3. Cơ sở lý thuyết của sắc kớ điện di mao quản
3.6.2.Nguồn gốc dũng điện di thẩm thấu
Khi điện di với mao quản silica, cỏc nhúm silanol (Si-OH) trờn thành mao quản sẽ giải phúng ra ion H+ và bề mặt mao quản mang điện tớch õm. Do bề mặt mang điện tớch õm nờn cỏc cation do lực hỳt tĩnh điện sẽ tạo thành lớp điện kộp để cõn bằng điện tớch và tạo nờn hiệu thế sỏt thành mao quản (thế Zeta).
Hỡnh 8. Dũng điện di thẩm thấu EOF
Khi ỏp thế V vào 2 đầu mao quản, cỏc cation trong lớp điện kộp sẽ đi về catot. Nhưng vỡ cỏc cation này bị sonvat húa nờn kộo cả khối dung dịch trong mao quản đi về catot. Sự di chuyển của khối dung dịch trong mao quản silica dưới tỏc dụng của điện trường tạo nờn dũng điện thẩm thấu EOF.
Tốc độ v của dũng EOF tỉ lệ thuận điện trường E, với thế zeta VZet và tỉ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch đệm điện li theo cụng thức:
EOF EVZet v ε η = (3.3) Tốc độ tuyến tớnh u: EOF 4 Zet EV u ε πη = (3.4) Độ điện di của dũng EOF: àEOF εVZet
η
= (3.5) Dũng EOF được quyết định bởi thế V đặt vào 2 đầu mao quản, pH dung dịch đệm điện li, chất điện giải, lớp điện kộp, độ nhớt của dung dịch pha động, hằng số điện mụi, độ xốp, cỡ hạt. Nhờ đặc tớnh này người ta chọn được cỏc điều kiện tối ưu để cú tốc độ dũng EOF phự hợp cho quỏ trỡnh tỏch sắc kớ.
Hỡnh 9. Ảnh hưởng của pH lờn dũng EOF 3.6.3. Đặc điểm của dũng điện di thẩm thấu
Dũng EOF cú 2 đặc điểm chớnh:
Thứ nhất, dũng EOF là dũng chuyển khối phẳng trong mao quản. Cú đặc điểm
này vỡ lực tạo ra sự di chuyển của dũng EOF phõn bố đồng nhất dọc theo mao quản nờn khụng cú sụt ỏp trong mao quản. Trong HPLC thỡ dũng chảy cú dạng parabol do hiệu ứng thành: cỏc phần tử giữa dũng di chuyển nhanh, cỏc phần tử gần thành di chuyển chậm). Vỡ vậy pic sắc kớ trong HPCEC gọn và sắc nột hơn HPLC.
Thứ hai, dũng EOF đưa tất cả cỏc tiểu phõn cú mặt trong dung dịch điện di, bất kể
cú mang điện hay khụng di chuyển theo cựng một hướng nhất định từ anot (cực +) về catot (cực -) (nếu pH ≥ 4):
Cỏc cation di chuyển nhanh về catot với tốc độ khỏc nhau tựy điện tớch và kớch thước của nú;
Cỏc phõn tử trung hũa được dũng EOF mang theo cựng với tốc độ của dũng EOF (nhưng chỳng khụng tỏch ra được trong CEC);
Cỏc anion di chuyển về anot nếu tốc độ của nú lớn hơn tốc độ dũng EOF. Ngược lại chỳng bị dũng EOF mang theo về catot
Hỡnh 10 . So sỏnh dũng chảy trong HPLC và trong CEC
Hỡnh 11. Sự chuyển của cỏc phần tử trong CEC
Theo đú thứ tự rửa giải theo thời gian sẽ là: cation điện tớch lớn, kớch thước nhỏ ra đầu tiờn → cỏc phõn tử trung hũa → anion cú điện tớch lớn và kớch thước nhỏ ra sau cựng (Hỡnh 12).
Hỡnh 12 . Thứ tự rửa giải trờn điện di đồ 3.6.4. Kiểm tra và khống chế dũng điện di thẩm thấu
Theo trờn ta thấy dũng EOF là một yếu tố thuận lợi và cú vai trũ quan trọng trong kĩ thuật CEC nờn cần kiểm tra và khống chế nú ở mức độ phự hợp cho mục đớch phõn tớch. Cỏc cỏch kiểm tra, khống chế dũng EOF được tổng kết ở bảng 4.
