ sau này được cải tiến tăng độ phân giải và độnhạy của phương pháp người ta có thể phân tích được các chất có hàm lượng nhỏ cởppm và ppb Từ đây phương pháp được phát triển nhanh, ứng dụng được nhiều trongthực tế

Về sắc ký lỏng một kỹ thuật mới được phát hiện từ năm 1970 làm tăng hiệu quảtách đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance lipuid chromatography- HPLC):Chất nhồi cột được cải tiến, máy tính và thiết bị vào bổ trợ được đưa vào, tăng cườngkhả năng của phương pháp

Ngày nay kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác được áp dụng

Đó là kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và khối phổ ( GC-MS, GC-MS) sắc ký và cộnghưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, sắc ký điện mao quản (CEC) Phương pháp có độchính xác và độ nhạy rất cao, phân tích được nhiều đối tượng phức tạp hơn

II CƠ SỞ LÝ THUYẾT

1 ĐỊNH NGHĨA - PHÂN LOẠI

1.1 Định nghĩa:

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tíchtrên hai pha: một pha thường đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích gọi là phatĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi lạ pha động; do các cấu tử chất phân tích có áilực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

1.2 Phân loại các phương pháp tách sắc ký

1.2.1 Phân loại theo hệ pha

Phương pháp đầu tiên được nhiều người quan tâm, đây là phương pháp phân loạiđơn giản theo hệ pha tức là chất phân tích phân bố giữa hai pha là gì?

Sơ đồ phân loại các phương pháp sắc ký

hệ pha

Cơ chế

chất phân tích trên bề mặt của chúng ở các mức độ khác nhau khi cho pha động chứachất phân tích tiếp xúa với chúng Tuỳ thuộc lực liên kết giữa pha tĩnh và từng cấu tửchất phân tích có trong pha động, khi cho pha động đi qua pha tĩnh chúng sẽ di chuyểnvới tốc độ khác nhau.

1.2.2.2 Sắc ký phân bố lỏng - lỏng

Sự phân biệt giữa sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗsắc ký phân bố lỏng - lỏng còn được gọi là sắc ký chiết, pha tĩnh là chất lỏng pha độngcũng là chất lỏng, sự phân bố chất phân tích giữa hai pha lỏng giống như quá trình chiết,còn sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích vào hai pha không cần xét tớilỏng hay rắn

Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố lỏng - lỏng và sắc ký hấp phụ là ởchỗ: sắc ký phân bố lỏng- lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn,phương pháp có độ nhạy cao nhưng có nhược điểm là pha tĩnh không được bền vững,hiện tương trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm

1.2.2.3 Sắc ký ion ( trao đổi ion)Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân tíchtrong pha động.Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, còn chất có khả năngtrao đổi anion gọi lá anionit Lực liên kết chủ yếu giữa chất phân tích và pha tĩnh chủyếu là liên kết tĩnh điện , phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân tích, pH củadung dịch và bán kýnh hidrat hoá của các ion chất phân tích Ví dụ: phản ứng trao đổiion giữa cationit acid mạnh và Ca2+ có thể viết như sau:

2R-SO3H + Ca2+ = (R-SO3)Ca + 2H+Phản ứng của anionit bazơ mạnh với Cl- :

R-N(CH3)3OH + Cl- = R-N(CH3)3Cl + OH

-1.2.2.4 Sắc ký rây phân tử (sắc ký loại cở)Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi tronglòng chất rắn, còn gọi là mao quản có kých thước cở phân tử Các phân tử chất phân tích

có thể thấm vào chất đó ở mức độ khác nhau tuỳ theo kých thước của chúng Các chấtphân tích có kých thước lớn không thể đi vào sâu vào pha tĩnh được, sẽ bị rửa giảinhanh còn các phân tử chất phân tích có kých thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ bịrửa giải chậm Thứ tự rửa giải là các chất có kich thước nhỏ đi ra sau và ngược lại Thờigian lưu của các chất tỷ lệ nghịch với kých thước phân tử của chúng Tuy nhiên chất

phân tích có thể có tương tác khác với pha tĩnh Như vậy một phép sắc ký có thể táchtheo một hay nhiều cơ chế khác nhau mà chúng ta không xét ở đây.

1.2.3 Phân loại theo cách hình thành sắc đồ

1.2.3.1 Phân tích tiền lưuCác cấu tử A, B, C có ái lực với pha tĩnh là A < B< C Cho hỗn hợp chất phântích liên tục đi qua cột, chất

phân tích có ái lực với pha

tĩnh thấp nhất đi trước, tiếp

theo là chất có ái lực yếu

hơn Tuy nhiên do chúng ta

cho liên tục chất phân tích

vào nên đi sau A là A + B và

A+B+C Chỉ có một phần

chất tinh khiết A đi trước

1.2.3.2 Phântích thế đẩy

Trong sắc ký này, chúng ta cũng nạp lượng nhỏ hỗn hợp chất phân tích A, B, C

chất đẩy liên tục đi qua

Đưa một lượng nhỏ mẫu bao gồm các chất A, B, C vào cột sau đó dùng chất E có

ái lực hấp thụ với pha tĩnh yếu nhất để rửa giải liên tục Cả A, B, C, E đều tan tốt trongpha động Thứ tự ái lực hấp thụ là E < A < B < C Một câu hỏi đặt ra làm sao E có áilực hấp thụ yếu nhất với pha tĩnh lại có thể rửa giải A, B, C ? Để trả lời câu hỏi này

CB

A

B C

Hình 2: Sắc đồ phân tích thế đẩy (phần đậm là phần hai cấu tử xen kẽ)

D

t, VNồng độ

chúng ta hình dung là sự tranh chấp những trung tâm hoạt đông ở pha tĩnh không phảichỉ có một cấu tử chất phân tích tương tác với cấu tử chất rửa giải mà ở đây có thể cónhiều cấu tử rửa giải tham gia (câu tử có thể là ion hoặc phân tử).

Giả sử có chất tan C(phân tử hoặc ion) đã hấp thụ vào pha tĩnh, để phân bố C trởlại pha động phải cần tới nhiều cấu tử rửa giải E Quy luật ưu thế số đông xem ra có tácdụng Vì vậy khi rửa giải người ta thường chất rửa giải có nồng độ lớn hơn chất phântích rất

liên quan đến một hay nhiều cách phân loại khác, thí dụ ở sắc ký lỏng- rắn chỉ đơn giản

là pha tĩnh là chất rắn, pha động là chất lỏng theo cách phân loại theo liên kết pha nhưngtheo cách phân loại theo cơ chế thì lỏng rắn ở đây có thể là hấp phụ,trao đổi ion Tuỳtheo pha tĩnh sử dụng, sắc ký lớp mỏng có thể là sắc ký trao đổi ion, hấp phụ, phân bố,rây phân tử Ngược lại sắc ký hấp phụ xét về mặt tương tác pha có thể thuộc loại sắc ký

- rắn hay lỏng- rắn

Sắc ký rửa giải có ứng dụn Quá trình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phứctạp từ lúc nạp mẫu vào cột tách cho đến khi các chất phân tích trong mẫu lần lượt đi rakhỏi cột để hiểu các ơphanr ứng xảy ra trong đó, trước hết ta xem thí nghiệm của Txvet,tiến hành như sau:

Hòa tan các sắc tố thực vật trong êt dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột

đã nhồi bột CaCO3 Tiếp theo, cho liên tục êt dầu hỏa tinh khiết đi qua, sau một thờigian nhất định sắ tố thực vật đã tách thành các giải riêng biệt sau này người ta biết được

đó là các α-chlorophyl, β-chlorophyl, α-xantophyl, β-xantophyl…, chúng là các chấtmàu nên khi tách chúng tạo thành các dải màu khác nhau nên Ông gọi đó là

“Chromatography” Theo tiếng Hy Lạp, “Chroma” là ,màu còn “Graphy” là ghi, danh từ

đó còn giữ đến ngày nay

Chiều cao (h)Diện tích (S)

Thời gian (t)

Hình 3: Sắc đồ phân tích rửa giải

Khi các chất phân tích được nạp vào pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở phatĩnh một cách bất kỳ không chọn lọc, chúng có thể phân bố ở những điểm xen kẽ, tuynhiên pha tĩnh có ái lực liên kết với tùng cấu tử khác nhau là không giống nhau Cácchất phân tích có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ phân bố tốt hơn, các chất có áilực với pha tĩnh yếu hơn sẽ phân bố vào pha tĩnh ít hơn.

