... suất mía, từ cải thiện kinh tế cho người dân Do đó, đề tài: Phân lập, nhận diện nấm mốc gây bệnh thối đỏ mía tỉnh Hậu Giang đề nhằm tạo nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu sâu nấm mốc gây bệnh. .. 12 3.4.2 Phân lập nấm mốc 13 3.4.3 Nhận diện nấm phương pháp truyền thống 13 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Kết phân lập nấm mốc từ mẫu mía bị thối đỏ tỉnh Hậu Gian... bệnh thối đỏ mía góp phần đáp ứng yêu cầu nêu 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập dòng nấm mốc gây bệnh thối đỏ mía 1.3 Mục đích đề tài Làm nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu sâu nấm mốc gây bệnh thối
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM MỐC GÂY BỆNH THỐI
ĐỎ TRÊN CÂY MÍA Ở TỈNH HẬU GIANG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:
MSSV: 3103991 LỚP : VSVH K36
Cần Thơ, Tháng 12/2013
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:
MSSV: 3103991 LỚP : VSVH K36
Cần Thơ, Tháng 12/2013
Trang 3CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
………
………
………
………
………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Trang 4LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học đã nhận được rất nhiều sự đóng góp quý báu từ phía cán bộ hướng dẫn, Ban Giám Đốc viện, bạn bè và sự quan tâm ủng hộ của gia đình
Trước tiên tôi chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu nâng cao trình độ trong những năm qua
Xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên đã hết lòng dìu dắt, dạy dỗ và nâng
đỡ trong suốt thời gian học đại học Cảm ơn cô đã chỉ dẫn và đồng hành từ đầu quá trình thực hiện đến khi luận văn được hoàn thành một cách tốt đẹp
Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện NC & PT Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện về trang thiết bị, máy móc, dụng cụ và hỗ trợ đắc lực trong quá trình thực hiện luận văn, cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai và cô Nguyễn Thị Pha phòng Công Nghệ Gen Thực Vật đã nhiệt tình chỉ bảo trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm
Tất cả các bạn lớp Vi sinh vật học khóa 36 và người bạn thân nhất của tôi đã luôn bên cạnh động viên, cổ vũ và giúp tôi trong suốt quá trình học và nhất là khoảng thời gian làm luận văn
Bên cạnh đó, gián tiếp tạo nên thành công của luận văn là sự động viên, cổ vũ của gia đình Xin cảm ơn cha, mẹ và em gái đã chia sẻ và tiếp thêm sức mạnh cho tôi trong những lúc khó khăn và mệt mỏi nhất
Một lần nữa xin gửi lời tri ân đến tất cả mọi người, những người đã yêu thương, quan tâm và hết lòng giúp đỡ tôi trong hơn ba năm tôi học tập tại trường
Trang 5TÓM LƯỢC
Bệnh thối đỏ trên mía do nấm Colletotrichum falcatum gây ra Trong phạm vi nghiên cứu này: Từ 120 mẫu lá mía bị bệnh thối đỏ được thu tại bốn địa điểm khác nhau thuộc huyện Phụng Hiệp, Thị xã Ngã Bảy, huyện Long Mỹ và Thành phố Vị Thanh của tỉnh Hậu Giang; đã phân lập được 25 dòng nấm thuần chủng Đa số khuẩn lạc có màu trắng đục ở ngoài và vàng nhạt từ tâm ra, dạng nhung mượt hoặc len xốp,
độ nổi mô hoặc lài, bìa nguyên hoặc gợn sóng (chiếm 40%) và trắng xen tím nhạt, dạng len xốp, độ nổi phẳng hoặc lài, bìa nguyên hoặc chia thùy (chiếm 48%) Các dòng còn lại khuẩn lạc có màu trắng, dạng bột mịn hoặc len xốp, độ nổi phẳng, bìa nguyên (chiếm 4%); vàng nâu, dạng bột mịn, độ nổi phẳng, bìa nguyên (chiếm 8%)
