Sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao (HPCEC) là một kĩ thuật tách và phân tích đồng thời các chất trong hỗn hợp mẫu dựa trên nguyên lý của sự điện di các chất trong ống mao quản chứa dung dịch đệm điện di với giá trị pH nhất định và được điều khiển bởi điện trường E do nguồn thế cao một chiều V đặt vào hai đầu ống mao quản. Với nhiều ưu điểm như tốn rất ít mẫu, tốc độ phân tích nhanh, hiệu quả tách tốt các mẫu phức tạp, …nên từ năm 1995, HPCEC đã phát triển rất nhanh và ứng dụng có hiệu quả trong việc định tính cũng như định lượng nhiều loại chất vô cơ, hữu cơ khác nhau, đặc biệt là mẫu sinh học, dược học và y học. Sự phát triển của kỹ thuật phân tích HPCEC là sự vận dụng tổ hợp và phát triển các thành quả về trang thiết bị của sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc kí khí (GC) đã có. Chúng tôi soạn bài giảng “Phương pháp sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao” với mong muốn tìm hiểu kĩ về phương pháp HPCEC, qua đó thấy được nguyên tắc làm việc, những ưu điểm và các ứng dụng quan trọng trong thực tế của nó, từ đó giúp cho việc học tập, nghiên cứu được tốt hơn. Trong bài giảng này chúng tôi đề cập đến các vấn đề chính sau đây: Cơ sở lý thuyết của HPCEC; Một số đại lượng quan trọng trong HPCEC; Tối ưu hóa phép phân tích HPCEC; Định tính, định lượng trong HPCEC.
MỞ ĐẦU Sắc kí điện di mao quản hiệu cao (HPCEC) kĩ thuật tách phân tích đồng thời chất hỗn hợp mẫu dựa nguyên lý điện di chất ống mao quản chứa dung dịch đệm điện di với giá trị pH định điều khiển điện trường E nguồn cao chiều V đặt vào hai đầu ống mao quản Với nhiều ưu điểm tốn mẫu, tốc độ phân tích nhanh, hiệu tách tốt mẫu phức tạp, …nên từ năm 1995, HPCEC phát triển nhanh ứng dụng có hiệu việc định tính định lượng nhiều loại chất vô cơ, hữu khác nhau, đặc biệt mẫu sinh học, dược học y học Sự phát triển kỹ thuật phân tích HPCEC vận dụng tổ hợp phát triển thành trang thiết bị sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) sắc kí khí (GC) có Chúng tơi soạn giảng “Phương pháp sắc kí điện di mao quản hiệu cao” với mong muốn tìm hiểu kĩ phương pháp HPCEC, qua thấy nguyên tắc làm việc, ưu điểm ứng dụng quan trọng thực tế nó, từ giúp cho việc học tập, nghiên cứu tốt Trong giảng đề cập đến vấn đề sau đây: Cơ sở lý thuyết HPCEC; Một số đại lượng quan trọng HPCEC; Tối ưu hóa phép phân tích HPCEC; Định tính, định lượng HPCEC Mặc dù có gắng học hỏi, sưu tầm tài liệu trình độ hạn chế nên giảng khơng tránh khỏi thiếu sót Chúng tơi mong nhận góp ý q thầy cơ, bạn học viên để giảng hoàn chỉnh Nhân chân thành cảm ơn thầy giáo, Tiến sĩ Ngô Văn Tứ, giảng viên khoa Hóa học, trường ĐHSP – ĐH Huế tận tình dạy dỗ dẫn chúng tơi trình thực Bài giảng Huế, 6/12/2010 Nguyễn Thanh Bình Hồ Thị Hà Phạm Yên Khang NỘI DUNG Giới thiệu phương pháp HPCEC 1.1 Sự đời phát triển Năm 1937: Sắc kí điện di nghiên cứu lần Tiselius (Thụy Điển) ông tách cấu tử huyết (α, β, γ globumin) Sau ơng phát triển