... tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men thê tích đến khả tạo màng BC cho vỉ khuân Gluconacetobacter ” Mục tiêu đề tài Xác định ảnh hưởng tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men thể tích đến khả tạo màng. .. cellulose s Diện tích bề mặt lên men tạo màng BC( cm ) V Thể tích dịch lên men tạo màng (cm ) s/v Tỷ lệ diện tích bề mặt lên men tích dịch lên men tạo màng (cm" ) DANH MỤC BẢNG BIÊU, HÌNH ẢNH HÌNH... chủng Gluconacetobacter 2.2.5.1 Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ s/v đến khả tạo màng BC tốt từ chủng Gluconacetobacter s : diện tích bề mặt dịch lên men tạo màng BC (cm ) V: thể tích dịch lên men
TRƯỜNG ĐẠI HỌC su PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ THẮM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DIỆN TÍCH BÈ MẶT DỊCH LÊN MEN TRÊN THẺ TÍCH ĐÉN KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BC CHO VI KHUẨN GLUCONACETOBACTER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật Ngưòi hưóng dẫn khoa học TS. PHƯƠNG PHÚ CÔNG HÀ NỘI - 2015 Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS Đinh Thị Kim Nhung và TS. Phương Phú Công người đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình em thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo trong tổ Thực Vật- Vi Sinh Khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè, gia đình đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu và hoàn thành khoá luận này. Xin chân thành cảm ơn ỉ LỜI CẢM ƠN Hà Nội, ngày.........thảng...........năm 2015 Sinh viên Hoàng Thị Thắm Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và TS. Phương Phú Công. Trong đề tài, em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, em xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình. Neu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Xin chân thành cảm ơn ỉ Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Hoàng Thị Thắm MỤC LỤC CÁC CHŨ VIẾT TẮT BC Bacterial cellulose Cs Cộng sự G Gam N Niutơn PC Plant cellulose s Diện tích bề mặt lên men tạo màng BC(cm 2 ) V Thể tích dịch lên men tạo màng (cm 3 ) s/v Tỷ lệ diện tích bề mặt lên men trên thế tích dịch lên men tạo màng (cm" 1 ) DANH MỤC BẢNG BIÊU, HÌNH ẢNH HÌNH Hình 1.3. Con đường chuyến hoá cacbon trong vi khuấn Gluconacetobacter Hình 3.1. Ket quả nhuộm Gram của vi khuẩn Gluconacetobacter Hình 3.2. Chủng vi khuấn Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng Hình 3.3. Chủng vi khuấn Gluconacetobacter trên môi trường thạch đĩa Hình 3.4. Hoạt tính catalaza Hình 3.5. Thế hiện mối quan hệ giữa thời gian với khối lượng màng Hình 3.6. Thể hiện mối quan hệ giữa thời gian với độ bền kéo màng Hình 3.7. Màng BC ngày thứ 4 Hình 3.8. Màng tươi sau 5 ngày nuôi cấy Hình 3.9. Hình ảnh màng BC khô Hình 3.10. Mối quan hệ giữa nhiệt độ với khối lượng màng Hình 3.11. Mối quan hệ với độ kéo màng Hình 3.13. Mối quan hệ giữa s/v với khối lượng màng Hình 3.14. Mối quan hệ giữa s/v với độ bền kéo màng Hình 3.15. Hình ảnh ảnh hưởng của tỷ lệ s/v tới khả năng tạo màng BC Các đặc điểm phân biệt Gluconobacter và Acetobacter (So sánh với Pseudomonas) BẢNG Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC Tính quy đối s/v Bảngthí nghiệm nghiên cứu Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC 1.1. từ chủng Gluconacetobacter Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Tính quy đổi s/v thí nghiệm nghiên cứu Bảng Khảo sát tỷ lệ s/v với thời gian xuất hiện màng Khảo sát tỷ lệ s/v đến khả năng 1.2. tạo màng BC tốt nhất từ chủng Gluconacetobacter Ảnh hưởng của tỷ lệ s/v đến độ Bảng 2. dai của màng ỉ. Bảng 3.1. Bảng 3.2. Bảng 3.3. MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Cùng với sự phát triến của khoa học thì công nghệ sinh học (CNSH) đã trở thành một ngành kinh tế chủ đạo của nhiều quốc gia. Là một bộ phận của ngành công nghệ sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang phát triến mạnh mẽ với những thành tựu to lởn trong lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, y học.... Khó có thế tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học mà không liên quan tới vi sinh vật. Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme p - 1,4- glucopyranose mạch thẳng chuỗi polyme p - 1,4- glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfiril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo thành sợi lớn hơn- sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau thành bó và cuối cùng thành dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đấy ra ngoài sẽ liên kết với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc Vandecvan tạo thành dạng sệt hay một lớp màng mỏng. Kích thước của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng [24]. Màng BC có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ khác mà được cấu tạo từ các sợi song song thành mạng lưới cellulose. Do đó BC có độ bền cơ học cao hơn hắn cellulsose của thực vật [24] . Hiện nay màng BC được xem là nguồn nguyên liệu mói có tiềm năng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thực phẩm,công nghệ giấy,công nghệ sản xuất pin,đặc biệt trong lĩnh vực y học như: mặt nạ tẩy trang, điều trị bỏng ... từ các chế phẩm sinh học như: màng ối, màng da ếch. Màng BC chứng minh có hiệu lực tốt [9]. Do sự đa dạng về mặt ứng dụng như trên, tôi quyết định chọn hướng đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men trên thê tích đến khả năng tạo màng BC cho vỉ khuân Gluconacetobacter ” 2. Mục tiêu của đề tài Xác định được ảnh hưởng của tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men trên thể tích đến khả năng tạo màng BC cho vi khuẩn Gluconacetobacter. 3. Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Gluconactobacter phân lập từ nguồn nguyên liệu bia Hà Nội, tại phòng Vi sinh- trường ĐHSP Hà Nội 2 4. Nội dung nghiên cứu của đề tài 4.1. Nghiên cứu khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuấn Gluconacetobacter 4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuấn Gluconacetobacter 4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ s/v đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ s/v tới khả năng tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter 5. Ý nghĩa khoa học của đề tài 5.1. Ỷ nghĩa khoa học Nghiên cứu được tỷ lệ s/v phù hợp nhất đối với quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gỉuconacetobacter 5.2. Ỷ nghĩa thực tiễn Rút ngắn thời gian lên men tạo màng BC cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter nhằm tạo màng BC được tốt nhất, có triến vọng ứng dụng vào một số lĩnh vực trong cuộc sống, đặc biệt là lĩnh vực y học. 6. Điểm mới Tìm ra tỷ lệ s/v = 0,8 thích hợp cho khả năng lên men tạo màng, rút ngắn thời gian lên men tạo màng BC từ chủng vi khuấn Gluconacetobacter, đáp