Từ khóa: Bệnh thối đỏ,Colletotrichum falcatum, Hậu Giang
Trang 6ii
MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
TỪ VIẾT TẮT vi
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
1.3 Mục đích đề tài 2
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Sơ lược về cây mía (Saccharum) 3
2.1.1 Nguồn gốc phân loại 3
2.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh học của cây mía 3
2.2 Tỉnh Hậu Giang-vùng trồng mía trọng điểm 4
2.2.1 Giới thiệu chung về Hậu Giang 4
2.2.2 Tình hình trồng mía ở Hậu Giang 5
2.3 Bệnh thối đỏ trên cây mía 5
2.3.1 Triệu chứng bệnh 6
2.3.2 Đặc điểm phát sinh bệnh 6
2.3.3 Tác nhân gây bệnh 6
2.4 Nấm mốc Colletotrichum falcatum 7
2.4.1 Vị trí phân loại 7
Trang 72.4.2 Đặc điểm hình thái – sinh lý 7
2.5 Phương pháp phân lập nấm mốc 8
2.5.1 Các dụng cụ cấy 8
2.5.2 Các thao tác vô trùng 8
2.5.3 Phương pháp dùng kim nhọn 9
2.5.4 Phương pháp cấy đơn bào tử 9
CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1 Thời gian 11
3.2 Địa điểm 11
3.3 Phương tiện 11
3.3.1 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm nuôi cấy 11
3.3.2 Vật liệu thí nghiệm 12
3.3.3 Hóa chất 12
3.4 Phương pháp 12
3.4.1 Thu mẫu và xử lý mẫu 12
3.4.2 Phân lập nấm mốc 13
3.4.3 Nhận diện nấm bằng phương pháp truyền thống 13
CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
4.1 Kết quả phân lập nấm mốc từ các mẫu lá mía bị thối đỏ ở tỉnh Hậu Gian 17
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC
Phụ lục 1 Thành phần và nồng độ các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Phụ lục 2 Môi trường nuôi cấy
Trang 8iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1 Thuốc nhuộm Cotton blue 21
Bảng 2 Thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine 22
Bảng 3 Dung dịch cố định mẫu Acid lactic 22
Bảng 4 Đặc điểm khuẩn lạc của 25 dòng nấm mốc được phân lập 19
Bảng 5 Đặc điểm khuẩn ty và bào tử của 25 dòng nấm mốc được phân lập 24
Trang 9DANH MỤC HÌNH
Hình 1 Ruộng mía 3
Hình 2 Bản đồ hành chính tỉnh Hậu Giang 4
Hình 3 Bệnh thối đỏ trên lá mía 5
Hình 4 Nấm Colletotrichum falcatum 7
Hình 5 Đặc điểm của một số khuẩn lạc nấm mốc phân lập được 18
Hình 6 Một số hình dạng bào tử của nấm mốc dưới độ phóng đại 1000 lần 23
Hình 7 Hình dạng bào tử của nấm Colletotrichum sp đối chứng chụp dưới độ phóng đại 1000 lần 27
Trang 11CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay, mía được biết đến là cây trồng đóng vai trò rất quan trọng trong đời sống xã hội
Trong công nghiệp mía được sử dụng để lấy đường Đường là một loại thực phẩm cần có trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của nhiều quốc gia trên thế giới, cũng như