Khi cho dung môi tinh khiết dội qua cột, các chất phân tích lại có điều kiện phân

bố lại, các chất được phân bố tốt hơn có thời gian ở pha tĩnh lớn hơn Khi chất phân tích

ở pha tĩnh chúng không di chuyển còn khi ở pha động chúng di chuyển Vì vậy các chấtphân bố tốt hơn, chúng di chuyển chậm hơn, các chất phân bố kém hơn có thời gian ởpha tĩnh ít hơn, kết quả là trong quá trình tách sắc ký chúng sẽ di chuyển nhanh hơn.Nghĩa là sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích có tính chất giống nhau nên

có một sự chênh lệch rất nhỏ về thời gian nằm ở pha tĩnh Sau mỗi lần hấp thụ và giảihấp các chất phân tích di chuyển được những quãng đường rất nhỏ khác nhau

Tiếp tục chop ha động đi qua cột, chất phân tích tiếp tục di chuyển, sự kkhacsbiệt về quãng đường di chuyển sẽ càng lớn tất nhiên khi thời gian di chuyển càng lớn,vunhf chất của từng cấu tử càng rộng do yếu tố khuếch tán dọc theo cột, sau một thờigian nhất định, các chất phân tích đã tách khỏi nhau, đó là quá trình tách sắc ký

g nhiều trong lĩnh vực phân tích do hiệu quả tách cao

2 QUÁ TRÌNH TÁCH SẮC KÝ VÀ CÁC LOẠI LỰC LIÊN KẾT TRONG

HỆ SẮC KÝ

2.1 Quá trình tách sắc ký

Quá trình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phức tạp từ lúc nạp mẫu vào cột táchcho đến khi các chất phân tích trong mẫu lần lượt đi ra khỏi cột để hiểu các ơphanr ứng xảy ratrong đó, trước hết ta xem thí nghiệm của Txvet, tiến hành như sau:

Hòa tan các sắc tố thực vật trong ete dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột đã nhồibột CaCO3 Tiếp theo, cho liên tục ete dầu hỏa tinh khiết đi qua, sau một thời gian nhất định sắc

tố thực vật đã tách thành các giải riêng biệt sau này người ta biết được đó là các α-chlorophyl,β-chlorophyl, α-xantophyl, β-xantophyl…, chúng là các chất màu nên khi tách chúng tạo thànhcác dải màu khác nhau nên Ông gọi đó là “Chromatography” Theo tiếng Hy Lạp, “Chroma”

là ,màu còn “Graphy” là ghi, danh từ đó còn giữ đến ngày nay

Khi các chất phân tích được nạp vào pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở pha tĩnh mộtcách bất kỳ không chọn lọc, chúng có thể phân bố ở những điểm xen kẽ, tuy nhiên pha tĩnh có

ái lực liên kết với tùng cấu tử khác nhau là không giống nhau Các chất phân tích có ái lực liên

kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ phân bố tốt hơn, các chất có ái lực với pha tĩnh yếu hơn sẽ phân bốvào pha tĩnh ít hơn.

Khi cho dung môi tinh khiết dội qua cột, các chất phân tích lại có điều kiện phân bố lại,các chất được phân bố tốt hơn có thời gian ở pha tĩnh lớn hơn Khi chất phân tích ở pha tĩnhchúng không di chuyển còn khi ở pha động chúng di chuyển Vì vậy các chất phân bố tốt hơn,chúng di chuyển chậm hơn, các chất phân bố kém hơn có thời gian ở pha tĩnh ít hơn, kết quả làtrong quá trình tách sắc ký chúng sẽ di chuyển nhanh hơn Nghĩa là sau mỗi lần hấp thụ và giảihấp các chất phân tích có tính chất giống nhau nên có một sự chênh lệch rất nhỏ về thời giannằm ở pha tĩnh Sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích di chuyển được nhữngquãng đường rất nhỏ khác nhau

Hình 4 :Quá trình tách A và B trong cột tách sắc ký

Tiếp tục cho pha động đi qua cột, chất phân tích tiếp tục di chuyển, sự khác biệt vềquãng đường di chuyển sẽ càng lớn tất nhiên khi thời gian di chuyển càng lớn, vùng chất củatừng cấu tử càng rộng do yếu tố khuếch tán dọc theo cột, sau một thời gian nhất định, các chấtphân tích đã tách khỏi nhau, đó là quá trình tách sắc ký

2.2 Các loại lực liên kết trong hệ sắc ký

Trong hệ sắc ký có ba thành phân chủ yếu tác quyết định sự tồn tại của hệ, chấtphân tích, pha tĩnh, pha động tạo nên sự phân bố cần thiết, giúp cho sự di chuyển cácchất phân tích dọc theo chiều dài cột với tốc độ khác nhau Chúng ta thường nói chấtphân tích phân bố giữa hai pha, tuy nhiên đây la cân bằng động chất phân tích luôn thayđổi pha liên kết (trừ một số trường hợp đặc biệt nó chỉ ở một pha trong suôt quá trình

phân tích) vấn đề là tại sao chất phân tích được giữ trong pha tĩnh? Hơn nữa ba thànhphần này tương tác như thế nào với nhau, bằngc lực liên kết nào mà kết quả các chấtphân tích lại phân bố vào pha tĩnh ở mức độ khác nhau? Câu trả là do bản chất các củacác thành phân trong hệ sắc ký Chất phân tích có thể là ion, phân tử trung hoá hay chấtphân cực, đối tượng liên kết của nó cũng có thể là ion, phân tử, chất phân cực Như vậytuy thuộc vào độ lớn của điện tích kich thước phân tử, độ phân cực mà chúng tương tácvớinhau theo các lực liên kết khác nhau Người ta chia các lực liên kết thành bốn loại:

2.2.1 lực liên kết ion

Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion Đó là các phần tử có khảnăng phân ly tạo thành các ion, tạo nên trung tâm hoạt động ion chung tham gia liên kếtvới các ion chất phân tích trong dung dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là liên kếtion Để giữ các anion chất phân tích trong dung dịch pha tĩnh cần có các trung tâmcation trên bề mặt, và ngược lại để giữ các cation chất phân tích trong dung dịch phatĩnh cần có các ctrung tâm anion cũng tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạtđộng là các ion, chúng tham gia tương tác với chất phân tích và pha tỉnh Chúng có khảnăng phân li trong dung dịch tạo thành các cation và anion

Thí dụ khi rửa giải các ion kim loại trên cột cationit, ta có thể dùng pha động làdung dịch HCl loãng Các phương pháp sắc ký thường gặp có sự tham gia của các liênkết ion gọi là sắc ký ion, sắc ký cặp ion

2.2.2 Lực phân cực

Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tửtrên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm phân cực, chúng có thể là các lưỡng cực điện cốđịnh, cũng có thể là các lưỡng cực điện do cảm ứng Các trung tâm phân cực của chấtnày liên kết với trung tâm phân cực của chất khác bằng lực liên kết phân cực Sự phâncực trong các phân tử đôi khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ.Tuy nhiên, sự chênh lệch này là yếu tố quan trọng để có độ bền liên kết khác nhau, đó làđiều cần thiết để phân chia chúng trong các phép tách sắc ký

Thí dụ: các Cresol (o-, m-,p- cresol) chỉ khác nhau về vị trí nhóm CH3- trongphân tử Chính sự khác nhau về vị trí này làm cho mật độ electron trong phân tử cresolkhác nhau tạo nên một sự khác biệt nhỏ về độ phân cực, từ đó lực liên kết với pha tĩnhkhác nhau Là nguyên nhân chênh lệch thời gian lưu trong quá trình sắc ký