ứng nhu cầu thực tiễn. NỘI DUNG 1.1. CHƯƠNG 1. TỎNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu tổng quan về đối tượng 1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới Đã từ lâu vi khuẩn acetic nói chung và đặc biệt là Gluconacetơbacter nói riêng đã và đang thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ngay từ thế kỷ XIX các nhà khoa học đã tiến hành phân loại chúng, cho đến nay việc phân loại vi khuẩn này vẫn có nhiều ý kiến khác nhau về vấn đề này. Một số đặc điếm sinh lý, sinh hóa là cơ sỏ’ phân loại của nhóm vi khuẩn Acetobacter xylinum Quan điểm 1: Dựa vào khả năng oxy hóa acid acetic, Beijerinck phân chia các loài trong Gluconacetobacter thành 2 nhóm: * Nhóm 1: Có khả năng oxy hoả acid acetỉc thành co2 và H2O + Sử dụng muối amonium (NH4+) làm nguồn nitơ duy nhất (Sinh trưởng trên môi trường Hoyer) + Không sử dụng muối amonium (NH 4 + ) làm nguồn nitơ duy nhất chia ra làm: trên bề mặt môi trường tạo thành màng nhầy chứa cellulose như Gluconacetobacter và trên bề mặt môi trường không tạo thành màng nhầy có chứa cellulosenhư: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter kneỉiỉgỉanus. Nhóm 2: Không có khả năng oxy hoả acid acetỉc. + Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose: sắc tố nâu với đen nhạt (Acetobacter melanogenus); sắc tố hồng (Acetobacter resens) + Không tạo thành sắc tố: Nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 3035°C (Acetobacter suboxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 18-21 °c {Acetobacter oxydans). Theo quan điểm này, Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các loài khác trong chi bao gồm: + Có khả năng oxy hóa acid acetic thành CƠ 2và H 2O + Không sử dụng muối amonium làm nguồn nitơ duy nhất + Trên bề mặt môi trường tạo lớp màng nhầy chứa cellulose. Quan điểm 2: Theo Bergey (1984 và 1992), Gluconacetobacter được xếp vào chi Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae. Họ vi khuấn này gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter . Đặc điểm phân biệt giữa 2 chi cụ thể là: Bảng 1.1. Các đặc điểm phân biệt Gluconobacter và Acetobacter (So sánh Gluconobacter , Acetobactervởi Pseudomonas ) Chi Gluconobacte Acetobacter r 1. Vị trì tiên mao Pseudomona s + Chu mao hoặc Chu mao ở cực không có 2. Phát triển ở pH= 4,5 3. Oxi hóa aceton ở pH= 4,5 + + - + + - 4. Oxi hóa acid acetic - + + 5. Oxi hóa lactate - + + +/- +/- 6. Glucose -> gluconate + 7. Sử dụng tinh bột, lactose - - +/- 8. Sử dụng gelatin - - +/- - - +/- 9. Sắc tố huỳnh quang Quan điểm 3: Theo Boesch và cs (1998) [13], Yamada và cs ( 2000), và hiện nay vẫn có những quan điểm khác nhau về phân loại họ Acetobacteraceactrong đó Gluconacetobacter xylinus (A. xylinum) và xếp vào chi Gluconacetobacter với cơ sở của sự phân chia này là việc phân tích trình tự chuỗi 16S rDNA. Quan điếm này hiện nay có tính chính xác cao do cơ sở là dựa vào cấu trúc phân tử nên được nhiều người công nhận [32]. Đánh giá: Mặc dù xếp chủng vi khuấn Gluconacetobacter vào những chi, những họ, những lớp phân loại khác nhau nhưng tất cả các quan điểm trên đều thống nhất với nhau về một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Gluconacetobacter như: khả năng oxy hóa rượu etylic thành acid acetic, khả năng oxy hóa tiếp tục acid acetic thành CƠ 2 và H 2O; khả năng hình thành acid 5-ketogluconic từ D-glucose... Đặc biệt là khả năng tống hợp cellulose khả năng này hầu như chỉ có ỏ’ các chủng Gluconacetobacter. Đặc điếm hình thái, tế bào học 1.1.2. Gluconacetobacter là loại trực khuẩn, hình que, thẳng hay hơi cong kích thước khoảng 2 |im đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, không có bào tử, xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động. Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuấn Gram âm, hiếu khí, hiếu dị dưỡng, tế bào của chúng tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả hay trong đất [ 1]. Khuấn lạc Gluconacetobacter có kích thước nhỏ(đường kính khuẩn lạc đạt 1 - 2mm),tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng,phần giữa khuẩn lạc lồi lên và sẫm màu hơn các phần xung quanh,rìa mép khuẩn lạc nhẵn. Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng Vi khuẩn Gluconacetobacter có bao nhầy cấu tạo bởi cellulose. Thành phần cấu tạo chủ yếu của bao nhầy là polysaccarit (chủ yếu là glucose). Ngoài ra, còn có các polypeptit, protein. Bao nhầy còn có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám vào giá thể” [ 1]. Một số tác giả cho rang, cellulose tống hợp từ vi khuấn Gluconacetobacter có vai trò dự trữ và có thể sử dụng khi môi trường nghèo kiệt chất dinh dưỡng, nó sẽ phân huỷ nhờ enzyme của vi khuẩn là endoglucanase và exoglucanase (Zippora G.E và cs, 1996). Nhờ đặc tính nhớt và ưa nước của màng BC giúp cho vi khuấn Gluconacetobacter chống lại được những thay đổi bất lợi. 1.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Gluconacetobacter Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25-35°C. pH [4- 6]. Vì Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ sung thêm axit acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuấn lạ. Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của Gluconacetobacter bao gồm: oxy hoá ethanol thành axit acetic, CƠ 2, H 2O; phản ứng catalse dương tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, chuyến hoá glucose thành axit, chuyến hoá glycerol thành dihydroxyaceton, không sinh sắc tố nâu, tổng hợp cellulose [ 2]. 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo màng BC Đe đảm bảo cho hoạt đông sống bình thường của vi khuẩn, môi trường thức ăn ngoài rượu, nước còn phải bố xung thêm muối khoáng, nguồn cacbon, nguồn nito dễ hấp thụ như : (NH 4) 2S 04, MgSƠ 4. 7H 20, KH 2P0 4...[4] Đe phục vụ cho nghiên cứu thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã quvết định sử dụng hàm lượng glucose 20g/l cho các nghiên cứu trên chủng Gluconacetobacter. 1.2.1. Nhu càu nguồn cacbon Theo kết quả nghiên cứu của thạc sỹ Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng A.xylium HN 5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành màng của Gluconacetobacter [11]. Cacbon có trong tế bào chất,thành tế bào,trong tất cả các phân tử enzim, axit nucleic và các sản phấm trao đối chất. Chính vì vậy,những hợp chất hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh vật. Ảnh hưởng của nguồn cacbon dến năng suất màng BC được thế hiện ở bảng 1. 2. Bảng 1.2. Ảnh hưởng cũa nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC Nguồn cacbon Năng suất tông Nguồn Monosaccharide hợp cellulose cacbon Năng suất tổng Disaccharide hợp cellulose D-Glucose 100 Lactose D-Fructose 92 Maltose 16 D-Galactose 15 Sucrose 7 D-Xylose 11 Cellobiose 33 D-Arabinos 14 D-Sorbose 11 7-11 1.2.2. Nhu cầu nguồn Nitơ Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần Nito trong quá trình sống để xây dựng tế bào. Vì vậy nếu nguồn Nito trong môi trường quá ít sẽ ảnh hưởng tới hoạt động sống của tế bào. Vì vậy ảnh hưởng tới quá trình tạo màng BC. Ở nồng độ 2,0g cho hiệu suất màng BC cao nhất. Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter người ta thường sử dụng nguồn nito vô cơ là (NH 4) 2S 04,NH 4N 03, nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men [1 ]. 1.2.3. Nhu cầu của nguồn MgSOặ MgS0 4 ỏ' nồng độ 2g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung :“Mg là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những enzim này xúc tác cho phản ứng chuyến hóa chất trong quá trình hình thành màng BC” [11]. 1.2.4. Nhu cầu của Photpho Photpho ngoài vai trò tham gia cấu trúc của tế bào, nó còn có vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở chủng vi khuẩn Gluconacetobacter. Đe đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta sử dụng các loại phospho vô cơ như: KH2PO4, K 2HPO 4, KNO 3... Việc bổ sung phosphat (nhất là phosphat kali) vào các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường. Đối với vi khuấn Gluconacetơbacter, nguyên liệu chủ yếu hiện nay được sử dụng là nước dừa già, dịch hoa quả, rỉ đường..., khi nuôi cấy không cần phải bổ xung các nguyên tố vi lượng nữa [ 1], [16]. 1.2.5. 1.2.5.1. Điều kiện nuôi cấy ĐộpH Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bố sung thêm axit acetic nhằm axit hoá môi trường. Đồng thời axit acetic còn có tác dụng sát khuấn,giúp ngăn chặn sự phát triến của các vi sinh vật có hại [31]. ỉ.2.5.2. Nhiệt độ Theo Beyger nhiệt độ thích hợp với vi khuấn Gluconacetobacter vào khoảng 25-30°C. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [29], [30]. 1.2.5.3. Độ thông khí Vi khuấn Gluconacetobacter là vi khuấn hiếu khí bắt buộc. Do đó, điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong thực tế độ thông khí quyết định đến năng suất tống hợp BC. 1.2.5.4. Thời gian nuôi cay Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36-48 giờ, hình thành một lớp trong và ngày càng dày. Theo Thesis Holemes (2004), hàm lượng glucose trong môi trường giảm nhất sau 150 giờ nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi khuẩn bắt đầu sử dụng axit gluconic và 5-keto axit gluconic trong quá trình trao đổi chất. Tác giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt trạng thái tốt nhất. 1.2.5.5. Anh hưởng giữa bề mặt và thế tích dịch nuôi cay (tỷ lệ S/V) Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự khả năng hình thành màng tốt nhất ở tỷ lệ thể tích s/v= 0,8 với chiều cao môi trường dụng cụ lên men h= l,25cm [10]. 1.3. 1.3.1. Bacterial cellulose (BC) Cấu trúc BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PC-plant cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme Ị3 -1,4- glucopynanose. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau. Chuỗi polyme (3 - 1,4- glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ ( subfibril) có kích thước l,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn - sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah,1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanakaet.al 2000). Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ l-9nm. Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy [31]. 1.3.2. Một số tính chất của màng BC Brown A.J (1886), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuấn Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất là hemicillulose. Hemicillulose là những polysaccharid không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính [16], [17]. Một số tính chất của màng BC: Độ tinh sạch : màng BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác, có thế phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Độ bền cơ học : màng BC có độ tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước. Tính hút nước : màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính xốp, độ ẩm cao. 1.3.3. Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter Theo Alaban C.A và cộng sự (1967) các enzim tham gia vào quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm: 1PKF: Fructose-1 -photphate kinase PGM: dehydrogenase Phosphoglucomutase UGP: PGI: Phosphoglucoisomerase UDP-glucose pyrophotphorylase Fru-6-P: Fructose-6- PTS: phosphate Glc-l-P: Glucose-1 -phosphate phosphotransferrase UDPGlc: Uridine diphosphoglucose GK: Fru-bi-P: glucokinase phosphate FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase G6PDH: Hệ thong Fructose-1,6-bi- Glc-6-P: Glucose-6-phơsphate. PGA: Phosphogluconic acid acid CS: Cellulose Glucose-6-phosphate synthase FK: fructokinase Hình 1.3. Con đường chuyển hoá cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter Quá trình sinh tống hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzym, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà. Theo tác giả Alina Krystynowicz và cộng sự cho rằng có 4 enzym tham CELLULOSE gia xúc tác tổng hợp cellulose ở chủng vi khuẩn Gluconacetobacter: es UDPGlc(GK), Phosphoglucomutase Glucose Glucokinase (PGM), Glucose - 1- phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP),Cellulose synthase (CS). Trong đó UGP là enzym có vai trò quan trọng nhất [31]. 1.4. 1.4.1. ứng dụng của màng BC ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực Màng BC có nhiều lợi điếm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề dày của vi sợi dưới lOOnm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh học, tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng. Màng BC có các ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực 1.4.1.1. Thực phâm Sản pham cellulose được sử dụng trong nước ép trái cây và những thức uống khác, trong mứt kẹo, trong kem, yaourt, salad, thức ăn tráng miệng có tác dụng như chất làm đặc, vật liệu on định dịch huyền phù, vật liệu làm vỏ bọc thực phẩm. Các sản phẩm ứng dụng cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực thực phấm: Món tráng miệng (thạch dừa, kem ít calori, thức ăn nhanh, kẹo), chất nhũ hóa trong nước ép trái cây và những thức uống khác, màng bao thực phẩm... 1.4.1.2. Yhọc Màng trị bỏng: màng cellulose vi khuẩn Gluconacetơbacter tẩm dầu mù u có tác dụng tương tự màng sinh học trị bỏng Màng băng vết thương, điều trị tổn thương da, trong ghép mô, cơ quan nội tạng. Tác nhân vận chuyến thuốc (qua đường miệng và da): dựa vào đặc tính trương nở của bột BC người ta ứng dụng làm tác nhân vận chuyển thuốc, làm tá dược tự rã, dùng huyền phù BC để ổn định các tá dược dạng nước, làm cho chúng không bị tách pha khi bảo quản lâu ngày. Da nhân tạo: Ớ Brazil, màng BC ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường như một loại da nhân tạo dùng để đắp vết thương. 