6. Cỏc phương phỏp định tớnh, định lượng bằng HPCEC
6.2.3. Phương phỏp thờm chuẩn
* Cỏch tiến hành:
+ Pha dóy chuẩn cũng chớnh là dung dịch nghiờn cứu và cú thờm chất cần xỏc định với những nồng độ chớnh xỏc Cti rồi đo S hoặc H của pic:
C Cx Cx + Ct1 Cx + Ct2 Cx + Ct3 Cx + Ct4 Cx + Ct5
S S0 S1 S2 S3 S4 S5
+ Vẽ đồ thị Si – Cti rồi ngoại suy hoặc tịnh tiến đồ thị về gốc tọa độ để xỏc định Cx.
Hỡnh 21.. Xỏc định Cx bằng phương phỏp thờm chuẩn * Ưu điểm:
Phương phỏp thờm chuẩn khắc phục được hạn chế của phương phỏp đường chuẩn do đó loại trừ được mọi ảnh hưởng của nền (vỡ mẫu nào cũng cú nền giống nhau). Do đú phương phỏp này cú độ chớnh xỏc cao hơn phương phỏp đường chuẩn.
BÀI TẬP
Bài 1. Trong ống mao quản cú chiều dài hiệu lực 50 cm, độ dài tổng cộng 58,5 cm
đặt một hiệu thế 25000 V. Sau quỏ trỡnh chạy sắc kớ, trờn sắc đồ người ta thu được 3 pic với thời gian lưu lần lượt là 38,4s, 50,7s, 93,1s ứng với 3 chất X, Y, Z. Tớnh độ điện di toàn phần, độ điện di hiệu lực của X, Y, Z. Biết Y là chất trung tớnh, từ đú cú nhận xột gỡ về giỏ trị độ điện di hiệu lực μef ?
GIẢI
• Ta cú cụng thức tớnh độ điện di toàn phần: EOF
. . tot i i L l V t à = +à à = → ( ) 58,5.50 38, 4.25000 tot X à = = 3,05.10-3 (cm2.V-1.s-1)
( ) 58,5.50 93,1.25000 tot Z à = = 1,26.10-3 (cm2.V-1.s-1) Chất Y trung tớnh nờn μi = 0, do đú: ( ) EOF 58,5.50 50, 7.25000 tot Y à = à = = 2,31.10-3 (cm2.V-1.s-1)
• Độ điện di hiệu lực: àef =àtot −àEOF
→ μef (X) = 3,05.10-3 - 2,31.10-3 = 7,40.10-3 (cm2.V-1.s-1) μef (Z) = 1,26.10-3 - 2,31.10-3 = -1,05.10-3 (cm2.V-1.s-1) μef (Y) = 2,31.10-3 (cm2.V-1.s-1)
Nhận xột: μef (Z) < 0 → Z là một anion; μef (X) > 0 → X là một cation.
Bài 2. Định lượng NO3- trong một bể nuụi cỏ bằng phương phỏp CZE với chất nội
chuẩn IO4-. Dung dịch chuẩn NO3- 15,0 ppm và IO4- 10,0 ppm cho diện tớch pic lần lượt là 95,0 và 100,1 đơn vị. Một mẫu nước được pha loóng 100 lần rồi thờm chất nội chuẩn đến nồng độ 10,0 ppm. Phõn tớch bằng CZE thu được cỏc diện tớch lần lượt là 29,2 và 105,8 đối với NO3- và IO4-. Tớnh nồng độ NO3- trong mẫu nước bể nuụi cỏ theo ppm.
GIẢI Áp dụng cụng thức trong phương phỏp nội chuẩn: IS IS . A A S C k S = C
Trong đú: SA, SIS lần lượt là diện tớch pic của chất chuẩn và chất nội chuẩn; CA, CIS lần lượt là nồng độ của chất chuẩn và chất nội chuẩn.
Theo đề bài ta cú: 95 15 .
100,1=k 10 → k = 0,6327 Thế cỏc giỏ trị vào tớnh đối với mẫu nước ta cú: 29, 2 0,6327. 105,8 10 A C = → CA = 4,362 ppm
→ Nồng độ NO3- trong mẫu nước bể nuụi cỏ: 100CA = 436,2 ppm.
Bài 3. Tỏch cỏc ankylpiridin bằng CZE. Việc tỏch được thực hiện trong ống mao
quản cú đường kớnh trong 50 μm, chiều dài tổng cộng 57 cm, chiều dài hiệu lực 50 cm. Dung dịch đệm pH = 2,5. Sự tỏch tối ưu với thế điện di là 15 kV. Độ điện di thẩm thấu đo được là 6,398.10-5 cm2.V-1.s-1. Hệ số phõn bố của cỏc ankylpyridin, D = 1,0.10-5 cm2.s- 1.
a) Tớnh độ điện di của 2-etylpyridin, biết thời gian lưu của nú là 8,20 phỳt. b) Tớnh số đĩa lý thuyết đối với 2-etylpyridin.
c) Độ điện di của 3-etylpyridin và 4-etylpyridin lần lượt là 3,366.10-4 cm2.V-1.s-1 và 3,397. 10-4 cm2.V-1.s-1. Tớnh độ phõn giải của 2 chất này.