sở nghiên cứu tách phân tích hỗn hợp protein, amin, amino axit thấp (110 – 220V) gọi điện di cổ điển Nhờ kết nghiên cứu đề xuất kĩ thuật tách nên Tiselius nhận giải thưởng Nobel năm 1949 Năm 1953: Edstrom dùng sơi mao quản đường kính 15 μm để tách lượng nhỏ ADN Năm 1967: Hjerten nghiên cứu cách có hệ thống mơ tả chi tiết, hồn chỉnh sở lý thuyết sắc kí điện di mao quản ống hở sau nhà khoa học Later Virtamen, Mikkers nghiên cứu phát triển tiếp kĩ thuật ống mao quản thủy tinh teflon Tiếp nhà khoa học Jorgen son phân loại lý thuyết kiểu CE mô tả đặc điểm cách hoạt động loại Giữa thập kỷ 80: sắc kí điện di mao quản hiệu cao (HPCEC) nghiên cứu phát triển, kết hợp điện di cổ điển với tính chất cột sắc kí khí mao quản detector có độ nhạy cao kĩ thuật HPLC Song muốn thực điện di ống mao quản phải áp vào đầu mao quản cao (15 – 50 kV), có tên sắc kí điện di mao quản cao Cuối năm 1992: số hãng ISCO, HP, Berkman bắt đầu đưa thị trường số hệ thống máy CEC Năm 1994: thời kì phát triển HPCEC Năm 1995: nước tiên tiến áp dụng kĩ thuật phân tích nhiều lĩnh vực khoa học, kinh tế, nông công nghiệp y dược Từ năm 1995 đến nay, kĩ thuật HPCEC có bước phát triển nhảy vọt Hiện kĩ thuật phân tích HPCEC phát triển mức độ cao ứng dụng hiệu nhiều lĩnh vực khác khoa học công nghệ, y dược sinh học Hình Sự phát triển HPCEC (giai đoạn từ năm 1980 đến 1997) 1.2 Phân loại kiểu HPCEC Sắc kí điện di mao quản đa dạng, có nhiều kiểu (mode) từ đơn giản đến hoàn chỉnh phức tạp Tùy theo chế, chất đặc điểm tách xảy ống mao quản mà người ta phân thành kiểu khác sau: Bảng Phân loại kiểu điện di mao quản Kiểu điện di Bản chất tách đặc trưng - Sự điện di dung dịch tự theo vùng mẫu - Sự tách chất xuất di chuyển chất tan mao quản theo vùng chất riêng rẽ, chúng di chuyển theo tốc độ khác dòng EOF ống mao quản nhân tố định tác dụng lực điện trường E Sắc kí điện di mao - Sự tương tác ionic hay hydrophobic với Micell quản điện động Micell - Bản chất, trung tâm tách hình thành (Micellary Capillary Micelle mao quản, tiểu phân dẫn dắt Electro-Kenetic đóng góp thêm khả q trình tách chất Cromatoghraphy-MEKC) dung dịch đệm chất điện di ống mao quản Sắc kí điện di mao Tách theo kích thước điện tích chất tan Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis-CZE) quản gel (rây phân tử) ((Capillary Gel Electrophoresis-GelCEC) Sắc kí điện di mao quản hội tụ đẳng điện ((Capillary Isoelectric Focusing ChromatographyCIEFC) Sắc kí điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Isotachophores ChromatographyCITEC) - Dựa vào tính chất điểm đẳng điện pI vùng mẫu - Sự tách sắc kí dựa sở điện di kết hợp với khác giá trị pI chất tan hội tụ đẳng điện điều kiện định để hội tụ vùng mẫu gọn lại, làm giàu chất phân tích Dựa vào tính chất đẳng tốc độ thời 1.3 Đặc điểm sắc kí điện di mao quản hiệu cao Phương pháp HPCEC có đặc điểm sau đây: Có hiệu lực tách chất cao ống mao quản thủy tinh, ống teflon (đường kính 25-100 μm) Thế điện di cao, thường