Bảng 4. Cỏc cỏch kiểm tra, khống chế EOF
Điện trường E (tức điện thế V)
Sự thay đổi tỉ lệ với EOF + Độ phõn giải và số đĩa lý thuyết hiệu lực giảm.
+ Làm núng mao quản. Giỏ trị pH của dung
dịch đệm điện di
EOF giảm ở pH thấp và tăng ở pH cao
+ Cỏch tiện lợi để thay đổi EOF
+ Thay đổi được điện tớch, cấu trỳc chất tan
Lực ion, nồng độ dung dịch đệm
Làm giảm thế zeta và EOF khi tăng lực ion, nồng độ dung dịch đệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Lực ion lớn, tạo dũng điện lớn và hiệu ứng Jun lớn
+ Độ nột pic sắc kớ bị ảnh hưởng nếu độ dẫn khỏc độ dẫn của mẫu
+ Hạn chế sự nạp mẫu Nhiệt độ Thay đổi độ nhớt 2 –
3%/0C
Dựng khi kiểm tra và khống chế nhiệt độ tự động
Dựng cỏc chất phụ gia, dung mụi hữu cơ
Thay đổi thế zeta, độ nhớt, EOF bị giảm + Thay đổi phức, xỏc định dễ dàng bằng thực nghiệm + Cú thể thay đổi độ chọn lọc của hệ pha Cỏc chất hoạt động bề mặt Hấp phụ lờn thành mao quản qua tương tỏc ionic hay hydrophopic
+ Chất hoạt động bề mặt là ation làm tăng EOF, cation làm giảm EOF, cú thể đổi chiều EOF + Thay đổi độ chọn lọc Dựng polymer
hydrophilic trung tớnh
Hấp phụ lờn thành mao quản qua tương tỏc hydrophopic
+ Làm giảm EOF qua thay đổi điện tớch bề mặt
+ Làm tăng độ nhớt Hoạt húa bề mặt bằng
cỏch cộng hợp
Tạo liờn kết húa học mới lờn thành mao quản
+ Cú nhiều cỏch thay đổi: hydrophylicity, thay đổi điện tớch
+ Làm bền bề mặt mao quản
4. Tối ưu húa phộp phõn tớch sắc kớ điện di mao quản
Muốn cú kết quả sắc kớ điện di tốt nhất thiết phải tối ưu húa cỏc điều kiện cho sự tỏch sắc kớ. Nội dung cụng việc này gồm cỏc vấn đề sau:
4.1. Chuẩn bị mẫu, nạp mẫu
4.1.1. Chuẩn bị mẫu
Xử lý mẫu bằng cỏc kĩ thuật như: vụ cơ húa ướt, vụ cơ húa khụ, khụ – ướt kết hợp, cỏc kĩ thuật chiết, sắc kớ, điện phõn, …
Mẫu đưa vào ống mao quản của HPCEC phải ở trạng thỏi lỏng, do đú phải hũa tan chất phõn tớch bằng dung mụi thớch hợp. Dung mụi này thường là dung mụi làm pha động. Tựy chất phõn tớch mà chọn dung mụi thớch hợp.
Vớ dụ: xử lý mẫu để xỏc định cỏc α và β-caroten: + Mẫu xay thành bột và bảo quản ở -150C.
+ Lấy 5g mẫu đó xay mịn cho vào bỡnh chiết, thờm 15 – 20g Na2SO4 khan, 1g MgCO3 khan, trộn đều, thờm 20 mL dung mụi THF, khuấy đều trong 5 phỳt. Lọc hỳt chõn khụng, lấy pha hữu cơ chứa cỏc carotene vào bỡnh cất quay chõn khụng, cất dến cũn khoảng 1 mL, để yờn 1 phỳt cho khụ rồi hũa tan và định mức thành 5 mL bằng THF. Li tõm tỏch bỏ cặn. Đõy là dung dịch để xỏc định cỏc α và β-caroten bằng HPCEC.
4.1.2. Nạp mẫu
Nạp mẫu vào ống mao quản chỉ được phộp tối đa là 2% chiều dài hiệu lực l của ống. Cú 3 phương phỏp nạp mẫu là: dựng ỏp suất, dựng xi-phong và phương phỏp điện động học.