1.4.1.3. Mỹ phâm BC vừa có khả năng giữ ẩm cao mà không bám lại lên làn da sau khi rửa và cũng không gây các tác dụng phụ như các chất giữ ẩm khác, do đó được ứng dụng: Kem dưỡng da, chất làm nền cho móng nhân tạo, chất tăng độ dày và bền cho nước làm bóng móng tay. 1.4.2. ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày. Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh. Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận khoảng hơn 400 ca bỏng. Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi. Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng... Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc biệt quan trọng. Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng làm giảm đau ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuấn, tạo điều kiện tốt cho quá trình tái tạo phục hồi. Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm khuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịch trong cơ thế (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức hoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biếu mô hóa hình thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật. 1.5. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới. 1.5.1. Trên thế giới Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter và những ứng dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1999 [16] dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown, Jonas và Farad, dùng màng như là một chất đế biến đối độ nhớt, đế làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown đã dùng BC làm vải đặc biệt, Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự (2006) Sirlene M.Costa, dùng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất đế cố định protein hay cho sắc kí. Đặc biệt, trong y học, người ta đã chế tạo các phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan hoặc cellulose và polyvinyl, các phức chất này được sử dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu điều trị các bệnh tim mạch. Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong phẫu thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng chế tạo màn hình điện tử, vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phẩm phụ gia, làm cơ chất để cố định protein hay cho sắc kí .... Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng hình thành cellulose. Nghiên cứu chế tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn. Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs, (2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền về làm màng BC từ Acetobacter xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [24]. 1.5.2. Ở Việt Nam Ở Việt Nam những nghiên cứu về Gỉuconacetobacter và màng BC là khá mới mẻ. Hầu như có rất ít các nghiên cứu, công bố liên quan đến Gluconacetobacter,Acetobacter, sự hình thành BC và ứng dụng màng BC còn rất khiêm tốn. Năm 1997 có công trình của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Mùi nghiên cứu môi trường nước giá đỗ thay thế nước dừa trong sản xuất thạch dừa từ vi khuấn Acetobacter xylinum. Năm 1995- 2000 các công trình nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter và khả năng lên men sinh acid acetic của nhóm tác giả Lê Văn Nhương, Nguyễn Thị Ngọt, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Văn Cách. Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình sinh acid acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ đế cố định tế bào vi khuẩn [ 8], [9]. Năm 2000 nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hương, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuẩn Acetobacter xylinum ứng dụng vào làm thạch dừa. Năm2003 có nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thuý Hường và Phạm Thành Hổ về chọn lọc dòng Acetobacter xylinum thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn. Năm 2006 nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan và cộng sự về màng BC từ Acetobacter xylinum tẩm dầu mù u dùng trong điều trị bỏng [5], [9]. Năm 2008, có nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung đã chọn được 1 chủng vi khuẩn Acetobacter xylỉnum NHỊ [4], khảo sát khả năng tạo tạo màng của chủng này. Ngoài nguồn nguyên liệu nước hoa quả dùng cho lên men giấm, còn có thế sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu khác như các loại bia, rượu nhạt, các nguyên liệu có chứa đường, tinh bột, acid hữu cơ, giàu vitamin... từ các vùng miền khác nhau ở Việt Nam [5]. Việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng Gluconacetobacter ngày càng được nhiều tác giả quan tâm. Ngày càng có nhiều các nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng A. xylỉnum sự hình thành màng BC và các hướng ứng dụng màng BC. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh - Ký Sinh, Trường đại học Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng phương pháp lên men. Màng BC có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da, chính vì vậy dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu [5]. Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu nhận màng BC từ vi khuấn A. xylinum, ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng. Công tác điều trị bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu thuật, hoặc dùng một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitossan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng [12]. Theo tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, màng trị bỏng sinh học BC với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuấn đều có nguồn gốc thiên nhiên. Vì thế, nó không chứa các yếu tố nguy cơ như không có độc tố trực tiếp, không gây dị ứng, không có yếu tố lây lan mầm bệnh, không giải phóng chất lạ vào vết thương. Màng có khả năng diệt 100% vi khuẩn thường gây ra các nhiễm trùng vết thương hở da như vết bong... Chỉ cần áp sát màng vào vết thương và không cần sử dụng bất cứ thứ gì khác, màng đã có khả năng cản khuẩn, đồng thời làm lành vết thương [9]. CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1. Vật liệu 2.1. /. Nguồn giống Nhận vi khuấn Gluconacetobacter thuần chủng từ phòng thí nghiệm vi sinh học trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2. 2.1.2. Thiết bị và hóa chất 2.1.2.1. Hoả chất Nguồn cacbon: glucose (CèH^Oó), acid acetic. Nguồn nitơ: cao thịt, cao nấm men, pepton, (NH 4) 2SƠ 4 Nguồn muối khoáng: NaCl, MgSƠ 4. 7H 20, KH 2PO 4 Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol... Phenol lỏng 5%, H 2S0 4đặc. Nước dừa già Dung dịch Becberin clorid 0,1% (Thành phẩm được cung cấp từ Viện bỏng quốc gia). 