là loại nguyên liệu quan trọng của nhiều ngành sản xuất công nghiệp nhẹ và hàng tiêu dùng như bánh kẹo Ngoài sản phẩm chính là đường những phụ phẩm của cây mía cũng mang đến nhiều lợi ích như: Ngọn lá mía phơi khô có bổ sung urê được dùng làm thức ăn cho gia súc, bã mía có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm ra Furfural là nguyên liệu cho ngành sợi tổng hợp, mật rỉ dùng làm để sản xuất cồn 96o, sản xuất nhựa xêrin làm sơn, xi đánh giầy, phân bón Thêm vào đó, mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt bởi vì mía đến mùa mưa, bộ lá mía giao nhau thành thảm lá xanh dày, diện tích lá gấp 4-5 lần diện tích đất làm cho mưa không thể rơi trực tiếp xuống mặt đất có tác dụng tránh xói mòn đất cho các vùng đồi trung du Hơn nữa mía là cây rễ chum và phát triển mạnh trong tầng đất từ 0-60cm Một ha mía tốt có thể có 13-15 tấn rễ, sau khi thu hoạch bộ rễ để lại trong đất cùng với bộ lá là chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất Tuy nhiên, bên cạnh sự phát triển mạnh của ngành trồng mía thì tình hình dịch bệnh trên mía cũng bắt đầu xuất hiện nhiều và ngày một gia tăng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của cây mía Trong đó phổ biến nhất là bệnh thối đỏ
trên mía do nấm Colletotrichum falcatum gây ra gây hại trên thân, phiến lá, bẹ lá, mầm
non và cả rễ cây Đây là một trong những loại bệnh hại nguy hiểm trên cây mía, đặc biệt là ở những chân ruộng đất trũng, ẩm thấp, khó thoát nước, không khí nóng ẩm, mưa nhiều tạo ẩm độ không khí cao… Cây bị bệnh lá ngọn thường chuyển mầu vàng héo, nếu bị hại nặng, toàn cây có thể bị khô chết, mía gốc sẽ tái sinh kém Bệnh không những làm giảm năng suất mía cây mà còn làm giảm hàm lượng đường của cây mía nguyên liệu rất nhiều, do đường đã chuyển hóa thành rượu Ngoài ra, mía nguyên liệu
bị bệnh làm cho nước ép dơ, gây khó khăn cho quá trình lắng lọc, chế biến Nguồn bệnh tồn tại trong thân, lá, hom giống… của cây mía bị bệnh, trong đất ruộng Hiện nay, vẫn chưa có các biện pháp phòng trừ đặc hiệu loại nấm này, các biện pháp phòng
Trang 12Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
trừ chủ yếu là sử dụng thuốc hóa học Song, việc sử dụng các chất hóa học lại gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và làm hao tốn nhiều chi phí
Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải tìm ra phương pháp phòng trị bệnh hiệu quả, thân thiện với môi trường và ít tốn kém nhằm nâng cao năng suất mía, từ đó cải thiện kinh
tế cho người dân Do đó, đề tài: “Phân lập, nhận diện nấm mốc gây bệnh thối đỏ
trên cây mía ở tỉnh Hậu Giang” được đề ra nhằm tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho
những nghiên cứu sâu hơn về nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía góp phần đáp ứng những yêu cầu nêu trên
1.2 Mục tiêu đề tài
Phân lập các dòng nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía
1.3 Mục đích đề tài
Làm nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm mốc gây
bệnh thối đỏ trên cây mía
Trang 13CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cây mía (Saccharum)
2.1.1 Nguồn gốc phân loại
Theo phân loại khoa học hiện nay Mía được xếp vào:
Giới
Bộ
Họ Phân họ Tông Chi
: : : : : :
Plantae Poales Poaceae Panicoideae Andropogoneae
Trang 14Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
ở phần gốc (vừa để nuôi dưỡng cây vừa để dự trữ) Đồng thời, do sự bốc hơi nước của
lá mía, nên phần ngọn cây lúc nào cũng phải được cung cấp nước đầy đủ để cung cấp cho lá, gây ra hàm lượng nước trong tỉ lệ đường/nước phần ngọn sẽ nhiều hơn phần
gốc, làm cho ngọn cây mía nhạt hơn
2.2 Tỉnh Hậu Giang-vùng trồng mía trọng điểm