GIẢI a) Áp dụng cụng thức: EOF . . tot i i L l V t à = +à à = → EOF . . i i L l V t à = −à = 57.50 15000.8, 2.60 - 6,398.10 -5 = 3,22.10-4 (cm2.V-1.s-1) b) Áp dụng cụng thức tớnh số đĩa lý thuyết ta cú: 4 5 EOF 5 ( ). (3, 22.10 6,398.10 ).15000 28950 2 2.1.10 i V N D à à − − − + + = = = c) Để tớnh độ phõn giải R trước hết tớnh: ∆μ = μ2 - μ1 = 3,397.10-4 - 3,366.10-4 = 0,031.10-4 (cm2.V-1.s-1) μTB = 1 2 2 à à+ = (3,366.10-4 + 3,397.10-4)/2 = 3,3815.10-4 (cm2.V-1.s-1) Ta cú: 4 4 5 5 EOF 15000 0,177. 0,177.0,031.10 . ( TB ). (3,3815.10 6,398.10 ).10 V R D à à à − − − − = ∆ = + + R = 1,1.
Bài 4. Tỏch cỏc protein bằng HPCEC. Mao quản dài 84 cm, thế điện di 25000 V.
Một phõn tử trung hũa được dũng EOF mang theo phải mất hết 308s để di chuyển đoạn 64 cm từ chỗ nạp mẫu đến detector. Chất A cú thời gian lưu là 343s. Tớnh độ điện di tổng cộng và độ điện di hiệu lực của chất A.
GIẢI
Độ điện di tổng cộng của chất A:
Cường độ điện trường E: E = V/L = 25000/84 = 298 V/cm μtot = 64 / 343
298
A u
E = = 6,26.10-4 (cm2.V-1.s-1) Tốc độ tuyến tớnh của dũng EOF:
uEOF = 64
308 = 0,208 ( cm/s)
Độ điện di của dũng EOF:
Từ uEOF = μEOF.E → μEOF = uEOF /E = 0,208 /298 = 6,98.10-4 (cm2.V-1.s-1)
Độ điện di hiệu lực:
Vỡ μef < 0 nờn cú thể suy ra A là một anion.
Bài 5. Phõn tớch sắc kớ điện di mao quản với kỹ thuật CZE. Mao quản cú chiều dài
tổng là 32cm, chiều dài hiệu lực là 24,5cm ở thế điện di 30 kV. Dưới những điều kiện của thớ nghiệm ghi được trong mụi trường trung tớnh đó xuất hiện chất cú thời gian lưu là 3 phỳt.
a) Tớnh độ điện di hiệu lực của một chất cú thời gian lưu 2,5 phỳt.
b) Tớnh hệ số khuyếch tỏn dưới những điều kiện đó cho của chất đú, biết số đĩa lý thuyết N = 80 000.
ĐS: a) 2,88.10-5 (cm2.V-1.s-1) b) D = 2,5.10-5 (cm2.s-1)
Bài 6. Trong một phộp tỏch HPCEC, mao quản cú chiều dài tổng bằng 1m, chiều
dài hiệu lực bằng 90cm. Thế ỏp đặt vào hai đầu ống mao quản là 30 kV. Detector được đặt phớa trước catot với chất đệm cú pH = 5. Trong một dung dịch tiờu chuẩn, chất tan cú thời gian lưu là tm = 10 phỳt.
a) Tớnh độ điện di tổng cộng của chất đú.
b) Nếu một phõn tử nhỏ khụng mang điện cú thời gian lưu bằng 5 phỳt, hóy xỏc định độ điện di của dũng EOF.
c) Tớnh độ điện di hiệu lực của chất đú.
d) Tớnh số đĩa lý thuyết N nếu chất cú hệ số khuếch tan D = 2.10-5 cm2/s.
ĐS: a) 7,5.10-4 (cm2.V-1.s-1) b) 1,5.10-3 (cm2.V-1.s-1) c) – 7,5.10-4 (cm2.V-1.s-1) d) N = 337 500.
Bài 7. Cho một cột mao quản dài 50cm được ỏp đặt thế 30 000V, độ điện di tớnh
được với thời gian 10 phỳt là 2.10-8 m2s-1V-1. Tớnh số đĩa lý thuyết cho ion Li+ (D = 1,0.10-9 m2s-1) và cho một protein cú phõn tử khối 105 (D = 3.10-11m2s-1).
