phân tích capsaicin bằng hplc

HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

☼☼☼☼☼☼☼

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CHUYÊN NGHÀNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT DƯỢC PHẨM

BÀI: PHÂN TÍCH CAPSAICIN BẰNG HPLC

GVHD: Th.s Nguyễn Thị Ngọc Tuyết Sinh viên: Võ Như Sinh

MSSV: 61002738

TPHCM, 5/2014

I.Tổng quan

1.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Cấu tử đươc tách phân bố giữa pha tĩnh và pha động :

Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất

Dựa trên 2 quá trình:

 Hấp phụ

 Giải hấp phụ

Xảy ra liên tục giữa 2 pha:

 Pha tĩnh: chất rắn hoặc lỏng

 Pha động: chất lỏng (1 chất hoặc hỗn hợp nhiều chất)

Pha động: hòa tan và di chuyển chất phân tích

Pha tĩnh: giữ chất phân tích

SKL chia thành 2 nhóm :

 SK lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển)

 SK lỏng áp suất cao (SKL hiệu năng cao: HPLC)

1.2 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

 Sắc ký phân bố (partition chromatography)

 Sắc ký ion (ion chromatography)

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000)

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography)

Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ

có ái lực với các hợp chất phân cực SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có

độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều

và phổ biến hơn SKPT

1.3 Các quá trình trong sắc ký

Quá trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc ký :

 Những cân bằng động xảy ra giữa pha tĩnh và pha động trong cột sắc ký

 Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất PT từ đầu cột đến cuối cột

Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha, trong đó pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định hoặc gradient

Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa các chất trong pha tĩnh và pha động

Mục đích chính của sắc ký là tách và định tính các chất trong hỗn hợp chất phức tạp Thời gian chất PT bị pha tĩnh lưu giữ (thời gian lưu) quyết định bởi:

 Bản chất của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của chất PT

 Bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải chất PT ra khỏi cột sắc ký Ghi lại toàn bộ quá trình tách sắc ký của hỗn hợp chất PT  sắc ký đồ gồm nhiều peak

Đặc điểm của peak PT:

 Các peak có thể tách rời nhau hoàn toàn

 Chập nhau một phần

 Chập nhau hoàn toàn

Sắc ký đồ phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột tốt hay không tốt

Tách tốt: hỗn hợp có bao nhiêu chất  có bấy nhiêu peak riêng biệt không chập nhau Chất nào bị lưu giữ mạnh sẽ được rửa giải ra sau cùng, chất lưu giữ kém sẽ ra trước

1.4 Ưu điểm của phương pháp sắc ký

 Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất

 Không cần làm bay hơi mẫu

 Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột

 Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò

 Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100L)

1.5 Các cân bằng trong cột HPLC

Mẫu PT đi qua cột: tồn tại đồng thời 3 thành phần:

 SP không chuyển động

 Chất PT vừa chuyển động từ đầu cột đến cuối cột, đồng thời phân bố lại giữa SP

và MP:

 Bị SP hấp phụ, rồi rửa giải bởi MP

 MP: dung môi rửa giải và chuyển động

 Tương tác với các chất, lôi kéo và mang chất PT ra khỏi cột có 3 tương tác chính:

 Sự tương tác và cân bằng của chất PT với SP

 Sự tương tác và cân bằng của chất PT với MP

 Sự tương tác của SP và MP

Ftot = Fa + Fb + Fc

 Chất nào có lực tương tác lơn nhất sẽ bị giữ lại lâu trên cột

 Chất nào có F nhỏ  bị rửa giải đầu tiên

 Ftot khác nhau nhiều thì quá trình tách tốt

Quá trình tách diễn ra trong cột sắc ký

Quá trình tách trong cột :

column

1.6 Sắc ký pha thường và sắc ký pha đảo

So sánh pha thường và pha đảo

m i x e d sample

Mobile phase

Thứ tự rửa giải Chất kém phân cực ra trước Chất phân cực ra trước

Tăng độ phân cực dung môi Rửa giải nhanh hơn Rửa giải chậm hơn

1.6.1 Sắc ký pha thươnc ký pha thường

Cột nhồi trong sắc ký pha thường

 Cột silica trung tính:

 Bề mặt có chứa nhóm phân cực (ưa nước): -OH

 Xác định các chất không phân cực hoặc ít phân cực

 Cột silica trên nền mạch carbon:

 -Si-CH2CH2CH2CN

 -Si-CH2CH2CH2NH2

 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)

 Cột cyano: đa mục đích

 Cột amino: phân tích đường

 Cột diol: protein

 Dung môi chủ yếu: không phân cực

 Hydrocarbon: hexan, pentan, octan

 Aromatic hydrocarbon: benzen, toluen, xylen,…

 Chloroform CHCl3

 Methylene chloride CH2Cl2

 Dung môi phụ: phân cực hoặc hơi phân cực : ethanol, methanol

1.6.2 Sắc ký pha thương ký pha đảo

Cột nhồi trong sắc ký pha đảo

 Cột: không phân cực

 Pha động: phân cực

 Cột silica đã alkyl hóa các nhóm –OH trên bề mặt silica trung tính:

 Cột C18 (ODS)

 Cột C8 (octyl)

 Cột C4 (butyl)

 Cột phenyl

 Bề mặt không phân cực hay ít phân cực (kỵ nước)

Xác định chất phân cực, không phân cực và ít phân cực

Dung môi trong HPLC pha đảo

 Dung môi phân cực: Methanol (CH3OH: MEOH), acetonitrile (CH3CN: ACN)

 Dung dịch đệm

 Tối ưu hóa tỉ lệ dd đệm/ dung môi rất quan trọng để quá trình tách tốt

1.7 ột s đại ư ng cơ bản trong phân t ch sắc ký

1.7.1 Hệ s phân b

Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như sau:

Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố (partition coefficient) và được tính như sau:

Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh

CM : nồng độ cấu tử trong pha động

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích

1.7.2 Thời gian ưu:

tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột

tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết

t’R : thời gian lưu thật của một cấu tử

1.7.3 Hệ s dung ư ng k’

k’ được định nghĩa theo công thức sau:

Với VS : thể tích pha tĩnh

VM : thể tích pha động

Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại

Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù

Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20

1.7.4 Hiệu năng

Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột N càng lớn, hiệu năng tách càng cao

Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ Người ta chứng minh được:

Hay :

Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút)

W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)

1.7.5 Độ chọn ọc

Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột

1.7.6 Độ phân giải:

Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó được xác định qua phương trình sau:

Hay :

II Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC

 0: Nguồn cung cấp pha động (mobile phase)

Bình chứa pha động

 1: Bơm cao áp (hệ thống cung cấp dung môi)

 Bơm pha động vào cột tách

 Điểu khiển tốc độ dòng, áp suất của pha động

 2: Van bơm mẫu (Injection valve):

 Bơm mẫu PT vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định

Tiêm mẫu bằng tay Tiêm mẫu tự động (Auto sampler)

 3: Cột tách (Column)

 Cột chứa pha tĩnh

 Yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký

 Cột tách có kích cỡ khác nhau

 Chiều dài: 10 – 25cm

 Đường kính: 2 – 5mm

 4: Đầu dò (detector)

 Thiết bị phát hiện chất phân tích (định tính và định lượng)

 Có nhiều loại khác nhau tùy mục đích phân tích: UV-VIS, hùynh Quang, độ dẫn, điênh hóa, khối phổ,…

 Detector

 UV-Vis: detector phổ hấp thu phân tử : xác định các chất có khả năng hấp thu quang

 Huỳnh quang (Fluorescence detector): xác định các chất có khả năng phát huỳnh quang (Alflatoxin, Mycotoxin, Amino Acid, thuốc trừ sâu họ

Carbamate,….)

 Đầu dò chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector: RI)

 Đầu dò độ dẫn (Conductivity detector): xác định các ion vô cơ, hữu cơ

 Đầu dò khối phổ (MS: mass spectrometry): xác định phần lớn các chất hữu cơ

 5 Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu:

 Thu thập và xử lý kết quả

 Recorder, Computer + printer, software

III Thí nghiệm

3.1 Đặc tính kỹ thuật thiết bị

 Model: Agilent 1200

 Hãng sản xuất: Agilent Technologies

 Xuất xứ: Đức – Nhật

 Các cụm trong hệ thống:

 Bộ khay đựng dung môi: 4 chai dung môi

 Đuổi khí (Degaser)

 Bơm dung môi (Quat Pump)

 Bộ bơm mẫu tự động (ALS)