từ 10 – 50 kV ( 150-550 V/cm ) đặt hai đầu ống mao quản để tạo điện trường E Số đĩa hiệu lực cột tách lớn, thường từ 105 đến 106 đĩa /m nên cho kết tách tốt chất phức tạp Thời gian tách hỗn hợp nhanh, khoảng – 20 phút Việc phát hầu hết chất detector UV hay UV-VIs (trực tiếp gián tiếp) thực đoạn nhỏ đầu cuối ống mao quản nên không cần flowcell HPLC (Hình 2) Lượng mẫu nạp vào cột tách nhỏ, khoảng - 20nL (nhỏ lượng mẫu HPLC 1000 lần) nên phù hợp để tách mẫu có khối lượng nhỏ, mẫu máu bệnh nhân, vật liệu quý Có nhiều kiểu tách (bảng 1) nên khả ứng dụng thực tế rộng rãi, đa dạng phong phú Đặc biệt thích hợp cho nhiều đối tượng phức tạp mẫu sinh học Sự tách chủ yếu thực dung mơi nước có chất đệm pH chất điện ly nên không tốn nhiều dung môi đắt tiền HPLC Việc vận hành tách phân tích khơng phúc tạp, dễ dàng tương tự HPLC 10 Có thể sử dụng nhiều trang bị HPLC máy tự ghi, tích phân kế Do sở có HPLC dễ dàng phát triển ứng dụng HPCEC 11 Tự động hóa q trình tách phân tích hàng loạt mẫu 12 Do đường kính mao quản nhỏ nên giới hạn làm khó khăn dòng chảy, dễ xuất hiệu ứng nhiệt Jun khơng có lợi Do phải khống chế nhiệt độ mao quản để đảm bảo thu kết phân tích ổn định Hình Một đoạn ống mao quản HPCEC xem Fowcell Với đặc điểm trên, kĩ thuật phân tích HPCEC phát triển nhanh ứng dụng nhiều y học, hóa học, sinh học, dược, nơng nghiệp với tốc độ chưa thấy kĩ thuật phân tích Một số đại lượng HPCEC 2.1 Tốc độ điện di, độ điện di, thời gian điện di 2.1 Tốc độ điện di Sự tách chất điện di dựa sở tốc độ di chuyển khác chất ống mao quản dung dịch đệm chất điện li thích hợp tác dụng điện trường E thích hợp V đặt vào đầu ống mao quản sinh Tốc độ di chuyển chất i tính theo công thức: vi = μiE = μi V L (2.1) Trong đó: vi tốc độ điện di chất i ống mao quản; μi độ điện di chất i; V đặt vào đầu ống mao quản (V); E cường độ điện trường đầu cột mao quản V sinh ra; L chiều dài tổng ống mao quản (cm) 2.1.2 Độ điện di Theo công thức (2.1) ta có: μi = vi E (2.2) Trong điều kiện tốc độ dòng ổn định, lực điện trường F E lực cản Ff (lực ma sát) cân (cùng độ lớn ngược chiều), FE = Ff , đó: qE = 6πηR.vi (2.3) Trong đó: η độ nhớt dung dịch; R bán kính ion i Từ (2.1), (2.2), (2.3) ta có biểu thức độ điện di μi: i q 6 R (2.4) Theo (2.4) ta thấy: Độ lớn độ điện di μi tỉ lệ thuận với điện tích ion q tỉ lệ nghịch với độ nhớt dung dịch η, bán kính ion R, nghĩa điện trường E định thì: Phần tử có điện tích lớn kích thước nhỏ di chuyển nhanh Các ion điện tích ion có kích thước nhỏ di chuyển nhanh Các ion kích thước ion có điện tích lớn di chuyển nhanh Độ điện di μi chất xác định thực nghiệm điều kiện chuẩn gọi độ điện di chuẩn μi0 Nhưng thực tế, dung dịch ống mao quản điều kiện chuẩn hay chất nghiên cứu mà có chất khác Để phản ánh phù hợp điều kiện thực nghiệm ống mao quản người ta dùng độ điện di hiệu lực μef Giá trị μef ngồi phụ thuộc chất, kích thước, điện tích chất phân tích, điện V đặt vào đầu ống mao quản phụ thuộc: Giá trị