ĐS: Li+: 3.105 đĩa; Protein: 107 đĩa.
Bài 8. Định lượng vitamin B1 bằng kĩ thuật CZE hoặc MEKC sử dụng chất nội
chuẩn là o-ethoxybenzamide. Khi phõn tớch dung dịch chứa 100,0 ppm B1 và 100,0 ppm o- ethoxybenzamide thỡ diện tớch pic của B1 bằng 71% diện tớch pic chất nội chuẩn. Phõn tớch 0,125g thuốc viờn vitamin B cho diện tớch pic của B1 bằng 1,82 lần so với chất nội chuẩn. Tớnh số mg vitamin B1 cú trong thuốc này, biết thể tớch dung dịch ban đầu là 20 mL.
Bài 9. Một cation vụ cơ cú độ điện di 4,31.10-4 cm2.V-1.s-1 và hệ số khuếch tỏn 9,8.10-6 cm2.s-1 được phõn tớch bằng kĩ thuật CZE với mao quản dài 50 cm và thế điện di 10 kV. Trong điều kiện này, dũng điện di thẩm thấu cú tốc đụ 0,85 mm/s đi về phớa catot. Nếu detector được đặt cỏch điểm nạp mẫu 40 cm thỡ cation mất bao lõu để đến được detector ?
ĐS: 3,9 phỳt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Luận (2002), Cơ sở lý thuyết của Sắc kớ điện di mao quản hiệu năng cao (HPCEC), ĐH KHTN – ĐHQG Hà Nội.
2. David Harvey (2000), Modern analytical chemistry, Mc Graw Hill.
3. Daniel Harris (2007), Quantitative Chemical Analysis, W.H Freeman and Company, New York.
4. Nicola Volpi (2005), Capillary Electrophoresis of Carbohydrates, Humana Press.
5. Robetr Weinberger (1999), Practical Capillary Electrophoresis, AP.
6. Ruth Freitag (2002), Modern Advances in Chromatography, University of California, USA.
7. Jack Cazes (2004), Encyclopedia of Chromatography.
8. Skoog, West, Holler & Crouch (2004), Fundamentals of analytical chemistry, Thomson Brooks/Cole.
MỤC LỤC
Cú độ nhạy khỏ cao đối với nhiều chất (cú thể phỏt hiện chất cú nồng độ cỡ 100ppb)...84 Khoảng tuyến tớnh rất rộng (hơn kộm nhau đến hàng triệu lần)...84 Độ bền tớnh hiệu cao, ớt bị ảnh hưởng bởi tốc độ dũng khớ mang và cỏc thụng số thực nghiệm khỏc...84 Nhúm E: mẫu (nhúm A, B, C hoặc D) tồn tại ở dạng dung dịch...89 Nhúm F: mẫu cú chứa một số thành phần khụng bay hơi hoặc rất khú bay hơi...89 Trờn cơ sở thành phần của mẫu sẽ quyết định lựa chọn những phương tiện thiết bị và điều kiện làm việc...89 5.1. Chọn cột tỏch...89 - Rỳt ngắn thời gian phõn tớch đối với cỏc mẫu cú khoảng điểm sụi rộng...90 - Tỷ lệ giữa chiều cao pic và chiều rộng pic luụn ổn định vỡ thế thuận lợi cho phõn tớch định lượng. Thụng thường, cỏc mẫu hợp chất thiờn nhiờn rất phức tạp nờn khụng thể bằng một phương trỡnh tuyến tớnh thu được kết quả mong muốn mà phải sử dụng đa phương trỡnh, nghĩa là ở khoảng nhiệt độ giữa chừng cú thể giữ đẳng nhiệt cột trong thời gian thớch ứng rồi lại tăng tiếp với tốc độ mong muốn. Trước và sau chương trỡnh cú thể giữ ở nhiệt độ cố định. ...90 Nhiệt độ của buồng điều nhiệt phải được điều chỉnh với tốc độ thớch ứng như chương trỡnh quy định. Hiện nay chưa cú mỏy sắc ký nào làm việc chớnh xỏc với tốc độ nhỏ hơn /phỳt và lớn hơn /phỳt. Thực tế cột nhồi thường dựng với tốc độ /phỳt, cột mao quản là /phỳt...91 Việc làm nguội buồng điều nhiệt cần phải được tiến hành nhanh chúng, và thường làm nguội sõu hơn nhiệt độ làm việc ban đầu để quỏ trỡnh thực hiện chương trỡnh mới nhanh chúng ổn định, vỡ khi cửa buồng điều nhiệt núng, nhiệt trong cỏc tấm cỏch nhiệt lại phả ra...91 Nhiệt độ của buồng bay hơi mẫu cần phải được đưa lờn cao, độc lập với nhiệt độ của buồng điều nhiệt nhằm làm sự bay hơi mẫu ổn định và lặp lại cho dự nhiệt độ tăng hay giảm...91 Khớ mang sử dụng phải tinh khiết, nếu khụng cỏc tạp chất sẽ tớch tụ trước hết ở phần đầu của cột tỏch. Khi nhiệt độ của cột tăng lờn nú sẽ vận chuyển qua cột gõy ra pic lạ bất ngờ...91 Giảm đường kớnh cột tỏch...93 Sử dụng khớ mang với độ nhớt thấp...93