2.2.1 Giới thiệu chung về Hậu Giang
Hậu Giang là một tỉnh ở ĐBSCL Hậu Giang là tỉnh ở trung tâm châu thổ sông MêKông, thành phố Vị Thanh là trung tâm hành chính của tỉnh cách Thành phố Hồ Chí Minh 240 km về phía tây nam, cách thành phố Cần Thơ 60 km theo Quốc lộ 61 và chỉ cách 40 km theo đường nối Vị Thanh – thành phố Cần Thơ Hậu Giang là tỉnh thuộc khu vực nội địa của ĐBSCL Trước năm 1945, Hậu Giang là tên gọi của sông Hậu Vùng đất thuộc tỉnh Hậu Giang ngày nay nằm rải rác ở nhiều tỉnh khác nhau Sau 30 tháng 04 năm 1975, tỉnh Hậu Giang được thành lập trên cơ sở sáp nhập hai tỉnh Phong Dinh và Ba Xuyên thời Việt Nam Cộng Hoà Cuối năm 1991 tỉnh Hậu Giang được chia thành Cần Thơ và Sóc Trăng Ngày 26 tháng 11 năm 2003, tỉnh Cần Thơ được chia thành thành phố Cần Thơ trực thuộc Trung ương và tỉnh Hậu Giang ngày nay
Hình 2 Bản đồ hành chính tỉnh Hậu Giang
(*Nguồn: http://my.opera.com/HUYNHTUMAI/blog/t-nh-h-u-giang, 12/07/2013)
Trang 152.2.2 Tình hình trồng mía ở Hậu Giang
Hậu Giang là tỉnh có diện tích trồng mía lớn nhất ĐBSCL hiện nay Ở Hậu Giang mía là cây trồng đã được nông dân canh tác từ lâu đời Tuy nhiên, trước đây diện tích
và năng suất mía không ổn định do chưa được đầu tư đúng mức và đầu ra bấp bênh
Từ năm 2003 đến nay, được sự quan tâm đầu tư cơ sở hạ tầng, chuyển giao khoa học
kỹ thuật, đầu tư lao động, thâm canh của nông dân, cùng với sự phối hợp của các doanh nghiệp mía đường nên diện tích mía của tỉnh đã tăng mạnh, lên đến 13.000-15.000 ha/năm
Năng suất và chất lượng mía cũng được nâng cao (có nhiều hộ đạt năng suất 200 tấn/ha), duy trì sản lượng hàng năm trên 1 triệu tấn mía cây Trong niên vụ mía 2010-
2011, diện tích mía của tỉnh là 13.063 ha, năng suất bình quân 82,6 tấn/ha, sản lượng gần 1,1 triệu tấn Trong đó, tập trung nhiều nhất là ở huyện Phụng Hiệp và thị xã Ngã Bảy với tổng diện tích lên đến 9.600 ha, chiếm trên 73% diện tích trồng mía của tỉnh Còn lại trồng rải rác ở huyện Long Mỹ, Vị Thủy và thành phố Vị Thanh
Theo tính toán của các hộ trồng mía, chi phí bình quân sản xuất mía niên vụ 2010-2011 ở mức từ 600-700 đồng/kg Niên vụ 2011-2012, diện tích mía của Hậu Giang tăng thêm 650 ha, nâng tổng diện tích toàn tỉnh lên 13.747 ha, dự kiến năng suất đạt từ 85-95 tấn/ha, sản lượng 1,2-1,3 triệu tấn Các giống mía được nông dân trồng chủ yếu trong niên vụ này là ROC 16, ROC 18, ROC 13, ROC 11, ROC 22, QĐ 13,
QĐ 11, QĐ 16, Suphanburi 7, K94- 2483, QĐ 11, QĐ 13, DLM 24, VD 86 - 368…
(*Nguồn: http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/2/2/84627/Cay-mia-Hau-Giang.aspx, 30/07/2013)
2.3 Bệnh thối đỏ trên cây mía
Hình 3 Bệnh thối đỏ trên lá mía
(*Nguồn: http://vtc16.vn/news/55/5206/Phat-hien-va-phong-tru-benh-thoi-do-hai-mia, 13/07/2013)
Trang 16Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
2.3.1 Triệu chứng bệnh
Bệnh thối đỏ có thể gây hại ở nhiều bộ phận của cây mía, từ thân lóng, phiến lá,
bẹ lá cho đến mầm non và cả rễ của cây Tuy nhiên, bệnh thường gây hại nhiều nhất là trong thân cây, phiến lá và bẹ lá của cây mía vào giai đoạn cây mía đã vươn lóng cao Cây bị bệnh lá ngọn thường vàng héo, nếu bị nặng toàn cây chết khô Trên phiến lá: Bệnh thường xuất hiện ở gân chính trong lòng máng sống lá Lúc đầu vết bệnh chỉ