Hỡnh 13. Ba cỏch nạp mẫu trong CEC:
a) dựng xi-phong; b) dựng ỏp suất; c) dựng dũng điện
4.2. Chọn cỏc điều kiện tối ưu
4.2.1. Chọn mao quản và pha tĩnh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chọn mao quản và pha tĩnh tựy thuộc mỗi kiểu HPCEC và mẫu nghiờn cứu: + Mao quản trống: dựng cho CZE;
+ Mao quản cú pha tĩnh: cỏc kiểu cũn lại.
Chọn chiều dài mao quản: thường L = 30 – 120 cm, l = 20 – 100 cm.
Chọn đường kớnh trong của mao quản: thường khoảng 25 – 75 μm.
4.2.2. Chọn pha động
Chọn pha động phụ thuộc mẫu phõn tớch. Pha động thường là dung dịch đệm pH và cú chất điện li thớch hợp hoặc chỉ cú chất đệm pH làm cả 2 chức năng.
Chọn pha động phải chỳ ý cỏc điều kiện: thành phần và giỏ trị pH đệm; nồng độ chất điện li; cỏc chất phụ gia nếu cú; dung mụi hữu cơ để biến tớnh pha động điện di.
4.2.3. Chọn thế điện di
Chọn thế điện di V dựa vào cỏc yếu tố:
Bản chất chất phõn tớch, chất nền của mẫu;
Bản chất mao quản và pha tĩnh;
Bản chất, thành phần chất điện giải và chất đệm pH trong pha động;
Giỏ trị pH đệm.
4.2.4. Chọn đetector
Tựy bản chất chất phõn tớch để chọn detector phự hợp theo bảng 5.
4.3. Chọn phương phỏp phõn tớch thớch hợp
Dựa vào đặc điểm chất phõn tớch để lựa chọn phương phỏp phõn tớch phự hợp.
* Sắc kớ điện di mao quản vựng (CZE): dựng tỏch và phõn tớch cỏc amino axit, peptit, cỏc chất cú cấu tạo ion, cỏc đồng phõn khụng gian, cỏc loại hợp chất cú khả năng ion húa như cỏc ion kim loại, muối của axit hay bazo hữu cơ, …
* Sắc kớ điện di mao quản kiểu Micell (MEKC): sử dụng để tỏch cỏc chất mang điện và khụng mang điện, cỏc hợp chất ưa nước và kị nước. Nú cũng dựng để tỏch cỏc amino axit, cỏc họ nucleotit, cỏc loại vitamin, hidrocacbon thơm, cỏc sản phẩm dược (thuốc viờn, thuốc tiờm, thuốc dạng kem) và cỏc hợp chất sinh học.
Bảng 5. Một số detector dựng trong HPCEC
Detector Áp dụng cho Giới hạn phỏt
hiện (M) Ghi chỳ Hấp thụ UV- Vis Chất hấp thụ trong vựng UV-Vis 10-5 – 10-8 Phõn tớch nhiều chất
Huỳnh quang Chất cú khả năng phỏt huỳnh quang hoặc tạo với
thuốc thử chất cú khả năng phỏt huỳnh quang
Độ dẫn điện Vạn năng 10-7 – 10-8
Đo ampe Chất cú hoạt tớnh điện húa 10-10 – 10-11 Nhạy, chọn lọc. Đũi hỏi vận hành chặt chẽ
Phổ khối 10-8 – 10-9 Nhạy, cung cấp
thụng tin về cấu trỳc
Bức xạ kế Chất cú hoạt tớnh phúng xạ 10-10 – 10-12
Hỡnh 14. Tỏch cỏc cation trong CZE (dựng tỏc nhõn giỏn tiếp Cu2+) Điều kiện: mao quản 50 cm x 50 μm; V = 20 kV; detector UV, 215 nm. Sb 3,6 ppm (1), K 7,8 ppm (2), Na 4,6 ppm (3), Ca 4 ppm (4), Mg 2,4 ppm (5), Sr (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hỡnh 15 . Tỏch cỏc heroin bằng MEKC
Điều kiện: dung dịch đệm (SDS 85 mM, borat 8,5 mM, photphat 8,5 mM, CH3CN 15%) pH = 8,5; l = 50 cm; đường kớnh trong 50 μm; V = 30 kV; t0 = 500C;
detector UV, 210 nm
* Sắc kớ điện di gel (Gel-CE): dựng tỏch cỏc chất cú khối lượng phõn tử lớn như axit nucleotit, protein, … dựa vào kớch thước của cỏc phõn tử chất tan.