Rất ớt phụ thuộc vào thụng số làm việc, do đú nú là gia trị đặc trưng cho mối chất ứng với một pha tĩnh và một nhiệt độ nhất định. Sự phụ thuộc vào nhiệt độ của chỳng rất nhỏ và về
nguyờn tắc chỉ khoảng 2 – 6 đơn vị khi thay đổi 10oC...94
Độ lặp lại của việc xỏc định chỉ số lưu của hai phũng thớ nghiệm khỏc nhau chỉ lệch 1 đơn vị và thậm chớ với những điều kiện thuận lợi chỉ lệch 0,05 đơn vị...94
1. Giới thiệu về phương phỏp HPCEC...109
1.1. Sự ra đời và phỏt triển...109
1.2. Phõn loại cỏc kiểu HPCEC...110
1.3. Đặc điểm của sắc kớ điện di mao quản hiệu năng cao...111
2. Một số đại lượng trong HPCEC...112
2.1. Tốc độ điện di, độ điện di, thời gian điện di...112
2.1. 1. Tốc độ điện di...112
2.1.2. Độ điện di...112
2.1.3. Thời gian điện di...113
2.2. Hệ số phõn bố và hệ số dung tớch...114
2.2.1. Hệ số phõn bố Ki...114
2.2.2. Hệ số dung tớch ki’...115
2.3. Chiều cao đĩa, số đĩa và số đĩa hiệu lực của mao quản...116
2.4. Tốc độ tuyến tớnh...117
2.5. Độ phõn giải...118
2.6. Hiệu ứng nhiệt và sự gradient nhiệt độ...118
2.6.1. Hiệu ứng nhiệt Jun và ảnh hưởng của nú...118
2.6.2. Kiểm tra và khống chế hiệu ứng nhiệt...120
2.7. Sự tương tỏc của chất phõn tớch với thành mao quản...120
2.7.1. Khỏi niệm về sự tương tỏc...120
2.7.2. Kiểm tra và khống chế tương tỏc cú hại...120
3. Cơ sở lý thuyết của sắc kớ điện di mao quản...122
3.1. Nguyờn tắc của sắc kớ điện di mao quản...122
3.2. Thế điện di và lực điện di...123
3.3. Dung dịch đệm và pha động trong HPCEC...123
3.3.1. Khỏi niệm về pha động trong HPCEC...123
3.3.2. Chất đệm và giỏ trị pH đệm trong HPCEC...124
3.3.3. Chất điện giải trong pha động của HPCEC...125
3.4. Mao quản và pha tĩnh trong HPCEC...125
3.4.1. Mao quản trong HPCEC...125
3.4.2. Pha tĩnh trong HPCEC...126
3.5. Lớp điện kộp trờn thành mao quản...128
3.6. Dũng điện di thẩm thấu...129
3.6.1. Khỏi niệm về dũng điện di thẩm thấu...129
3.6.2. Nguồn gốc dũng điện di thẩm thấu...129
3.6.3. Đặc điểm của dũng điện di thẩm thấu...131
3.6.4. Kiểm tra và khống chế dũng điện di thẩm thấu...133
4.1. Chuẩn bị mẫu, nạp mẫu...135
4.1.1. Chuẩn bị mẫu...135
4.1.2. Nạp mẫu...135
4.2. Chọn cỏc điều kiện tối ưu...135
4.2.1. Chọn mao quản và pha tĩnh...135
4.2.2. Chọn pha động...136
4.2.3. Chọn thế điện di...136
4.2.4. Chọn đetector...136
4.3. Chọn phương phỏp phõn tớch thớch hợp...136
5. Mỏy sắc kớ điện di mao quản hiệu năng cao...139
5.1. Cấu tạo, trang bị...139
5.2. Hoạt động của mỏy HPCEC...141
6. Cỏc phương phỏp định tớnh, định lượng bằng HPCEC...142
6.1. Phõn tớch định tớnh...142
6.2. Phõn tớch định lượng...143
6.2.1. Phương trỡnh cơ bản...143
6.2.2. Phương phỏp đường chuẩn...143
6.2.3. Phương phỏp thờm chuẩn...144
BÀI TẬP...144