phân tích capsaicin bằng hplc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ☼☼☼☼☼☼☼ BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CHUYÊN NGHÀNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT DƯỢC PHẨM BÀI: PHÂN TÍCH CAPSAICIN BẰNG HPLC GVHD: Th.s Nguyễn Thị Ngọc Tuyết Sinh viên: Võ Như Sinh MSSV: 61002738 TPHCM, 5/2014 I.Tổng quan 1.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Cấu tử đươc tách phân bố giữa pha tĩnh và pha động : Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất Dựa trên 2 quá trình:  Hấp phụ  Giải hấp phụ Xảy ra liên tục giữa 2 pha:  Pha tĩnh: chất rắn hoặc lỏng  Pha động: chất lỏng (1 chất hoặc hỗn hợp nhiều chất) Pha động: hòa tan và di chuyển chất phân tích Pha tĩnh: giữ chất phân tích SKL chia thành 2 nhóm :  SK lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển)  SK lỏng áp suất cao (SKL hiệu năng cao: HPLC) 1.2. Phân loại Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:     Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography). Sắc ký phân bố (partition chromatography). Sắc ký ion (ion chromatography). Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography). Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn ([...]... tính, khởi động phần mềm HPLC online để thiết lập các thông số cho phương pháp đo c) Sử dụng phần mềm:  Dao diện phần mềm + Method để thiết lập các thông số vận hành cho một phương pháp phân tích Phân tích capsaicin với các thông s cài đặt như sau:  Thể tích tiêm mẫu: 5μL  Thành phần và chương trình pha động:  Nhiệt độ buồng cột: 320C  Bước sóng phân tích: 228nm đối với capsaicin  Tốc độ pha động:... gian phân tích: 35 phút Sequence để điền các thông tin của mẫu phân tích và lựa chọn phương pháp phân tích d) Quy trình chạy mẫu:  Purge pha động trước khi cho qua cột: mở van trên Quat pump và lựa chọn kênh dung môi cần purge sau đó bật bơm dung môi cần purge  Sau khi purge dung môi, khóa van và bật tất cả các cụm trong hệ thống, load method thích hợp và chạy ổn định trong vòng 30 phút  Mẫu phân tích. .. chuẩn của capsaicine : y = 5.1649x - 22.49 R² = 0.9999 Diện tích (mAU*s) 1400 1200 y = 5.1649x - 22.49 R² = 0.9999 1000 800 600 400 200 0 0 50 100 150 200 250 300 Nồng độ (ppm) 2) Dựa vào bảng số liệu thu được từ quá trình chạy HPLC ta có diện tích của peak capsaicine là : Area 1599.00818 [mAU*s] Thế vào phương trinh đường chuẩn : y = 5.1649x - 22.49 Nồng độ của capsaicine trong mẫu phân tích : 315.23713... trong vòng 30 phút hoặc hơn tùy thuộc vào tính chất mẫu chạy e) Phân tích kết quả:  Sử dụng phần mềm HPLC offline  Load Method thích hợp với mẫu phân tích  Chọn Report để xuất kết quả f) Tắt máy:  Tắt tất cả các cụm phần mềm Tắt máy tính Tắt các nút power trên thiết bị IV Kết quả và tính toán Các điểm chuẩn của capsaicine Nồng độ Diện tích 25.44 50.88 101.76 127.2 152.64 203.52 254.4 114.5 240.5... những lượng mẫu nhất định Tiêm mẫu bằng tay  3: Cột tách (Column)  Cột chứa pha tĩnh  Yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký  Cột tách có kích cỡ khác nhau  Chiều dài: 10 – 25cm  Đường kính: 2 – 5mm Tiêm mẫu tự động (Auto sampler)  4: Đầu dò (detector)  Thiết bị phát hiện chất phân tích (định tính và định lượng)  Có nhiều loại khác nhau tùy mục đích phân tích: UV-VIS, hùynh Quang, độ dẫn,... dung môi: 4 chai dung môi  Đuổi khí (Degaser)  Bơm dung môi (Quat Pump)  Bộ bơm mẫu tự động (ALS)  Buồng ổn nhiệt cột (TCC)  Đầu dò: Detector mảng điốt (DAD) 3.2 Thực hành a) Chuẩn bị mẫu phân tích Mẫu phân tích là mẫu thu được từ bài thực hành số 04 Mẫu sau khi trích ly được cô quay chân không để thu hồi dung môi  Bước 1: Cân bình cô quay trước khi cho dịch trích ly vào; tiến hành cô quay thu... thích hợp và chứa trong vial thể tích 2ml, đặt vào vị trí xác định trong khay đựng mẫu  Chọn tab Sequence vào Edit table để nhập các thông số về mẫu: vị trí vial, tên, phương pháp chạy, số lần tiêm và tên mẫu  Chạy mẫu sau khi hệ thống đã ổn định bằng cách bấm biểu tương START, trong quá trình chạy mẫu nếu muốn dừng đột ngột thì bấm biểu tượng STOP  Sau khi phân tích xong mẫu cần rửa cột lại trong... thu hồi dung môi cho đến khi thu được cao khô; cân khối lượng bình cô quay sau khi thu hồi dung môi  Bước 2: Hòa tan cao thu được trong 100mL methanol (Merck); lọc qua màng lọc 0,45μm; tiến hành phân tích HPLC để định lượng 10-DAB III b) Ổn định hệ thống  Bước 1: Trước khi bắt đầu vận hành thiết bị cần kiểm tra hệ thống điện tất cả các modem thành phần của máy  Bước 2: Bật công tắc nguồn cho hệ thống...1.7.6 Độ phân giải: Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó được xác định qua phương trình sau: Hay : II Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC  0: Nguồn cung cấp pha động (mobile phase) Bình chứa pha động  1: Bơm cao áp (hệ thống cung cấp... Thiết bị phát hiện chất phân tích (định tính và định lượng)  Có nhiều loại khác nhau tùy mục đích phân tích: UV-VIS, hùynh Quang, độ dẫn, điênh hóa, khối phổ,…  Detector  UV-Vis: detector phổ hấp thu phân tử : xác định các chất có khả năng hấp thu quang  Huỳnh quang (Fluorescence detector): xác định các chất có khả năng phát huỳnh quang (Alflatoxin, Mycotoxin, Amino Acid, thuốc trừ sâu họ Carbamate,….) ... hợp chất phân cực SKPT dùng để tách phân tích hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn SKPĐ thuật ngữ để loại sắc ký pha tĩnh phân cực pha động Phương pháp dùng phân tích hợp chất... rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) ứng dụng nhiều phân tích hợp chất từ không phân cực đến hợp chất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân. .. Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất Không cần làm bay mẫu Độ phân giải cao nhờ trình tách cột Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100L) 1.5 Các cân cột HPLC Mẫu