2.1.2.2. Thiết bị * Tại phòng Công nghệ sinh - Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và phòng thí nghiệm Vi sinh, tổ Thực Vật- Vi sinh, khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức) Nồi hấp Tommy (Nhật) Box vô trùng (Haraeus) Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh) Máy li tâm Sorvall (Mỹ) Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5|il - lOml Máy so màu uv - vis (Nhật) Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ) Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ) Máy cất nước 2 lần (Hamilton - Anh) Kính hiến vi quang học Carl Zeiss (Đức) Bộ điện di - AE - 4650 (Nhật) Máy PCR (Applied biosystems, Mỹ) Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn...và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác. 2.1.3. Môi trường 2.1.3.1. Môi trường giữ giống (MT1) : 20(g) (NH 4 ) 2 S04 Glucose : 3(g) Thạch agar: 20(g) KH 2PO 4: 2(g) Peptone: 5(g) Nước máy: 1000 ml MgS0 .7H 20: 2(g) 2. ỉ.3.2. Môi trường nhân giông (MT2) 4Glucose : 20(g) Axit acetic : 2% MgS0 4.7H 20: 2(g) Nước dừa :1000ml 2.1.3.3. Môi trường lên men(MT3) (NH 4) 2S0 4 : 3(g) PH : 5,0-6,0 KH 2PO 4: 2(g) Acid acetic : Glucose : 20(g) (NH 4) 2S0 4 : 3(g) KH 2PO 4 : 2(g) pH : MgS0 4.7H 2 0 : 2(g) 5,0-6,0 Nước gạo : Axit acetic : 2% 1000 ml 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter bằng phương pháp nhuộm Gram Vi khuấn Gluconacetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thế phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép). Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter đem nhuộm tiêu bản theo phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần. Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram âm với vi khuẩn Gram dương. Neu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gram âm. Ngược lại nếu tế bào bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương. Khả năng bắt màu của vi khuẩm Gram âm và Gram dương khác nhau là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuấn Gram dương được cấu tạo từ một loại protein đặc biết chứa muối nucleatmagie có khả năng tạo màu tím với gentian và lugol tạo ra một phức chất bền, khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiếu bản thấv tế bào vi khuấn Gram dương bắt màu tím của gentian trong khi đó những vi khuấn Gram âm không có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugol nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Do đó, khi nhỏ fucshin lên tế bào vi khuấn Gram âm bắt màu hồng - màu của fucshin. 2.2.2. Phương pháp hoạt hoá giống Gluconacetobacter Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống “làm thức tỉnh giống”, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121°c trong 20 phút. Sau đó đem sử lý trong đèn tím 15 phút để khử khuẩn, sau đó cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ. 2.2.3. Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110°c trong 20 phút để tránh phân dã đường. Sau đó khử ở đèn cực tím trong 15 phút. Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách bố xung vào môi trường lên men 5% giống đã hoạt hoá. Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh trong 1-7 ngày. 2.2.4. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng Các chủng giống sau khi nhận từ phòng vi sinh sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCƠ 3), nuôi trong tủ ấm 3-4 ngày ở 30°c. Sau đó giữ giống trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần. 2.2.5. Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ s/v đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter 2.2.5.1. Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ s/v đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng Gluconacetobacter s : diện tích bề mặt dịch lên men tạo màng BC (cm 2 ) V: thể tích dịch lên men tạo màng (cm 3 ) Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể tích dịch lên men để tìm tỷ lệ s/v thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng Gluconacetobacter, chúng tôi tiến hành theo các bước sau: Bước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC. Quy đối thế tích từ đơn vị ml sang đơn vị cm 3 . Sau đó tính tỷ lệ s/v. Dụng cụ lên men tạo màng là khay nhựa hình chữ nhật có đường kính là 15x10x4 cm từ đó ta tính được diện tích bề mặt len men tạo màng BC là s= 15x10= 150 (cm 2 ) Thể tích dịch lên men được đo bằng ml nhưng để tính được tỷ lệ s/v thì ta phải quy đổi ml sang cm 3 . Ta đã biết lml = 1 cra 3 . Ta có bảng sau: Bảng 2.1. Tính quy đối s/v thí nghỉệm nghiên cửu s (cm 2 ) V (ml = cm 3 ) s/v (em' 1 ) 150 150 1,0 150 167 0,9 150 187.5 0,8 150 215 0,7 150 250 0,6 150 300 0,5 Bước 2: Tiến hành lên men bề mặt tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ dày, độ dai, khối lượng tươi, khối lượng khô để tìm tỷ lệ s/v thích hợp tạo màng BC tốt nhất. 2.2.5.2. Phương pháp xác định dai(độ bền cơ học) của màng BC Độ chịu kéo (độ dai): Lực kéo lớn nhất mà mẫu thử chịu được trước khi đứt trongđiều kiện xác định của phương pháp thử tiêu chuẩn. Độ bền kéo (độ dai) có thế được hiếu như là khi một lực kéo tác động tăng dần đến khi vật liệu dạng sợi hay trụ bị đứt. Ở giá trị lực kéo giới hạn cho sự đứt của vật liệu được ghi lại được ký hiệu ak. Độ bền kéo giới hạn cho sự đứt của vật liệu trong các lĩnh vực như thiết kế chế tạo máy, xây dựng, khoa học vật liệu. Đế xác định độ dai của màng tôi đã tiến hành đo độ dai bằng cách: Cố định đầu trước của màng Tiếp đến lấy lực kế lò xo cố định vào đầu sau Kéo màng xem tối đa màng đó có độ bền kéo đạt được bao nhiêu N. 2.2.5.3. Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter theo các tiêu chí: khả năng xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, khối lượng tươi, khối lượng khô từ đó tìm thời gian thích hợp tạo màng BC tốt nhất. 2.2.5.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu nhiệt độ từ 20-40°C đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gỉuconacetobacter theo các tiêu chí: khả năng và thời gian xuất hiện màng BC từ chủng Gỉuconacetobacter, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, khối lượng tươi, khối lượng khô từ đó tìm nhiệt độ thích hợp nhất cho khả năng tạo màng BC. 2.2.6. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong cuốn “ứng dụng tin học trong sinh học” và “Thống kê và ứng dụng” như: *số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần 1^ *Trung bình bình phương các sai lệch 5= Z(X,-X)2 Ĩ=Ị *Sai số diện của trung bình cộng ±m = —r= yỊn *Hệ số biến thiên trung bình cộng: CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lên men tạo màng BC từ chủng vi khuấn Gluconacetobacter 3.1.1. Đặc điểm hình thái và tế bào của vi khuẩn Gluconacetobacter Chủng vi khuấn Gluconacetobacter được phân lập từ nguồn nguyên liệu bia Hà Nội, tại phòng thí nghiệm khoa Sinh- KTNN, trường đại học sư phạm Hà Nội 2. Quan sát tế bào vi khuấn Gluconacetobacter dưới kính hiến vi quang học (olympus CX41, Nhật) ở độ phóng đại 1000 lần, cho tôi xác định được vi khuấn Gluconacetobacter có dạng hình que thẳng hay hơi cong, có thể đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, không sinh bào tử, là vi khuẩn Gram âm. Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của vi khuấn Gluconacetobacter Hình 3.2. Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng 3.1.2. Vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước nhỏ, đường kính khuẩn lạc đạt từ tròn, bề mặt nhày, trơn bóng. Hình 3.3. Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trường thạch đĩa 3.1.3. Kiểm tra hoạt tính catalase của chủng Gluconacetobacter Khi nhỏ H 2O 2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí, chứng tỏ có khí O 2 giải phóng ra, chứng tỏ vi khuấn Gluconacetobacter có khả năng sinh enzyme catalaza. 3.1.4. Kiểm tra khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường CaCƠ 3 điều này chứng tỏ có sự xuất hiện của axit gliconic: H + + CaCOs ->• Ca 2+ + H 2 0 + CO 2 3.1.5. Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Dựa theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, TS. Dương Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacer được tiến hành theo 4 bước cơ bản như sau: Bước l:Nhân giống ị Bước 2: Hoạt hóa ị Bước 3: Lên màng ị Bước 4: Thu màng Cụ thể tôi thực hiện các bước lên màng như sau: Bước 1: Nhân giống Quy trình nhân giống được tiến hành cấy truyền liên tục chủng Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng. Bước 2: Hoạt hóa Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối vi khuấn từ các ống giống Gluconacetobacter nuôi trong bình chứa dịch nhân giống cấp 1 theo tỷ lệ 1 ống giống 250ml dung dịch. Sau đó lắc các bình nhân giống cấp 1 trong khoảng thời gian 24h để thu sinh khối vi khuẩn Gluconacetobacter. Sau thời gian 24 giờ lắc, các bình giống vi khuấn Gỉuconacetobacter có màu trắng đục có hệ sợi trắng lơ lửng trong dung dịch, đó là các soi cellulose mà vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trưởng. Bước 3: Tạo màng môi trường lên men Tiến hành lên men tĩnh trong 4-7 ngày. Dùng micropipette cấy dịch nhân giống cấp 1 vào môi trường lên men theo tỷ lệ 10ml dịch giống/ 100ml. Bước 4: Thu màng Dùng cồn 90° bảo quản màng, dùng găng tay cao su vớt màng trong hộp lên men, tiến hành kiếm tra đặc tính của màng. Như vậy, đã lên men tạo màng BC ổn định cho chủng Gluconacetobacter. 3.1.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Nuôi cấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter dịch thế, ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ trong môi trường trong điều kiện nuôi cấy tĩnh có biến đổi của thời gian nuôi cấy tương ứng từ 1 -7 ngày. Khảo sát khả năng xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, khối lượng tươi, khối lượng khô. Ket quả được thể hiện ở bảng 3.1, hình 3.5; hình 3.6. Bảng 3.1. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter gian 1 2 3 4 5 6 7 hiện - - + + + + + sắc,độ - - - - Màng trắng trong, nhẵn 1,0 Màng trắng trong, nhẵn 2,0 Màng trắng trong, nhẵn 2,5 Màng trắng trong, nhẵn 3,0 Màng trắng trong, nhẵn 3,3 Độ dai (độ bền kéo) (N) - 6 12 15 19 16 Khối lượng tươi (g) - 6,16 10,08 14,8 21,09 23,36 Khối lượng khô (g) - 0,25 0,35 0,44 0,51 0,49 Thời (ngày) Xuất màng Màu nhẵn Độ dày (mm) Chú thích : + Có - Không Khối lượng màng (g) 1+ 1 2 3 4 5 6 7 Thòi gian 2 5 2 0 Hình 3.5. Mối quan hệ giữa thời gian với khối lượng màng Độ bền kéo màng 20 18 16 14 12 10 1 5 1 2 3 4 5 6 7 Thòi gian Hình 3.6. Mối quan hệ giữa thời gian với độ bền kéo màng Nhận xét Qua bảng 3.1 và hai hình 3.5 và 3.6, thấy: Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng dần theo thời gian lên men kế từ khi xuất hiện màng. ơ các thời gian nuôi cấy tương ứng là 1; 2 ngày không thấy hiện màng. ơ các thời gian nuôi cấy là 3,4, 5, 6, 7 ngày đã xuất hiện màng, màng trắng trong, nhẵn mịn. ơ các thời gian nuôi cấy tương ứng là 3, 4, 5 ngày đã xuất hiện màng màng trắng trong, nhẵn mịn, nhưng so với thời gian nuôi cấy 6 ngày thì độ bền kéo kém hơn, màng mỏng hơn, các khối lượng tươi và khối lượng khô thấp hơn. Ở thời gian nuôi cấy ngày màng trong, cấy 6 trắng nhẵn mịn nhất, độ bền kéo cao nhất, khối lượng khô cao nhất, sản lượng cellulose tốt nhất. Điều đó chứng tỏ ở thời gian nuôi cấy này độ kết tinh của màng đã đạt trạng thái tốt nhất. Ở thời gian nuôi cấy 7 ngày màng trắng trong, nhẵn mịn, khối lượng tươi càng tăng lên cao nhất, dày nhất nhưng so với thời gian nuôi cấy 6 ngày thì độ bền kéo kém hơn, khối lượng khô thấp hơn. Bắt đầu màng có dấu hiệu chìm xuống trong môi trường lên men và khả năng sản xuất giảm. màng BC Ket quả trên được giải thích là độ dai (độ bền kéo) của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng. Vì nếu thu sớm hoá độ và polymer kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính chất cơ học của màng BC. Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh dưỡng màng chìm xuống vi khuấn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng cungcấp cho hoạt động sống của tế bào làm cho khả năng sản xuất màng BC bắt đều giảm. Theo David Holmes, hàm lượng glucose trong môi trường giảm nhất sau 150 giờ lên men, tác giả cho rằng sau 6 ngày lên men, nguồn cung cacbon ban đầu giảm và vi khuẩn bắt đầu sử dụng axit gluconic và 5 keto acid gluconic trong quá trình trao đổi chất. Sau thời gian 6 ngày độ kết tinh của màng đạt trạng thái tốt nhất. Hình 3.7. Màng BC ngày thứ 4 Hình 3.8. Màng tươi sau 5 ngày nuôi cấy Như yậy, thu nhận màng sau 6 ngày lên men là tốt nhất. 3.1.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC của chúng Gluconacetobacter Nuôi cấy chủng vi khuấn Gluconacetobacter trong môi trường dịch thể, với tỷ lệ trong điều kiện nuôi cấy tĩnh có biến đổi của nhiệt độ nuôi cấy tương ứng từ 20; 25; 30; 35; 40. Khảo sát khả năng và thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, khối lượng tươi, khối lượng khô sau 6 ngày lên men. Ket quả được thể hiện ở bảng 3.2, hình 3.10 và hình 3.11 Bảng 3.2. Ánh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC chủng Gluconacetobacter Nhiệt độ (°C) 20 25 30 35 40 Khả năng và thời gian xuất hiện màng (ngày) 5 3 3 3 - Màu sắc,độ nhẵn Màu trắng Màu trắng Màu trắng Màu trắng trong, nhẵn trong, nhẵn trong, nhẵn trong, nhẵn - Độ dày (mm) 1 2,5 3,0 2,0 - Độ dai (độ bên kéo) (N) Khôi lượng tươi (g) Khôi lượng khô (g) 10 14 18 15 - 8,67 16,47 19,8 21 - 0,12 0,35 0,51 0,30 - Chú thích: - : Không hình thành màng Khối lượng màng 25 -1----------------------------------------------- 20 25 30 35 40 Nhiệt độ Hình 3.10. Thế hiện mối quan hệ giữa nhiệt độ với khối lượng màng Nhiệt độ 20 1 2 0 2 5 1 5 1 0 3 0 3 5 4 0 Đ ộ b ề n k é o c ủ a m à n g ( N ) H ì n h 3 . 