2.2.3 Lực Van- de- Van (lực phân tán)

Lực này có bản chất điện, tuy nhiên không hề có cực điện trong mạng lưới phân

tử, cũng không liên quan tới phân tử lưỡng cực hay cố định

Tương tác phân tán điển hình là mạch hidrocacbon nó là tương tác phân tử Thí dụ n-heptan là chất lỏng chứ không phải là chất khí sự tương tác giữa cácphân tử n-heptan là lực phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng Để tách cáchidrocacbon người ta dùng hidrocacbon khác làm pha tĩnh

2.2.4 Lực tương tác đặc biệt

Lực tương tác đặc biệt là lực tương tác tạo thành do các liên kết hydro, liên kếtcho nhận mà có.Sự hình thành liên kết giữ nguyên tử hidro và các nguyên tử có độ âmđiện cao như O, N, F gọi là liên kết hidro Khi tham gia liên kết, các electron còn gọi

là đám mây electron chuyển dịch sang nguyên tử có độ âm điện lớn hơn Như vậy cácnguyên tử có độ âm điện cao hơn, liên kết hidro càng bền chặt

3 MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG DÙNG TRONG SẮC KÝ

A

(2)Trong đó : [Am ] là nồng độ chất phân tích trong pha động

[As ] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh

Cân bằng phân bố trong pha khí gọi là cân bằng động đó là cân bằng giữa lỏng lỏng, khí-lỏng, rắn-lỏng Giả sử chất phân tích được phân bố ở phần nào đó của cột, đĩathứ n Nhưng do pha động di chuyển, chất phân tích lại đi xuống đĩa thứ (n+1) và ở đâylại thiết lập cân bằng mới của cả đĩa thứ n và n+1

-Để cân bằng thiết lập nhanh một yêu cầu rất cần thiết là lớp pha tĩnh phải mỏng,

hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh lớn hơn hệ số khuếch tán trong phađộng Hệ số phân bố KD có thể được xác định theo phương pháp tính bằng cách đo nồng

độ chất phân tích trong pha động và nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh sau khi đã đạtcân bằng Một cách gần đúng KD được xác định theo công thức sau:

( 1)1

D

M M V K

M m

−

Trong đó: M là lượng chất ban đầu tính bằng mg

M1 là lượng chất phân tích còn lại sau khi tiếp xúc mg

V là thể tích pha động ml

m là lượng chât hấp thụ, gam

3.2 Sự liên hệ giữa tốc độ di chuyển của chất phân tích và KD Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động Gọi fA là phần thời gian

m

A V f

A

S D m

f

V K V

=+ (5)

Trong đó k’ A là hệ số dung tích.Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động là:

uA = u.fA = u / (1+k’ A) (7)

U là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s) Từ biểu thức (6) và (7) ta có nhận xét: Khi

KD hoặc fA càng lớn ; thời gian chất phân tích trong pha động càng ít, nói cách khác làchất phân tích di chuyển càng chậm, ngược lại khi fA càng nhỏ, chất phân tích di chuyểncàng nhanh

3.3 Thời gian lưu t R , thời gian lưu hiệu chỉnh t’ R

Thời gian lưu tR là thời gian lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic đạt giátrị cực đại

R V

V t

=

u

k L

u

L

A R

) 1

( +

=

=

) 1

(

A m

m

s D m

V

V K t

t

A =   +   = +

Thể tích lưu VR là thể tích của dung dịch rửa giải từ khi bắt đầu bơm mẫu vào cộtcho đến khi pic đạt cực đại Gọi F là tốc độ chảy của pha động ml/phút,thể tích lưu VRđược tính theo công thức:VRA = tRAF; Vm = tmF

VRA = Vm(1 + k’) (11)Thể tích lưu hiệu chỉnh VR’ là thể tích lưu đã loại đi thể tích trống của cột

V

V = = (12)

3.5 Hệ số tách α (còn gọi là hệ số lưu giữ tương đối)

Hệ số tách α là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc

ký Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và tỷ số của hệ số phân bố của hai chất:một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất chuẩn

Điều kiện để hai chất tách khỏi nhau là α ≠ 1

'

DB

A DA k

k K

RA RB

RA B

A DA

V

V t

t k

k K

3.6 Đĩa lý thuyết và xác định số đĩa lý thuyết bằng thực nghiệm

3.6.1 Khái niệm đĩa lý thuyết:

Đĩa lý thuyết là phần

nào đó của cột mà ở đó cân

bằng được thiết lập Theo

quan niệm của Martin và

Synge, cân bằng được thiết

lập nhanh chóng, tức thời

Tuy nhiên điều này gặp khó

khăn khi giải thích hiện tượng Hình 5

: Xác định số đĩa lý thuyết từ thực nghiệm

giãn rộng vùng mẫu, hiện tương pic sắc ký không cân đối Amundson và Lapidus và sau

đó là Van Deemter cho rằng đĩa được cân bằng khi đạt cân bằng chuyển khối lượng chấttan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại và tác giả đã đưa ra thuyết tốc độ

Như vậy có thể nói rằng phần nhỏ của cột gọi là đĩa lý thuyết khi đạt được cânbằng phân bố chất phân tích

Gọi n là số đĩa lý thuyết, σ là độ lệch chuẩn; σ ~ n Đối với cột sắc ký n càng

lớn pic càng hẹp, thời gian lưu tỷ lệ với số đĩa lý thuyết n, tR ~ n, nên ta có thể vết:

Số đĩa lý thuyết có thể viết lại là:

sắc ký là chính xác nhất.Ngày nay hầu hết các máy hiện đại đều được trang bị các thiết

bị tÍnh diện tích của pic sắc ký một cách tự động

Độ phân giải R được tính theo công thức:

(18)

Trong đó: tRB – tRA= ΔtR là sự chênh lệch thời gian lưu(cũng có thể dùng thể tích lưuVRA- VRB)của hai cấu tử A và B Đại lượng này được so sánh với tổng bán chiều rộngpic, đo bằng giây hoặc mililít, nói lên khả năng tách của cột

Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng: tR ~ n, chiều rộng pic tỷ lệ với n

Vì vậy R~

n

n

hay R~ L 3.8.2 Cách làm tăng độ phân giải

Cách thứ nhất: Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột Trong phương pháp này có cácbiện pháp: Tăng chiều dài cột, sử dụng chất nhồi có kých thước hạt nhỏ hơn, đồng đềuhơn, thay đổi pha tĩnh và cuối cùng là giảm đường kinh cột

Cách thứ hai: Dưa trên cách vận hành cột: đó là tôi ưu hoá tôc độ pha động, giảmlượng mẫu, giảm nhiệt độ cột (GC) và cuối cùng là thay đổi thành phần pha động (LC)

RB

RB V

t

' ' , RB

RB V t RA

RA V

t ,

' ' RA

¶ ,V RA t

h S,

AW

V t,

W

t t R

3.9 Thuyết tốc độ, phương trình Van Deemter

Thuyết được các tác giả Lapidus và Amundsion đưa ra năm 1952, sau này đượcVan Deemter phát triển

Theo thuyết này các yếu tố: đường kýnh hạt nhồi, kỷ thuật nạp cột và các yếu tốtốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ảnhhưởng rất nhiều tới sự giản rộng vùng chất phân tích hay độ rộng của pic trong sắc đồ.Đại lượng đặc trưng cho độ giản rộng của vùng chất phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết

Trong đó λ là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt thì λ= 1,5; dp là đường kính hạt nhồi

H2 là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc Nó được hình thành do sự khuếch táncủa chất phân tích về hai đầu của cột, phụ thuộc vào tốc độ của pha động, hệ số khuếchtán của chất phất phân tích trong pha động, đường đi của chất phân tích, được biểu diểnbằng phương trình:

H2 = B/u trong đó B= 2γDm

Là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và hệ sốđường đi của nó Trong điều kiện nạp cột tốt, đường đi của chất phân tích không quákhúc khuỷu, γ = 1; Dm là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, như vậyH2 có thể viết lại là:

H2 = 2γDm/u (21)

H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng là yếu tố phụ thuộc vàotốc độ hấp thụ và giải hấp Quá trình này phụ thuộc vào cả pha động và pha tĩnh, vì vậyH3 có thể viết: H3= (CS - Cm)u (22)

Trong đó Cs là hệ số dặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng của chất phân tích trongpha tĩnh, phụ thuộc vào pha tĩnh, nó có giá trị nhỏ khi tốc độ dòng F≥1ml/phút, Cs ≈0Cs= K.df2/Ds (23)

Trong đó: K- hệ số

Ds- hệ số khuếch tán chất phân tích trong pha tĩnh

df2- chiều dày pha tĩnh

Dm là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động.