pH nồng độ dung dịch đệm điện giải mao quản; Thành phần nồng độ chất điện giải pha động; Hằng số điện li K chất tan (axit, bazo, phức, …); Chất hoạt động bề mặt, chất phụ gia trung tính pha động; Dung môi hữu thêm vào pha động điện di hay mẫu phân tích, … 2.1.3 Thời gian điện di Khi điện di, thời gian cần thiết chất tan di chuyển từ lúc nạp vào đầu ống mao quản đến đến vị trí trung tâm flowcell detector, phát vị trí pic sắc kí cực đại, gọi thời gian điện di chất tan Tương tự HPLC, người ta gọi thời gian lưu hay thời gian rửa giải chất tan ti Thời gian điện di tính theo cơng thức: ti l L.l vi V i (2.5) Trong đó: l chiều dài hiệu lực (cm) (tính từ điểm mẫu nạp đến vị trí trung tâm flowcell detector); L chiều dài tổng ống mao quản (cm), L > l; V điện đặt vào đầu ống mao quản (V) Vì chất tan di chuyển dòng điện di thẩm thấu (EOF) nên thời gian điện di thông số thực nghiệm khác dùng để tính tốn độ điện di phải giá trị tổng số μtot phân tử chất tan Do độ điện di toàn phần mao quản chất tan i (E cường độ điện trường tạo điện V): tot ( i EOF ) vi l L.l E ti E V ti (2.6) Suy thời gian lưu chất tan i là: ti L.l V tot (2.7) 2.2 Hệ số phân bố hệ số dung tích 2.2.1 Hệ số phân bố Ki Trong trình điện di, ống mao quản có pha tĩnh (giả thật) ln có phân bố chất tan pha pha tĩnh pha động Sự phân bố trình cân động học điện di Đặc trưng cho trình phân bố số cân hay hệ số phân bố Ki Hệ số phân bố Ki cho biết điều kiện điện di cụ thể chất tan i phân bố pha ống mao quản: Ki Ci ( SP ) (2.8) Ci ( MP ) Trong đó: Ci(SP) Ci(MP) nồng độ chất tan i pha tĩnh (SP) pha động (MP) Hệ số phân bố Ki xác định bởi: Bản chất đặc trưng pha tĩnh; Bản chất, thành phần, chất có pha động giá trị pH nó; Lực điện trường E, tức V đặt vào đầu mao quản; Nhiệt độ mao quản Theo quan điểm nhiệt động học, hệ số phân bố K i xác định công H S RT R ln(Ki) = thức sau: (2.9) Trong đó: ∆H0, ∆S0 entapi chuẩn, entropy chuẩn chất tan; R số khí; T nhiệt tuyệt đối ống mao quản 2.2.2 Hệ số dung tích ki’ Hệ số dung tích ki' cho biết điều kiện điện di cụ thể chất tan i tồn pha tĩnh ống mao quản xác định cơng thức sau: ki' Hay Trong : (ti t0 ) [t0 (1 ti / t0 )] ki' K i VSP VMP (2.10) (2.11) ti thời gian lưu chất tan i mao quản; t0 thời gian không lưu giữ chất tan i mao quản; Ki hệ số phân bố; VSP,VMP thể tích pha tĩnh pha động; VSP gọi tỉ số pha hệ cột tách VMP Việc điều chỉnh tỉ số pha làm thay đổi hệ số dung tích k i’ Mặt khác tỉ số pha khơng đổi hệ số dung tích chất tan coi hàm hệ số phân bố K i chúng Chính mối quan hệ tạo điều kiện để tối ưu hóa điều kiện điện di, từ có ki’ thích hợp để thu kết sắc kí tốt Ngồi k i’ phụ thuộc pH pha động Lợi dụng điều người ta thay đổi điều kiện pha động chất đệm, pH đệm, thành phần nồng độ chất điện giải để có ki’ thích hợp Nếu cột tách hệ pha MEKC đại lượng ti / t0 thay ti / tMC với tMC thời gian không lưu giữ pha Micell Từ tính thời gian lưu tổng chất tan là: t0 tMC (1 ki' ) ti t MC t0 ki' (2.12) Nếu tMC