1 1 . T h ế h i ệ n m ố i q u a n h ệ v ớ i đ ộ k é o m à n g Nhậ n xét Qua bảng 3.2, hai hình 3.10 và 3.11 trên tôi nhận thấy + Ở nhiệt độ nuôi cấy 30°c màng trắng trong, nhẵn mịn nhất, độ bền kéo cao nhất, các khối lượng tươi và khối lượng khô cao nhất, dày nhất, thời gian hình thành màng nhanh. Điều đó chứng tỏ ở tỷ lệ này độ kết tinh của màng đã đạt trạng thái tốt nhất. + Ở các nhiệt độ nuôi cấy nuôi cấy tương ứng 20°c, 25°c, 35°c màng trắng trong, nhẵn nhưng mịn so với nhiệt độ nuôi cấy 30°c thì độ bền kéo kém hơn, màng mỏng hơn, các khối lượng tươi và khối lượng khô thấp hơn. Điều đó tỏ ở các tỷ lệ này độ kết tinh của màng không đạt trạng thái tốt nhất +Ở nhiệt độ nuôi cấy 40°c không thấy xuất hiện màng Ket quả trên được giải thích là do chủng vi khuẩn Gluconace tobacter là vi khuẩn ưa ấm (ưa nhiệt), ở nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm. Tuy nhiên nếu ở nhiệt độ cao quá sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào sẽ đó đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm, thậm chí không có khả năng tạo màng. N hư vậy, nhiệt độ 30°c là tốt nhất cho chủng Glucona cetobacte r lên men tạo màng 3.2. Án h hưởng của tỷ ỉệ s/v tới khả năng tạo màng của vi khuấn Glucona cetobacte r 3.2.1. An h hưởng của tỷ lệ s/v đến thời gian, khối lượng màng T ác giả Nguyễn Duy Khanh (2011) đưa ra các tỷ lệ tương ứng là s/v= 0,5; s/v= 0,6; s/v= 0,7; s/v= 0,8; s/v= 0,9; s/v= 1,0. Dựa theo kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Duy Khanh với quy mô phòng thí nghiệm Vi sinhtrường ĐHSP Hà Nội 2 tôi tiến hành khảo sát theo các tỷ lệ s/v nhằm tìm ra tỷ lệ s/v phù hợp nhất cho quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Glucona cetobact er. S : diện tích bề mặt dịch lên men tạo màng BC (cm 2 ) V : thể tích dịch lên men tạo màng (cm 3 ) V ới phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể tích dịch lên men để tìm tỷ lệ s/v thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng Glucona cetobact er , chúng tôi tiến hành theo các bước sau: B ước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC. Quy đối thế tích từ đơn vị ml sang đơn vị cm 3 . Sau đó tính tỷ lệ s/v. D ụng cụ lên men tạo màng là khay nhựa hình chữ nhật có đường kính là 15x10x4 cm từ đó ta tính được diện tích bề mặt len men tạo màng BC là s = 15x10 = 150(cm2) T hể tích dịch lên men được đo bằng ml nhưng để tính được tỷ lệ s/v thì ta phải quy đổi ml sang cm 3 . đã Ta biết lml= lcm3. có Ta bảng sau: Bảng 3.3. Tính quy đổi s/v thí nghiệm nghiên cứu s (cm2) V (ml = cm 3 ) s/v (em' 1 ) 150 150 1,0 150 167 0,9 150 0,8 150 187.5 215 150 250 0,6 150 300 0,5 N uôi cấy chủng vi 0,7 khuẩn Gluco naceto bacter trong môi trường dịch thế ở nhiệt độ phòng với điều kiện nuôi cấy tĩnh có biến đối của tỷ lệ s/v tương ứng 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0. Bảng 3.4. Khảo sát tỷ lệ s/v với thời gian xuất hiện màng Tỷ lệ s/v (em' 1 ) 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Thời gian xuất hiện màng 4 4 4 3 3 3 K ết luận: Từ bảng 3.4 ta nhận thấy tỷ lệ s/v = 0,8; s/v= 0,9; s/v= 1,0 thời gian xuất hiện màng là sớm nhất là 3 ngày B ước 2: Sau 6 ngày thu màng BC, kiểm tra theo các tiêu chí: màu sắc, độ nhẵn, độ dày, khối lượng màng tươi, khối lượng khô của màng. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5; hình 3.10 và hình 3.11 Bảng 3.5. Khảo sát tỷ lệ s/v đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng Glucon acetoba cter Đặc điểm màng Tỷ lệ s/v Màu sắc, độ nhẵn Độ dày Khối lượng Khối lượng khô (g) (mm) tươi (g) 0,5 Trắng đục, sần sùi 0,5 4,46 0,1 Trắng đục, sần sùi 1,5 8,54 0,14 Trắng đục, sần sùi 1,9 9,49 0,15 0,8 Màu trắng, trong nhẵn 3,00 21,09 0,51 0,9 Màu trắng, trong nhẵn 2,5 17,7 0,35 1,0 Màu trắng, trong nhẵn 2,00 15,53 0,30 0,6 0,7 khối lượng màng (g) 25 -Ị------------------------------------------------------- 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 TỷlệS/V Hìn h 3.12. Mối quan hệ giữa s/v với khối lượng màng Sa u 6 ngày thu màng ta nhận thấy tỷ lệ s/v = 0,8 có đặc tính màng tốt Màng nhất. có màu trắng, trong nhẵn; độ dày; khối lượng tươi và khối lượng khô cao nhất, hơn hẳn các tỷ lệ s/v khác. Vậ y tìm ra được tỷ lệ s/v = 0,8 có đặc tính màng tốt nhất cho quá trình lên men tạo màng BC chủng Gluconac etobacter. 3.2.2. Ảnh hư ỏu g CI UÌ tỷ lệ s/v đế n độ chị u ké o (độ dai ) củ a mà ng Độ chịu kéo (độ dai): Lực kéo lớn nhất mà mẫu thử chịu được trước khi đứt trong điều kiện xác định của phương pháp thử tiêu chuẩn. Đe xác định độ dai của màng tôi đã tiến hành đo độ dai bằng cách: Cố định đầu trước của màng Tiếp đến lấy lực kế lò xo cố định vào đầu sau Kéo màng xem tối đa màng đó có độ bền kéo đạt được bao nhiêu N. Bảng 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ s/v đến độ dai của màng Tỷ lệ s/v 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Độ dai (độ bền kéo) 7 10 14 19 15 11 Độ bền kéo của màng (N) 20 1 8 1 6 1 Ш 0. Hình 3.13. Mối quan hệ giữa s/v với độ bền kéo màng 0. 0 0 0 Tỷ lệ Qua bảng 3.6 ta có thế nhận thay tỷ lệ s/v= 0,8 độ dai của màng là lớn nhất. Hơn hẳn với các tỷ lệ s/v= 0,5; s/v= 0,6; s/v= 0,7; s/v= 1, 9; s/v =ỉ т Hình 3.14. Hình ảnh ảnh hưởng của tỷ lệ s/v tới khả năng tạo màng BC Từ bảng 3.6 và hình 3.13 và 3.14 trên tôi thấy + Với các tỷ lệ s/v tương ứng 0,5; 0,6; 0,7 màng hình thành chậm, trắng đục, sần sùi, màng rất mỏng, độ bền kéo thấp, các khối lượng tươi và khối lượng khô thấp hơn. Điều đó chứng tỏ ở các tỷ lệ này độ kết tinh của màng không cao, màng dễ bị rách và khả năng chịu lực kém. + Với các tỷ lệ s/v tương ứng là 0,9; 1,0 màng trắng trong, nhẵn mịn, hình thành màng nhanh nhưng so với tỷ lệ s/v= 0,8 thì độ bền kéo kém hơn, màng mỏng hơn, các khối lượng tươi và khối lượng khô thấp \ hơn. Điều đó chứng tỏ ở các tỷ lệ này độ kết tinh của màng không đạt trạng thái tốt nhất. + Với tỷ lệ s/v= 0,8 màng trắng trong, nhẵn mịn nhất, độ bền kéo cao nhất, các khối lượng tươi và khối lượng khô cao nhất, dày nhất, thời gian hình thành màng nhanh. Điều đó chứng tỏ ở tỷ lệ này độ kết tinh của màng đã đạt trạng thái tốt nhất. Như vậy, khả năng hình thành màng tốt nhất ở tỷ lệ s/v= 0,8. KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 1. Kết luận Chủng vi khuấn Gluconacetobacter có khả năng lên men tạo màng 1.1. BC. 1.2. Nghiên cứu tìm được tỷ lệ diện tích dịch lên men trên thế tích chủng Gluconacetobacter tạo màng BC tốt nhất là s/v= 0,8. 2. Kiến nghị Đẻ sản phẩm có thể ứng dụng vào thực tiễn tôi đề nghị: 2.1. Tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng khi lên men tạo màng BC ở nhiệt độ 30°c, với tỷ lệ s/v= 0,8 thời gian thu nhận màng là 6 ngày. 2.2. Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy khác đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất với khả năng tạo màng BC. т TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] . Nguyễn Lân Dũng (1976). Một số phương pháp nghiên cứu vỉ sinh vật học, tập 1 - 2 - 3 , Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội. [2] . Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào (2011). Thực hành vi sinh vật. Nxb Đại học Sư Phạm Hà Nội. [3] . Đặng Thị Hồng, Đinh Thị Kim Nhung.(2007). Tuyển chọn chủng Acetobacter xylinum tạo màng sinh học (BC). Những vấn để nghiên cứu cơ bản trong khoa học và sự sổng. Hội nghị khoa học cơ bản toàn quốc lần 5 tại Qui Nhơn 2007, trang 728-731. [4] . Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh.(2006). Nghiên cứu các đặc tỉnh màng cellulose vỉ khuắn từ Acetobacter xylỉnum sử dụng làm màng trịbỏng. Tạp chí dược học, số 5, năm 2006. [5] . Lô Thị Bảo Khánh, Đào Thị Nữ, Phạm Thị Quyên, Hoàng Thị Thảo, Đinh Thị Kim Nhung. (2008).Afg7néfl cứu một sổ đặc tính sinh học chủng Acetobacter xylinum G6, chế tạo màng BC. Kỷ yếu Hội nghị Sinh viên nghiên cứu khoa học Các trường ĐHSP toàn quốc lần thứ IV, năm 2008. Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường ĐHSP- Đại học Huế, Nxb Đại học Huế, trang 224-230. [6] . Lô Thị Bảo Khánh, Đinh Thị Kim Nhung, Dương Minh Lam.( 2011). Nghiên cứu xử ỉỷ và bảo quản màng Bacterỉal cellulose (BC) từ chủng vi khuân Acetobacter xyỉỉnum BHN2. Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 4 về sinh thái và tài nguyên sinh vật. Hà Nội, ngày 21/10/2011, trang 1181-1184. [7] . Lô Thị Bảo Khánh,(2011 )Nghỉên cứu xử lý và bảo quản màng Bacterial Cellulose từ chủng vi khuân Acetobacter xylỉnum BHN 2. Luận văn Thạc sỹ sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội. [8] . Lê Năm, Lâm Thị Đan Chi, Chu Anh Tuấn, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2010). Tác dụng điều trị tại chỗ vết thương bỏng nông của màng Acetul. Tạp chí Y học thảm họa và bỏng, số 4, 2010, trang 77-137. [9] . Nguyễn Thị Nguyệt, (2008) Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylỉnum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da. Luận văn Thạc sỹ sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội. [10] . Nguyễn Thị Nguyệt, Đinh Thị Kim Nhung. (2008). Nghiên cứu Acetobacter xylỉnum cho màng Bacterial cellulose (BC) làm mặt nạ dưỡngda. Tạp chí Khoa học, số 4, Đại học Sư phạm Hà Nội 2, trang 127138. [11] . Nguyễn Thị Nhung, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Khắc Thanh. (2004). Một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylỉnum. Hội nghị Khoa học cơ bản toàn quốc lần 3 tại Thái Nguyên 2004, trang 556-559. [12] . Bergey. H, John. G. Holt.( 1992) Bergey’s manual of dererminativa bacteriology. Wolters kluwer health, p.71- 84. [13] . Brown R.M. (1999), Cellulose structure and biosynthesis, Pure Appl. Chem. (5), p. 765-775. [14] . Brown R.M., Cousins S.K., Krystyna Kudlicka (1992), “Gravity effects on cellulose assembly”, American journal of botany 70 (11), pp. 1247 1258. [15] . Brown R.M., Willison J.H., Richardson C.L. (1976), “Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum: Visualization of the site of synthesis and direct measurement of the in vivo process”, Proceedings of the National Academy of Science, Vol. 73, pp. 4565 — 4569. [...]... chủng Gluconacetobacter s : diện tích bề mặt dịch lên men tạo màng BC (cm 2 ) V: thể tích dịch lên men tạo màng (cm 3 ) Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể tích dịch lên men để tìm tỷ lệ s/v thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng Gluconacetobacter, chúng tôi tiến hành theo các bước sau: Bước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC Quy đối thế tích. .. từ đó tìm thời gian thích hợp tạo màng BC tốt nhất 2.2.5.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu nhiệt độ từ 20-40°C đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gỉuconacetobacter theo các tiêu chí: khả năng và thời gian xuất hiện màng BC từ chủng Gỉuconacetobacter,... giống/ 100ml Bước 4: Thu màng Dùng cồn 90° bảo quản màng, dùng găng tay cao su vớt màng trong hộp lên men, tiến hành kiếm tra đặc tính của màng Như vậy, đã lên men tạo màng BC ổn định cho chủng Gluconacetobacter 3.1.6 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Nuôi cấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter dịch thế, ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ trong môi trường... giống trên môi trường thạch nghiêng Các chủng giống sau khi nhận từ phòng vi sinh sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCƠ 3), nuôi trong tủ ấm 3-4 ngày ở 30°c Sau đó giữ giống trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần 2.2.5 Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ s/v đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter 2.2.5.1 Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ s/v đến khả năng tạo màng BC. .. sau Kéo màng xem tối đa màng đó có độ bền kéo đạt được bao nhiêu N 2.2.5.3 Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter theo các tiêu chí: khả năng xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai,... cứu quá trình sinh acid acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ đế cố định tế bào vi khuẩn [ 8], [9] Năm 2000 nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hương, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuẩn Acetobacter xylinum ứng dụng... gluconic Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường CaCƠ 3 điều này chứng tỏ có sự xuất hiện của axit gliconic: H + + CaCOs ->• Ca 2+ + H 2 0 + CO 2 3.1.5 Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Dựa theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, TS Dương Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacer được tiến... đơn vị cm 3 Sau đó tính tỷ lệ s/v Dụng cụ lên men tạo màng là khay nhựa hình chữ nhật có đường kính là 15x10x4 cm từ đó ta tính được diện tích bề mặt len men tạo màng BC là s= 15x10= 150 (cm 2 ) Thể tích dịch lên men được đo bằng ml nhưng để tính được tỷ lệ s/v thì ta phải quy đổi ml sang cm 3 Ta đã biết lml = 1 cra 3 Ta có bảng sau: Bảng 2.1 Tính quy đối s/v thí nghỉệm nghiên cửu s (cm 2 ) V (ml... 1000 lần, cho tôi xác định được vi khuấn Gluconacetobacter có dạng hình que thẳng hay hơi cong, có thể đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, không sinh bào tử, là vi khuẩn Gram âm Hình 3.1 Kết quả nhuộm Gram của vi khuấn Gluconacetobacter Hình 3.2 Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng 3.1.2 Vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa Khuẩn lạc của Gluconacetobacter. .. phút để khử khuẩn, sau đó cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ 2.2.3 Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110°c trong 20 phút để tránh phân dã đường Sau đó khử ở đèn cực tím trong 15 phút Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách bố xung vào môi trường lên men 5% giống