Tổng hợp lại H có biểu thức tổng quát là:

Trên sắc ký đồ người ta thu được 3 pic ở 0,84 phút và 10,60 phút và 11,08 phút tương ứng với các hợp chất A,B và C Hợp chất A không lưu giữ bởi pha tĩnh lỏng Các pic của các hợp chất B và C có dạng đường Gauss có chiều rộng tương ứng 0,56 và 0,59phút Chiều cao cột sắc ký bằng 28,3cm

H

min

H

u B

Cu

s cm

1 Tính số đĩa lý thuyết (n) của cột sắc ký và chiều cao đĩa lý thuyết (H) của pic B,C.

2 Tính giá trị trung bình T và σ của cột

3 Tính chỉ số lưu giữ của chất B,C

4 Thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột bằng 12,3ml Thể tích của pha động bằng 17,6ml Hãy tính hệ số phân bố B,C

Vậy số đĩa lý thuyết của cột tương đương 5688 đĩa lý thuyết

+ Chiều cao đĩa lý thuyết:

328,3

4,975.10 ( )5688

0,147( )28,3

t R t

11, 08

m C RC

t R t

2280

t t k

t

=  = =

227

t t k

t

=  = =

229

Pic sắc ký của hợp chất X được phát hiện sau 15 phút sau khi đưa mẫu vào

(lúc đó của hợp chất Y không được giữ bởi vật liệu của cột xuất hiện qua 1,32 phút) Piccủa chất X có dạng đường phân bố Gauss với bề rộng của đáy là 24,2s Độ dài của cột là40,2cm

1 Tính số đĩa lý thuyết trong cột.

2 Tính H của cột

3 Tính T và σ của cột

4 Tính chỉ số lưu giữ của chất X

5 Từ phương pháp chuẩn bị đã biết rằng thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt củachất mang của cột bằng 9,9ml Thể tích của pha động bằng 12,3ml Hãy tính hệ số phân

,24

60.1516W

16

2 2

2 Tính H:

22130

2,

cm n

L H H

n H

2,40

27,0.15.R

phut L

t R

m

V R

R V k V k V

V R

6 Tiêu chuẩn phân chia (Rs):

011,1

11(4

22130)

11(

với α là yếu tố phân chia.

Bài 4: Một hệ thống sắc ký lỏng hoạt động với các thông số sau đây:

- Chiều dài của phần cột được nhồi pha tĩnh: 25,2 cm

Cấu tử Thời gian lưu giữ,phút Chiều rộng chân pic,phút

2 Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử

3 Độ phân giải RS, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D

4 Chiều dài cột nếu muốn đạt được độ phân giải 1,5 đối với 2 cấu tử C,D

Giải

1 Sử dụng phương trình : 16( )2

w

R t

n= tính được số đĩa lý thuyết

V

= ta tính được hệ số phân bố của từng cấu tử :

R s

D

C

t R

W.16

2 R

Trong cột mao quản có chiều dài 50m; thời gian lưu trữ của metan bằng 71,5s;còn thời gian giữ của n-heptadecan là 12,6 phút Hãy cho biết:

a Tốc độ di chuyển của pha động bằng bao nhiêu?

b Tốc độ di chuyển của dải n-heptadecan bằng bao nhiêu?

b Đối với n-heptadecan: tR= 12,6 phút = 756 s

Vậy tốc độ di chuyển của dải là:

5000

6,61 /756

1500000,02

Bài 8 Một cột dài 360 cm dùng để tách propan và butan bằng phương pháp sắc ký khí

Dùng thước người ta đo được khoảng cách từ lúc bơm mẫu đến đỉnh của pic sắc ký lần lượt là 152,5 mm và 415,5 mm,bề rộng chân các pic lần lượt là 13,5 mm và 33,8 mm Tính số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ứng với mỗi chất

Giải

Sử dụng phương trình : 16( )2

w

R t

n= tính được số đĩa lý thuyết

Bài 9 Một hỗn hợp chứa metyl xiclohexan,metyl xiclohexen và toluen được tách bằng

phương pháp sắc ký lỏng – khí trên cột nhồi dài 42 cm Sắc ký đồ cung cấp thời gian lưu của chúng lần lượt là 10,1 ; 11,0 ; 13,5 và chiều rộng pic lần lượt là 0,75 ; 0,80 ; 1,05 phút Hãy tính:

1 Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic, giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều cao đĩa lý thuyết của cột

2 Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen

và toluen Cho biết khí được sử dụng là không khí với tR(KK) = 1,2 phút (không khíđược xem là cấu tử không bị lưu giữ bởi cột)

3 Hãy tính chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5

Giải

Ký hiệu A : metyl xiclohexan

B: metyl xiclohexenC: toluen

1 Sử dụng phương trình : 16( )2

w

R t

n= tính được số đĩa lý thuyết

A: n = 2902

B: n = 3025

C: n =2645

ntb = 2900

4200,0152900

t R

3.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5

Vì Rs,A-B = 2,70>1,5 nên chỉ cần tính chiều dài để độ phân giải giữa A-B đạt yêu cầu 1,5

Gọi n1,n2 là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có:

Ta có : L=36 m = 3600 cm

TN 1: 3600

20

30016

,

3000

8,4

s cm C

B

u toiuu = = =

)(914,0016,0.8,4236,0.2

3939914

,0

TÀI LIỆU THAM KHẢO.

1 Từ Vọng Nghi , Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung, Trần Tứ Hiếu – Hoá học phân tích –Tập 2 –NXB Khoa học kỹ thuật.

2.TS-Nguyễn Đình Lâm- Cơ sở lý thuyết và ứng dụng của sắc ký-Bài giảng 3.TS- Nguyễn Bá Hoài Anh-Đại cương về sắc ký –Bài giảng.

4.KS-Phan Hiền Lương- Phương pháp sắc ký lỏng HPLC.

5 Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng Phạm Hùng Việt– NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.

Chương 2 SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO1.1 KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên 2 pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Quá trình sắc ký khác cơ bản với quá trình tách khác ở 2 điểm:

- Sự phân bố chất phân tích lên 2 pha lặp đi lặp lại nhiều lần (hàng ngàn lần, thậm chí hàng triệu lần)

- Pha động đi qua pha tĩnh

1.2 VÀI NÉT VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid

Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Ban đầu, phương pháp được thực hiện ở áp suất thường vì chất nhồi cột có kích thước lớn Cơ chế tách là sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố nhưng do tốc độ phát triểnnhanh của phương pháp, các chất nhồi cột khác nhau ngày càng được cải tiến, hiệu quả tách củacột ngày càng được nâng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký lỏng – lỏng, sắc ký trao đổi ion lỏng – rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn

Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triểnnhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích và được sử dụng nhiều trong lĩnh vực kiểm nghiệm, đặc biệt là trong kiểm nghiệm thuốc và hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần (cho phép định tính và định lượng)

1.3 NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC

Nguyên tắc của phương pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái lỏng dựa trên

sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyển qua pha tĩnh để mang chất phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động Do các chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc

độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau

Hình: Minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký.