Hỡnh 16.. Tỏch cỏc AND dựng Gel-CE
Điều kiện: gradient điện trường 400 – 100 V/cm; mao quản 27 cm x 100 μm; đệm pH = 8,3 (TRIS – borat 100 mM, EDTA 2 mM)
M: 72 (1), 118 (2), 194 (3), 234 (4), 271 (5), 281 (6), 310 (7), 603 (8), 72 (9), 1078 (10), 1353 (11)
* Sắc kớ điện di mao quản hội tụ đẳng điện (CIEFC): dựng tỏch cỏc chất như peptit, protein, cỏc đồng phõn hỡnh học, phõn tớch hemoglobin, cỏc dung dịch sinh học loóng…
Hỡnh 17. Tỏch cỏc hemoglobin bằng CIEFC Điều kiện: mao quản: 12 cm x 25 μm; V = 8 kV;
pH đệm 3 – 10; detector UV 280 nm Điểm đẳng điện pI: A 7,1; F 7,15; S 7,25; C 7,5.
5. Mỏy sắc kớ điện di mao quản hiệu năng cao
Hỡnh 18. Sơ đồ nguyờn tắc cấu tạo của hệ HPCEC
Để thực hiện sự điện di thỡ hệ thống mỏy HPCEC phải cú cỏc bộ phận sau:
1. Bộ buồng điện cực, bỡnh điện di và cỏc điện cực trơ (Au hay Pt); 2. Cột tỏch sắc kớ (ống mao quản);
3. Nguồn cấp thế 1 chiều (10 – 40 kV) để tạo điện trường E; 4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản;
5. Bộ phận phỏt hiện cỏc chất sau khi tỏch (detector); 6. Bộ phận điều nhiệt cho ống mao quản;
Hỡnh 19. Sơ đồ nguyờn tắc hoạt động của mỏy HPCEC
5.2. Hoạt động của mỏy HPCEC
Thế 1 chiều V gõy ra điện trường E và phỏt sinh lực điện làm cho cỏc chất tan di chuyển theo một hướng nhất định. Cỏc chất khỏc nhau, cú điện tớch và độ lớn khỏc nhau sẽ di chuyển với tốc độ nhanh, chậm khỏc nhau và tạo nờn sự tỏch sắc kớ.
Cú thể phỏt hiện cỏc chất bằng cỏch phỏt hiện trực tiếp hoặc giỏn tiếp tựy thuộc vào bản chất cỏc chất phõn tớch hoặc cỏc tớnh chất lý húa và vật lý của chất như:
- Sự hấp thụ quang phõn tử và nguyờn tử của cỏc chất; - Sự phỏt xạ huỳnh quang của cỏc chất, khi bị kớch thớch;
- Tớnh chất điện húa của cỏc chất, như phản ứng điện húa trờn điện cực; - Chỉ số chiết suất của cỏc chất;
- Độ dẫn nhiệt, hay sự hấp thụ nhiệt của cỏc chất,…
Ứng với mỗi tớnh chất đú người ta cú một loạt detector tương ứng: + Detector đo phổ hấp thụ phõn tử vựng UV- Vis (190 - 800 nm); + Detector đo phổ huỳnh quang phõn tử;
+ Detector đo phổ phỏt xạ và hấp thụ phõn tử; + Detector điện húa đo dũng hay đo thế; + Detector đo chỉ số chiết suất của chất; + Detector đo dẫn điện, hay độ hấp thụ nhiệt; + Detector khối phổ;
+ Detector mảng diốt.
6. Cỏc phương phỏp định tớnh, định lượng bằng HPCEC
6.1. Phõn tớch định tớnh
Nguyờn tắc:
Mỗi chất phõn tớch trong cỏc điều kiện tỏch CEC đó chọn nhất định cú một thời gian lưu tRi nhất định. Thời gian lưu tRi là thụng số đặc trưng dựng để phỏt hiện định tớnh cỏc chất trong hỗn hợp mẫu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cỏch tiến hành:
+ Chạy sắc kớ của mẫu chuẩn trong điều kiện tối ưu đó chọn để xỏc định thời gian lưu của từng chất.