 Buồng ổn nhiệt cột (TCC)

 Đầu dò: Detector mảng điốt (DAD)

3.2 Thực hành

a) Chuẩn bị mẫu phân tích

Mẫu phân tích là mẫu thu được từ bài thực hành số 04 Mẫu sau khi trích ly được cô

quay chân không để thu hồi dung môi

 Bước 1: Cân bình cô quay trước khi cho dịch trích ly vào; tiến hành cô quay thu

hồi dung môi cho đến khi thu được cao khô; cân khối lượng bình cô quay sau khi

thu hồi dung môi

 Bước 2: Hòa tan cao thu được trong 100mL methanol (Merck); lọc qua màng lọc 0,45μm; tiến hành phân tích HPLC để định lượng 10-DAB III

b) Ổn định hệ thống

 Bước 1: Trước khi bắt đầu vận hành thiết bị cần kiểm tra hệ thống điện tất cả các modem thành phần của máy

 Bước 2: Bật công tắc nguồn cho hệ thống thiết bị Bật 5 nút power của 5 cụm trong hệ thống

Lưu ý tín hiệu đèn nguồn:

 Màu vàng: đang ở trạng thái chờ

 Màu xanh: đang ở trạng thái sẵn sàng

 Màu xám: cần kiểm tra lại hệ thống điện

 Màu đỏ: đang ở trạng thái báo lỗi

 Bước 3: Bật máy tính, khởi động phần mềm HPLC online để thiết lập các thông

số cho phương pháp đo

c) Sử dụng phần mềm:

 Dao diện phần mềm

+ Method để thiết lập các thông số vận hành cho một phương pháp phân tích

Phân tích capsaicin với các thông s cài đặt như sau:

 Thể tích tiêm mẫu: 5μL

 Thành phần và chương trình pha động:

 Nhiệt độ buồng cột: 320C

 Bước sóng phân tích: 228nm đối với capsaicin

 Tốc độ pha động: 1,25ml/phút; thời gian phân tích: 35 phút

Sequence để điền các thông tin của mẫu phân tích và lựa chọn phương pháp phân tích

d) Quy trình chạy mẫu:

 Purge pha động trước khi cho qua cột: mở van trên Quat pump và lựa chọn kênh

dung môi cần purge sau đó bật bơm dung môi cần purge

 Sau khi purge dung môi, khóa van và bật tất cả các cụm trong hệ thống, load

method thích hợp và chạy ổn định trong vòng 30 phút

 Mẫu phân tích phải được lọc qua đầu lọc với kích thước thích hợp và chứa trong

vial thể tích 2ml, đặt vào vị trí xác định trong khay đựng mẫu

 Chọn tab Sequence vào Edit table để nhập các thông số về mẫu: vị trí vial, tên,

phương pháp chạy, số lần tiêm và tên mẫu

 Chạy mẫu sau khi hệ thống đã ổn định bằng cách bấm biểu tương START, trong quá trình chạy mẫu nếu muốn dừng đột ngột thì bấm biểu tượng STOP

 Sau khi phân tích xong mẫu cần rửa cột lại trong vòng 30 phút hoặc hơn tùy thuộc

vào tính chất mẫu chạy

e) Phân tích kết quả:

 Sử dụng phần mềm HPLC offline

 Load Method thích hợp với mẫu phân tích

 Chọn Report để xuất kết quả

f) Tắt máy:

 Tắt tất cả các cụm phần mềm Tắt máy tính Tắt các nút power trên thiết bị

IV Kết quả và tính toán

Các điểm chuẩn của capsaicine

Diện

Thời gian lưu 6.5phut +-0.5phút

1) Phương trình đường chuẩn của capsaicine :

y = 5.1649x - 22.49

R² = 0.9999

2)

Dựa vào bảng số liệu thu được từ quá trình chạy HPLC ta có diện tích của peak capsaicine là : Area 1599.00818 [mAU*s]

Thế vào phương trinh đường chuẩn : y = 5.1649x - 22.49 R² = 0.9999 Nồng độ của capsaicine trong mẫu phân tích : 315.23713 ppm

Khối lượng cao thu được : 448,53 - 447,45 = 1,08 g

Hàm lượng capsaicine trong mẫu : 1,08*100/5,01 = 21,56 g

y = 5.1649x - 22.49 R² = 0.9999

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Nồng độ (ppm)