Như vậy có thể nói HPLC là một sắc ký cổ điển đi kèm với một detectơ nhạy để phát hiện chất phân tích sau khi tách ra khỏi cột trong quá trình chạy sắc ký

Với những tiến bộ kỹ thuật về cột tách và detectơ đã chuyển phương pháp phân tích này

có một tốc độ nhanh và chính xác nhờ hệ thống bơm cao áp khoảng 300 atm nhằm tạo dòng chảy với lưu lượng vài ml/phút Vì vậy người ta gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ưu điểm của phương pháp này là lượng mẫu phân tích rất ít chỉ cần khoảng 20µL/1 lần phân tích và mẫu chỉ cần hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích đượccác chất mà không sợ gây ra sự phân hủy do nhiệt độ trong quá trình phân tích

1.4 CÁC GIAI ĐOẠN CHẠY SẮC KÝ HPLC

* Giai đoạn tách:

- Thực hiện phép tách các chất ở trạng thái lỏng trong cột sắc ký dưới áp suất cao (200 ÷

500 atm) Vì vậy phải chuyển toàn bộ chất phân tích vào trong dung dịch (thường là hòa tan trong dung môi làm pha động) Phương pháp này thích hợp cho tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể khí ở điều kiện thường)

- Dùng thiết bị bơm mẫu để bơm chất phân tích vào đầu cột tách → chất phân tích được hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh

- Dùng bơm cao áp để bơm dung môi rửa giải qua cột (có thể là dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi) để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách ra khỏi nhau)

- Kỹ thuật chạy sắc ký:

+ Kỹ thuật cố định pha động (giữ thành phần và vận tốc pha động không đổi)

+ Kỹ thuật građient pha động (biến đổi pha động liên tục) Građient có thể là từng bậc hoặc liêntục tùy thuộc vào mẫu phân tích và thành phần pha động sao cho quá trình tách sắc ký xảy ra

hoàn toàn

* Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích:

- Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi là detectơ

- Việc ghi nhận và xử ký kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết quả chomột sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết như : thời gian lưu, diện tích và chiều cao pic, hệ số phân giải, hệ số đối xứng…

+ Với 1 chất sẽ có 1 thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ vào tính chất này

* Cột tách trong HPLC có 3 loại:

+ Cột thường

+ Cột mao quản

+ Cột kích thước nhỏ (cột micro)

* Chất liệu làm cột: là thép đặc biệt, nếu làm bằng thủy tinh thì phải bọc thép ở ngoài vì

phép sắc ký này được thực hiện ở áp suất rất cao

* Kích thước cột:

Loại cột tách Đường kính

(mm)

Chiều dài(cm)

Tốc độ chảy(mL/phút)

- Cột micro tiết kiệm dung môi pha động

- Kích thước của cột phụ thuộc vào chất nhồi: hạt nhồi nhỏ thì kích thước cột nhỏ, hạt

nhồi lớn thì kích thước cột lớn sao cho đủ số đĩa lý thuyết để thực hiện phép tách hoàn toàn

Hình: Cột sắc ký

* Kích thước hạt nhồi:

- Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể là chất rắn hoặc chất lỏng:

+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào cột tạo thành chất nhồi hay cột sắc ký (các hạt chất nhồi trong phatĩnh rắn có d = 3 ÷ 10 µm, phổ biến nhất hiện nay là 3 ÷ 7 µm)

+ Pha tĩnh lỏng thì được giữ trong cột sắc ký nhờ vào hạt chất mang trơ Màng mỏng thường dùng là các loại dầu như silicon có bề dày d = 1÷3 µm, loại pha tĩnh này có dung tích nhỏ hơn pha tĩnh rắn

Như vậy tùy thuộc vào pha tĩnh mà ta có phương pháp sắc ký lỏng - lỏng (pha tĩnh lỏng)hoặc lỏng - rắn (pha tĩnh rắn)

- Hạt chất nhồi có đường kính 30 µm thích hợp cho cột tách có đường kính trong 2 mm Khi sử dụng chất nhồi có đường kính nhỏ hơn 10 µm, đường kính trong cột tách khoảng 3 ÷ 4

mm sẽ cho hiệu suất tách và độ lặp lại tốt Như vậy kích thước hạt dùng trong HPLC nhỏ hơn

so với sắc ký khí

- Nhằm thu được các cột tách có hiệu quả các chất nhồi được đưa vào trong cột như là lớp đồng nhất và chặt nhằm thu được sự ổn định Ở đây một số yêu cầu đặt ra cho các chất nhồi

là phân bố kích thước hạt chất nhồi cần phải hẹp và các hạt cực nhỏ hoặc cực lớn phải không

có, vì các hạt có kích thước lớn gây nhiễu loạn đáng kể sự đồng nhất quá trình nhồi, trong khi

đó các hạt quá nhỏ lại làm giảm sự thấm ướt

Hình: Hạt nhồi trong HPLC.

* Cách nhồi cột:

- Trước khi nhồi, cột tách làm bằng thép không gỉ được làm sạch bằng HNO3 50%, rửa bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng axeton, clorofom rồi lại bằng axeton và cuối cùng làm khô bằng khí N2 hoặc không khí nóng

- Các phần gá lắp ở đầu và cuối cột tách với các bộ phận khác cũng rất quan trọng và làm thể tích chết ít nhất Ở các đầu cột tách phải sử dụng các màng lọc bằng thép không gỉ, thủytinh xốp ép, teflon xốp Bông thủy tinh thường được dùng để ngăn các hạt nhỏ Lỗ xốp của vật liệu làm ngăn phải nhỏ hơn kích thước các hạt nhồi ít nhất là 5 lần

- Trong thực tế có 2 cách nhồi: nhồi khô và nhồi ướt (huyền phù) Việc lựa chọn cách nhồi cột tách phụ thuộc vào kích thước của chất nhồi:

+ Các chất nhồi có đường kính lớn hơn 20µm thường được nhồi khô, từng phần nhỏ chất nhồi được thêm vào cột (khoảng 0,5 ml hoặc ít hơn), vừa rót vừa gõ hoặc rung Trong một số trường hợp có thể nối với bơm sắc ký và luyện cột ở tốc độ dòng cao và áp suất cao trong 10 phút Cột nhồi được coi là tốt (đường kính hạt chất nhồi 30÷40 µm) ở tốc độ rửa giải 3 cm/s và chiều cao đĩa lý thuyết của cột tách khoảng 1 mm

+ Với kích thước hạt chất nhồi khoảng 10µm hoặc 5µm người ta hay sử dụng phương pháp nhồi ướt Trong quá trình nhồi cột, huyền phù phải bền vững, không có sự sa lắng Huyền phù bền vững khi :

• Giữa các tiểu phân và chất lỏng huyền phù có tỷ trọng như nhau (phương pháp cân bằng tỉ trọng)

• Độ nhớt của môi trường huyền phù lớn đến mức tốc độ sa lắng của các tiểu phân là cực tiểu (phương pháp độ nhớt cao)

Các chất lỏng làm huyền phù thường được dùng là metanol, axeton, dẫn xuất halogen, đioxan hay hỗn hợp của chúng, các chất lỏng có độ nhớt cao như parafin, xiclohexano

* Ngoài ra, người ta còn sử dụng cột bảo vệ đặt trước cột phân tích để giảm thiểu sự hấpphụ bất thuận nghịch của chất tan đối với pha tĩnh và sự tắc nghẽn cột chính Cột bảo vệ nói chung giống cột phân tích nhưng được chế tạo từ những vật liệu rẻ hơn với ý nghĩa là cột chấp nhận hi sinh để bảo vệ tuổi thọ của cột phân tích.