+ Chạy sắc kớ mẫu phõn tớch trong cựng điều kiện như mẫu chuẩn và so sỏnh thời gian lưu để kết luận sự cú mặt của từng chất.
6.2. Phõn tớch định lượng
6.2.1. Phương trỡnh cơ bản
Mỗi chất phõn tớch trong những điều kiện tối ưu đó chọn, ở vựng nồng độ nhất định thỡ tớn hiệu phõn tớch (diện tớch S, chiều cao H của pic) liờn hệ với nồng độ C của chất phõn tớch qua biểu thức:
Si = k1Ci và Hi = k2Ci (6.1) Trong đú k1, k2 là cỏc hằng số thực nghiệm.
Dựa trờn phương trỡnh (6.1) người ta thường định lượng cỏc chất theo phương phỏp đường chuẩn và phương phỏp thờm chuẩn.
6.2.2. Phương phỏp đường chuẩn* Cỏch tiến hành: * Cỏch tiến hành:
Chuẩn bị dóy dung dịch chuẩn chứa chất phõn tớch cú nồng độ C khỏc nhau trong điều kiện tương tự mẫu phõn tớch. Tiến hành phộp tỏch sắc kớ để tớnh chiều cao hay diện tớch đối với dóy chuẩn.
Dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc S hay H của pic vào nồng độ C.
Thực hiện phộp phõn tớch với chất nghiờn cứu X trong cựng điều kiện để xỏc định Sx hay Hx rồi thay vào phương trỡnh đường chuẩn để cú Cx cần tỡm.
* Ưu điểm: Phương phỏp đường chuẩn tiện lợi cho việc phõn tớch hàng loạt một loại mẫu cựng đối tượng vỡ nú đơn giản, nhanh và dễ thực hiện.
* Nhược điểm: dễ mắc sai số hệ thống vỡ khụng thể chuẩn bị một dóy cỏc dung dịch chuẩn trong điều kiện hoàn toàn giống nhau và giống với mẫu thật. Lỳc này phải dựng phương phỏp thờm chuẩn.
6.2.3. Phương phỏp thờm chuẩn* Cỏch tiến hành: * Cỏch tiến hành:
+ Pha dóy chuẩn cũng chớnh là dung dịch nghiờn cứu và cú thờm chất cần xỏc định với những nồng độ chớnh xỏc Cti rồi đo S hoặc H của pic:
C Cx Cx + Ct1 Cx + Ct2 Cx + Ct3 Cx + Ct4 Cx + Ct5
S S0 S1 S2 S3 S4 S5
+ Vẽ đồ thị Si – Cti rồi ngoại suy hoặc tịnh tiến đồ thị về gốc tọa độ để xỏc định Cx.
Hỡnh 21.. Xỏc định Cx bằng phương phỏp thờm chuẩn * Ưu điểm:
Phương phỏp thờm chuẩn khắc phục được hạn chế của phương phỏp đường chuẩn do đó loại trừ được mọi ảnh hưởng của nền (vỡ mẫu nào cũng cú nền giống nhau). Do đú phương phỏp này cú độ chớnh xỏc cao hơn phương phỏp đường chuẩn.
BÀI TẬP
Bài 1. Trong ống mao quản cú chiều dài hiệu lực 50 cm, độ dài tổng cộng 58,5 cm
đặt một hiệu thế 25000 V. Sau quỏ trỡnh chạy sắc kớ, trờn sắc đồ người ta thu được 3 pic với thời gian lưu lần lượt là 38,4s, 50,7s, 93,1s ứng với 3 chất X, Y, Z. Tớnh độ điện di toàn phần, độ điện di hiệu lực của X, Y, Z. Biết Y là chất trung tớnh, từ đú cú nhận xột gỡ về giỏ trị độ điện di hiệu lực μef ?
GIẢI
• Ta cú cụng thức tớnh độ điện di toàn phần: EOF
. . tot i i L l V t à = +à à = → ( ) 58,5.50 38, 4.25000 tot X à = = 3,05.10-3 (cm2.V-1.s-1)
( ) 58,5.50 93,1.25000 tot Z à = = 1,26.10-3 (cm2.V-1.s-1) Chất Y trung tớnh nờn μi = 0, do đú: ( ) EOF 58,5.50 50, 7.25000 tot Y à = à = = 2,31.10-3 (cm2.V-1.s-1)
• Độ điện di hiệu lực: àef =àtot −àEOF
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});