1.6 CÁC LOẠI PHA TĨNH THƯỜNG DÙNG TRONG HPLC

1.6.1 Nguyên tắc chọn pha tĩnh trong HPLC

Chọn pha tĩnh trong HPLC sao cho:

- Cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại phải được thiết lập nhanh

- Pha tĩnh có dung lượng lớn để hấp phụ một lượng lớn chất phân tích

- Khoảng áp suất làm việc tương đối rộng

1.6.2 Các loại pha tĩnh trong HPLC

* Pha tĩnh hấp phụ pha thường :

- Loại pha tĩnh này được chế tạo từ: silicagen, polime (polistiren…)

- Silicagen có cấu tạo đặc biệt, xốp, bề mặt gồ ghề, có những mao quản cho nên diện tích bề mặt của silicagen lớn, trên bề mặt của nó còn có các nhóm silanol cũng có thể tham gia các liên kết với chất phân tích Silicagen có tính axit, pH = 3 ÷ 5 nên hấp phụ tốt các chất có tính bazơ hơn là các hợp chất có tính axit Vì những đặc tính trên mà Silicagel thường được sử dụng để tách, phân li các hợp chất thuộc họ rượu, phenol, andehit, axit hữu cơ, lipit, amin,….) Trên bề mặt của nó có chứa nhóm –OH là nhóm phân cực Các nhóm –OH có thể tương tác rất mạnh với các phân tử có chứa nhóm chức Độ lớn của sự tương tác phụ thuộc vào kiểu và số các nhóm chức trong các phân tử chất tan

Khi gặp những hỗn hợp phức tạp thì ta hoạt hóa nhóm –OH bằng một số nhóm phân cực: -C3H6CN, -(CH3)2-O-CH2-CH(OH)-CH2(OH), -C3H6NH2… Nhóm này là những nhóm ưa nước vì dễ tạo cầu liên kết hiđro với các phân tử nước nên làm giảm hoạt tính sắc ký pha tĩnh

- Sự lưu giữ của các chất tan trong các hệ xảy ra là do tương tác giữa các phân tử chất tan và các vị trí hoạt động trên bề mặt của chất rắn Vì các phân tử dung môi có thể tương tác với các vị trí này, sự hấp phụ có thể coi như là quá trình cạnh tranh giữa các phân tử chất tan vàcác phân tử dung môi trong sự tấn công các vị trí hấp phụ trên bề mặt của chất rắn Điều đó có nghĩa là các chất tan có mặt trong

pha lỏng đã thay thế một hoặc nhiều các phân tử dung môi từ bề mặt mà chính

nó bị hấp phụ

- Như vậy loại pha tĩnh này thích hợp với việc tách các chất tan với các kiểu nhóm chức khác nhau hoặc số các nhóm chức khác nhau và đối với việc tách các đồng phân, miễn là các chất tan không phân cực hoặc phân cực kém bởi chúng phải hoà tan trong pha động ít phân cực

* Pha tĩnh hấp phụ pha ngược :

- Pha tĩnh là những silicagen trung tính đã được ankyl hóa các nhóm -OH trên bề mặt bằng các gốc ankyl (C3, C5, C8, C18 , thông dụng nhất là C18)

Vì vậy mà chất nhồi này có bề mặt không phân cực, nó thuộc loại chất nhồi kỵ nước tức

là nước không làm ảnh hưởng đến bề mặt của nó

- Loại pha tĩnh này được sử dụng để tách các chất từ không phân cực đến phân cực Vì vậy phạm vi sử dụng đa dạng, phong phú hơn

* Pha tĩnh hấp phụ trao đổi ion:

- Pha tĩnh là ionit Ionit là những đại phân tử axit hoặc bazơ không tan trong nước và các loại dung môi, chứa bên trong mạng lưới những ion linh động có khả năng trao đổi theo đương lượng và thuận nghịch với các ion cùng dấu trong dung dịch chất điện ly khi tiếp xúc Ionit có thể ở dạng rắn hay dạng lỏng

+ Khi ion trao đổi mang điện tích dương (ion cố định của mạng lưới không gian mang điện tích âm) thì ionit gọi là cationit Ví dụ:

R-SO3H + M+ ↔ RSO3M + H++ Khi ion trao đổi mang điện tích âm (ion cố định của mạng lưới không gian mang điện tích dương) thì ionit gọi là anionit

+ Các ionit có khả năng trao đổi cả cation và anion cùng một lúc thì được gọi là ionit lưỡng tính Ví dụ:

R-N(CH3)3OH + X- ↔ R-N(CH3)3X + OH

Ionit thể hiện tính chất như một axit mạnh (cationit axit mạnh) hoặc bazơ mạnh (anionit bazơ mạnh) có khả năng trao đổi ở mọi giá trị pH và dung lượng

hấp thụ ít thay đổi theo pH

- Ionit thể hiện tính chất như một axit yếu (cationit axit yếu) có ái lực với H+ - là ion được dùng để trao đổi của ionit – lớn hơn so với các ion khác trong dung dịch phân tích nên cationit axit yếu không có khả năng trao đổi cation trong môi trường axit (tức chỉ làm việc ở một giá trị pH xác định) và dung lượng hấp thụ thay đổi nhiều theo pH

- Ionit thể hiện tính chất như một bazơ yếu (anionit bazơ yếu) có ái lực với OH- - là ion được dùng để trao đổi của ionit – lớn hơn so với các ion khác trong dung dịch phân tích nên anionit axit yếu không có khả năng trao đổi anion trong môi trường bazơ (tức chỉ làm việc ở một giá trị pH xác định) và dung lượng hấp thụ thay đổi nhiều theo pH.

- Cationit axit và anionit bazơ có khả năng trao đổi trung bình giữa hai loại mạnh và yếu Cationit axit trao đổi trong môi trường từ axit yếu đến bazơ, anionit bazơ trao đổi trong môi trường từ bazơ yếu đến axit

* Pha tĩnh rây phân tử:

Pha tĩnh được chế tạo từ các vật liệu bền vững, bề măt xốp, có chứa các mao quản kích thước cỡ phân tử - kích thước mao quản phải được lựa dựa vào kích thước của các phân tử chất phân tích – như: polime tổng hợp, oxit nhôm, silicagen

1.7 PHA ĐỘNG TRONG HPLC

1.7.1 Nguyên tắc chung để chọn pha động

- Phải trơ với pha tĩnh để không làm hỏng chất nhồi.

- Hòa tan được mẫu phân tích

- Bền vững, ổn định trong thời gian chạy sắc ký

- Có độ tinh khiết cao

- Phù hợp với detecto

1.7.2 Chọn pha động phù hợp với pha tĩnh

Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là một dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi được trộn theo những tỉ lệ xác định Tuy nhiên người ta hay dùng hỗn hợp hai hay ba dung môi để có một pha động có độ phân cực phù hợp với phép phân tích Tách các hỗn hợp mẫu phức tạp người ta phải dùng pha động có thành phần là hỗn hợp các dung môi

* Pha động khi sử dụng cột sắc ký hấp phụ pha thường:

- Vì pha tĩnh có chứa nhóm –OH dễ tạo cầu liên kết H với các phân tử phân cực nên phađộng cho loại pha tĩnh này là những dung môi không phân cực hoặc ít phân cực như C6H6,

C6H5CH3, n–hexan, CCl4 Nếu dùng dung môi phân cực sẽ làm hỏng pha tĩnh

* Pha động khi sử dụng cột sắc ký hấp phụ pha ngược

- Pha tĩnh không phân cực, vì vậy pha động là dung môi phân cực hoặc không phân cực,thông thường người ta lấy hỗn hợp nước với các dung môi hữu cơ tương đối phân cực làm pha động, thường dùng nhất là: CH3OH – H2O và axetonitril – H2O với tỉ lệ thích hợp

Bảng: Chỉ số phân cực của một số dung môi hữu cơ thông dụngStt Pha động Chỉ số phân cực (P’) Cực đại hấp thụ (nm)

P’(A), P’(B) lần lượt là chỉ số phân cực của A, B.

V(A), V(B) lần lượt là thể tích của A, B

P’(AB) là chỉ số phân cực của hỗn hợp gồm A, B theo đúng tỉ lệ trên

- Để thay đổi hệ số chọn lọc của một cặp chất tan ta thay đổi một hoặc nhiều dung môi làm pha động Các dung môi thường được sử dụng cho mục đích này là axetonitrin, metanol, tetrahydrofuran (THF) Để lựa chọn hệ dung môi tốt nhất ta dùng sơ đồ tam giác dung môi

Hình: Tam giác dung môi để thay đổi độ chọn lọc của một cặp chất tan

Sự tách được tối ưu hóa trước hết việc thay đổi tỉ lệ axetonitrin trong nước đến khi đạt được sự phân tách tốt nhất trong thời gian phân tích cần thiết (metanol, THF cũng có thể được chọn đầu tiên) Sau đó, các hệ dung môi này được điều chỉnh (nếu cần thiết) để thành lập điểm

ba của tam giác dung môi Sự kết hợp của 4 dung môi này sẽ tạo ra 7 hệ dung môi như trên sơ

đồ Từ đây cho phép dự đoán những thay đổi trong sự hình thành pha động để tác động đến sự tách trong quá trình sắc ký

Bảng: Sự tạo thành các pha động có hiệu năng phân tách tương đương

* Pha động khi sử dụng cột sắc ký hấp phụ trao đổi ion:

- Pha động là dung môi nước có chứa các chất đệm pH, chất tạo phức, chất làm chậm đểlàm ổn định nồng độ ion H+

- Để tách cation kim loại, dùng dung môi có độ pH thấp vì khi đó nồng độ cation H+ caonên cation H+ cạnh tranh mạnh và đẩy cation kim loại ra

- Để tách anion, dùng dung môi có độ pH cao vì khi đó nồng độ anion OH- cao nên anion OH- cạnh tranh mạnh và đẩy anion gốc axit ra

* Pha động khi sử dụng cột sắc ký rây phân tử:

- Dung môi làm pha động là dung môi không phân cực, không chứa cation và anion

1.8 CÁC KỸ THUẬT TÁCH

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp được dùng khá phổ biến trong phân tích hỗn hợp các chất hữu cơ, quá trình phân tích gồm 2 giai đoạn : giai đoạn tách hỗn hợp các chất và giai đoạn phát hiện

*Giai đoạn tách : hỗn hợp chất phân tích được bơm qua cột sắc ký, được lưu giữ trong cột và lần lượt rửa giải khỏi cột nhờ một pha di động chảy qua cột dưới 1 áp lực lớn

*Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích :

+ Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi

là detectơ

+ Việc ghi nhận và xử ký kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết quả cho một sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết như : thời gian lưu, diện tích và chiều cao pic, hệ số phân giải, hệ số đối xứng

+ Với 1 chất sẽ có 1 thời gian xác định đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn

cứ vào tích chất này để phân tích định tính

+ Độ lớn pic được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, được sử dụng để phân tích định lượng theo phương pháp lập đường chuẩn hay so sánh với chất đã biết chính xác hàm lượng

HPLC là quá trình tách hỗn hợp các chất ở cột tách sắc ký và ở trạng thái lỏng Vì vậy mà các chất phân tích muốn tách được theo phương pháp này thì trước hết phải hòa tan trong một chất lỏng nào đó mà thường là hòa tan trong dung môi làm pha động Phương pháp này thích hợp cho tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất

là thể khí ở điều kiện thường)

- Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể là chất rắn hoặc chất lỏng Pha tĩnhrắn được nhồi vào cột tạo thành chất nhồi hay cột sắc ký, còn pha tĩnh lỏng thì được giữ trong cột sắc ký nhờ vào hạt chất mang trơ Màng mỏng thường dùng là các loại dầu như silicon có

bề dày d = 1-3 µm , loại pha tĩnh này có dung tích nhỏ hơn pha tĩnh rắn Như vậy tùy thuộc vàopha tĩnh mà ta có phương pháp sắc ký lỏng - lỏng hoặc lỏng - rắn

- Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là một dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi được trộn theo những tỉ lệ xác định Việc thực hiện tách sắc ký có thể theo 2 kỹ thuật khác nhau :

+ Kỹ thuật giữ thành phần và vận tốc pha động không đổi

+ Kỹ thuật gradient pha động (biến đổi pha động liên tục) Gradient có thể là từng bậc hoặc liên tục là tùy thuộc vào mẫu phân tích và thành phần pha động sao cho quá trình tách sắc ký xảy ra hoàn toàn

-Si- OH+ Si(CH3)2RCl → -Si-O-(CH3)2R + HCl

R là các gốc khác nhau về số lượng cacbon và số nhóm chức Vì vậy, pha tĩnh có thể phân cực (có chứa nhóm như -NH2; -CN ); ít phân cực hoặc không phân cực (phân tử chỉ chứa hidro cacbon)

Chất nhồi pha liên kết thường có độ phân cực khác nhau, được chia thành hai loại

CH2-OH; -C3H6NH2 Các nhóm này là nhóm ưa nước vì dễ tạo cầu liên kết hidro với các phân

tử nước, vì vậy nó làm giảm hoạt tính sắc ký pha tĩnh Loại pha tĩnh này được sử dụng để tách các chất không phân cực hoặc ít phân cực

1.9.1.2 Sắc ký pha ngược

- Là những silica trung tính đã được ankyl hóa các nhóm -OH trên bề mặt bằng các gốc ankyl (C3, C5, C8, C18 , thông dụng nhất là C18)

-Si-OH + Si(CH3)2RCl → -Si-O-Si(CH3)2R + HCl

- Vì vậy mà các chất nhồi này có bề mặt không phân cực, nó thuộc chất nhồi kỵ nước nghĩa là nước không làm ảnh hưởng đến bề mặt của nó

- Loại pha tĩnh này dùng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng, từ không phân cựcđến phân cực

1.9.2 Pha động

* Nguyên tắc chung để chọn pha động

Pha động trong HPLC được chọn tùy thuộc vào mẫu phân tích, nó có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp 2,3 dung môi được trộn theo những tỉ lệ nhất định Khi chọn pha động ta phảichú ý đến những yêu cầu sau:

- Phải trơ (không tác dụng) với pha tĩnh để không làm hỏng chất nhồi

- Phải hòa tan được mẫu phân tích ( để mang được chất phân tích ra)

- Bền vững, ổn định trong thời gian chạy sắc ký

- Có độ tinh khiết cao

- phù hợp với detector

* Chọn pha động phù hợp với pha tĩnh

1.9.2.1 Pha động khi sử dụng cột sắc ký hấp thụ pha thường

- Vì pha tĩnh có chứa nhóm -OH phân cực dễ tạo cầu liên kết hidro với các phân tử phân cực, nên pha động cho loại pha tĩnh này là những dung môi không phân cực hay ít phân cực Nếu dùng dung môi phân cực sẽ làm hỏng pha tĩnh

- Nói chung đó là dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước như benzen; metylbenzen;n-hexan, tetraclormetan hệ dung môi hữu cơ này dùng để tách các hidrocacbon hoặc các hợp chất hữu cơ ít phân cực

1.9.2.2 Pha động khi sử dụng cột sắc ký hấp thụ pha ngược

-Vì pha tĩnh không hoặc ít phân cực nên pha động phải là dung môi phân cực hoặc hỗn hợp các dung môi hữu cơ phân cực với nước Thường dùng nhất là metanol- nước và

axetonitril- nước

-Hệ sắc ký này có thể dùng để tách nhiều hỗn hợp từ phân cực đến không phân cực Vì vậy phạm vi sử dụng đa dạng, phong phú hơn

Bảng chỉ số phân cực của một số dung môi hữu cơ thông dụng

Với P' (A); P'(B) là chỉ số phân cực của A, B; VA; VB là thể tích pha trộn của A và B;P'(AB) là chỉ số phân cực của hỗn hợp gồm A, B theo đúng tỉ lệ trên

- Sự tách được tối ưu hóa trước hết việc thay đổi tỉ lệ acetonitrl trong nước đến khi đạt được sự phân tách tốt nhất trong thời gian phân tách cần thiết (metanol, THF cũng có thể được chọn đầu tiên) Sau đó, các hệ dung môi này được điều chỉnh (nếu cầnthiết) để thành lập điểm ba cảu tam giác dung môi Sự kết hợp của 4 dung môi này sẽ tạo ra 7 hệ dung môi như trên sơ đồ Từ đây cho phép ta dự đoán những thay đổi trong

sự hình thành pha động để tác động đến quá trình tách sắc ký * Bảng tóm tắt

Loại Pha tĩnh Pha động Chất phân tích

Pha thường Bề mặt phân cực

(nhóm -OH, )

Không phân cực hoặc ít phân cực

Tách các chất không phân cực hoặc ít phân cực như hidrocacbon; ete; aldehid; ceton

cực (đã ankyl hóa)

Phân cực hoặc hỗn hợp dung môi hữu

cơ phân cực với nước

Tách các chất từ không phân cực đến phân cực

1.10 SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION, SẮC KÝ CẶP ION, SẮC KÝ LỎNG LỎNG

1.10.1 Sắc ký trao đổi ion

Về cơ bản sắc ký trao đổi ion và sắc ký trao đổi ion giống nhau, cơ chế tách tương tự nhau, cùng dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion Công thức cơ bản của sắc kí trao đổi ion là:

Hệ dẫn dung dịch rửa giải + cột tách trao đổi ion+ cột loại trừ + detetor độ dẫn

Phản ứng loại trừ là phản ứng loại bỏ yếu tố cản trở để thu được tín hiệu của ion cần tách

Ví dụ: Khi tách các halogenua, sử dụng NaX để rửa giải (X: OH-, Br-, F-…) Nếu cho NaX đi vào detetor thì tín hiệu rất lớn, lấn át cả tín hiệu của các halogenua cần tách, vì vậy cần loại trừ tín hiệu nền đi Sử dụng anionit dạng R-HCO3 các phản ứng như sau:

Ở cột tách: R-HCO3 + X- + Na+  RX + Na+ + HCO3

-Ở cột loại trừ: R-H + Na+ +HCO3-  RNa + H2CO3

Như vậy cả Na+ và X- không qua detetor, chỉ có các ion halogenua cần tách đi qua và tínhiệu đo được là của chúng

Hình 5: Sơ đồ hệ sắc kí trao đổi ion

1.Bình đựng dung dịch rửa giải ; 2: Bơm cao áp; 3: Van bơm mẫu;

4: Cột tách ; 5: Cột loại trừ; 6: Detector ; 7: Máy ghi

1.10.2 Sắc ký cặp ion

Sắc ký cặp ion (SKCI) được phát triển vào năm 1970 và ngày nay vẫn được áp dụng do

có những ưu điểm về khả năng thích ứng với mẫu phân tích Khái niệm cặp vì chất phân tích

và ion đối tạo thành cặp ion để tham gia vào quá trình tách sắc ký Ion đối được đưa vào pha động tạo cặp với chất phân tích, làm cho nó có những tính chất cần thiết phù hợp với pha tĩnh cũng như phương pháp tách

Có hai loại : SKCI pha thường và SKCI pha đảo

+ SKCI pha thường: là phương pháp sử dụng chất hấp thu ưa nước như silicagen,

Al2O3… thậm chí silicagen đã biến tính nhưng vẫn ưa nước làm pha tĩnh Đây là những chất hấp thu có diện tích bề mặt lớn, có các mao quản kích thước cở phân tử Người ta còn đưa thêmvào bề mặt của chúng các axit vô cơ Pha động là các dung môi không phân cực chứa các chất phân tích

+ SKCI pha đảo: sử dụng silicagen biến tính làm pha tĩnh, ví dụ ODS hay C18, pha động

là các dung môi phân cực như nước hoặc hỗn hợp các dung môi phân cực hay ít phân cực

Vai trò của ion đối rất quan trọng, chúng liên kết với ion cần tách trước khi phân bố vàopha tĩnh Chính nhờ ion đối, các chất phân tích cùng với ion đối thể hiện rõ bản chất của nó về khả năng liên kết, và điều đó dẫn đến tính chất của cặp ion bây giờ khác nhau so với ion đơn giản ban đầu Đây là điều cần thiết của phép tách sắc ký, vì có như vậy thì hệ số phân bố của chúng mới khác nhau và chúng tách khỏi nhau

Ví dụ: amin R-NH2 có thể tách theo cả hai phương pháp pha đảo và pha thường

Để tách pha thường, pha tĩnh là lớp nước trên silicagel chứa HClO4 còn các amin trong dung môi ít phân cực, phản ứng cặp ion xảy ra như sau:

H+ +ClO4− + −R NH2 ƒ R NH ClO− 3+ 4−

Chính cặp R-NH3+ClO4- tham gia liên kết với pha tĩnh khi cho pha động ít phân cực tiếp xúc vớí pha tĩnh Các amin có các gốc R khác nhau liên kết với pha tĩnh khác nhau là cơ sở để tách khỏi nhau Để tách pha đảo, pha tĩnh bây giờ là chất không phân cực, thí dụ ODS, pha động là dung môi phân cực có chứa HclO4 0,1M / nước/ ACN Các cặp ion amin liên kết với pha tĩnh không phân cực theo các cực liên kết khác nhau là cơ sở để tách sắc ký

1.10.3 Sắc ký lỏng- lỏng

Sự phân bố của chất tan trong hệ lỏng-lỏng được đặc trưng bằng nhiệt động học bởi

phương trình:

s i m i

aKa

=

Trong đó : K: hệ số phân bố nhiệt động học của chất i

ais: hoạt độ của chất tan i trong chất lỏng s

aim: hoạt độ của chất tan i trong chất lỏng m

Ở sự pha loãng vô cùng của chất tan, hệ số phân bố có thể được biểu thị bằng các đại lượng phân số mol và các hệ số hoạt độ của chất tan i trong pha lỏng ứng với:

Trong đó: Kxi : hệ số phân bố của chất tan i ở sự pha loảng vô cùng

x , xis im: các phân số mol của chất tan i trong pha s và m

f ,fis im : hệ số hoạt độ của chất tan i trong pha s và m

Sắc kí lỏng lỏng gồm hai kiểu pha thường và pha ngược, phụ thuộc vào pha tĩnh được

sử dụng là phân cực hay không phân cực Nếu pha tĩnh phân cực (LLC pha thường) thì bề mặt chất mang rắn cần phải phân cực và đối với pha tĩnh không phân cực (LLC pha ngược) thì bề mặt chất mang rắn phải không phân cực Pha tĩnh được trãi căng trên bề mặt chất mang rắn như

là lớp chất lỏng có bề dày đồng nhất điều này có tác dụng làm tăng sự vận chuyển khối của hai pha lỏng Nghĩa là chất mang rắn cần phải có những tính chất hấp phụ lớn để cho pha tĩnh có thể giữ chặt nó dưới dòng chảy, nói một cách khác chất mang rắn cần phải được làm ướt dễ dàng hơn bởi pha tĩnh so với pha động

*Kĩ thuật kết tủa: Dung dịch của pha tĩnh trong dung môi hữu cơ được bơm qua cột tách

đã được nhồi trước, cột này đã được cân bằng trước với cùng dung môi hữu cơ Khi cột đã đượcbơm đầy dung dịch pha tĩnh, dung môi khác ( trộn lẫn hoàn toàn với chất pha loãng nhưng không trộn lẫn với pha tĩnh) được bơm qua cột tách, pha tĩnh được kết tủa và lấp đầy các lô của chất mang Sau đó cột tách được cân bằng với pha động bão hoà pha tĩnh Đối với các hệ lỏng-lỏng trong đó pha tĩnh biểu thị ái lực lớn đáng kể đối với chất mang và hoà tan chừng mực nào

đó trong pha động thì kĩ thuật tẩm động lực có thể được ứng dụng có kết quả

* Kĩ thuật tẩm động lực: Pha động được bảo hoà với pha tĩnh được bơm liên tục qua cột tách đã được nhồi trước Vì ái lực lớn với chất mang, pha tĩnh được kéo ra khỏi pha động và hấp phụ ưu tiên lên chất mang

* Kĩ thuật bay hơi dung môi: Đầu tiên chất tan được tẩm với pha tĩnh và sau đó được nhồi khô vào trong cột tách Một lượng chính xác pha tĩnh được hoà tan vào trong chất lỏng dễ bay hơi và trộn cẩn thận với chất mang khô Sau đó dung môi được làm bay hơi đều từ hỗn hợptrong máy bay hơi quay chân không, pha tĩnh được nằm lại trong các lô của chất mang

* Diện tích bề mặt đặc trưng của chất mang: Để cho phương pháp sắc kí lỏng lỏng thuầntuý, chất mang rắn cần phải trơ đối với các chất tan có các tính chất hấp phụ kèm theo đối với pha tĩnh, người ta thấy rằng trong thực tế có thể gặp sự hấp phụ cạnh tranh giữa chất tan và pha