là những chấm nhỏ màu hồng Sau đó phát triển dần lên phía trên và xuống phía dưới của sống lá thành những vệt dài hình bầu dục (đôi khi chỉ là những vệt dài khoảng 5-7cm) có màu đỏ huyết, giữa vết bệnh có màu nhạt hơn, quanh rìa có màu đỏ nâu Trên vết bệnh cũng có những hạt đen nhỏ, đó là các ổ bào tử của nấm Mô bị bệnh dễ bị nứt
vỡ, nát ra, làm cho lá dễ bị gẫy gập xuống tại vị trí bị nứt vỡ (Vũ Triệu Mân, 2007)
2.3.2 Đặc điểm phát sinh bệnh
Bệnh thối đỏ mía phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm cao, mưa nhiều, trời nóng ẩm Tuy nhiên, trong điều kiện nhiệt độ thấp 15-20°C mía sinh trưởng chậm, sức chống bệnh yếu thì nấm vẫn gây hại
Loại nấm gây bệnh thối đỏ sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ 27-32°C, pH 5-6 Khi nhiệt độ quá thấp (dưới 10°C) hoặc quá cao (trên 37°C) nấm sinh trưởng kém
Nấm xâm nhiễm dễ dàng qua vết thương xây xát, do đó mức độ bệnh còn liên quan tới mức độ sâu đục thân mía phá hại Nếu sâu đục thân hại mía càng nhiều thì bệnh càng nặng Mặt khác, mưa gió nhiều, nơi cất trữ mía không thoát nước cũng thúc đẩy sự phát sinh phát triển của bệnh
Mức độ phát sinh gây hại của nấm bệnh có liên quan chặt chẽ với cấu tạo hình thái, sinh lý của từng giống mía Các giống mía vỏ xanh thường bị bệnh nhiều hơn giống mía vỏ vàng Thực tế sản xuất cho thấy, Giống Roc.10 và 2714 POJ bị bệnh nặng Giống 2883 POJ, 2678 POJ, F 103 bị bệnh nhẹ hơn Các giống mía có hàm lượng phenol cao cũng có khả năng chống chịu bệnh cao hơn (Vũ Triệu Mân, 2007)
2.3.3 Tác nhân gây bệnh
Bệnh thối đỏ, do nấm Colletotrichum falcatum gây ra Nấm được phân lập vào
năm 1892 trên một ruộng mía ở Tjomal, Java, Indonesia bởi Went Sau đó von Arx và
Trang 17Müller (1954) phát hiện ra giai đoạn sinh sản hữu tính của Colletotrichum falcatum và
đặt tên là Glomerella tucumanensis (Hyde et al., 2009)
2.4 Nấm mốc Colletotrichum falcatum
2.4.1 Vị trí phân loại
Ngành Lớp
Bộ
Họ Chi
: : : : :
Deuteromycotina Hypomycetes Moniliales Tuberculariaceae
không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào Nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm Khi già sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng
Trang 18Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Colletotrichum nội sinh chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát
triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm nhiều lớp chất nền Bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào Bào tử có dạng liềm, cong, bào tử trong suốt có vách ngăn Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ cứng (Cao Ngọc Điệp, 2010)
2.5 Phương pháp phân lập nấm mốc
Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu Không có một quy luật chung nào dùng cho phân lập vi sinh vật Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh vật mà ta cần Suy nghĩ một cách sáng tạo cho công việc và thành thạo với các kỹ thuật phân lập mới là yêu cầu chung của bất kỳ một nhà vi sinh vật nào
Các nhà nấm học Nhật Bản thường dùng các phương pháp sau để phân lập nấm sợi: Sử dụng kim nhọn nhặt bào tử; Phân lập bào tử đơn độc;
2.5.1 Các dụng cụ cấy
Que cấy móc: que cấy có đầu vuông góc, thường dùng để cấy khuẩn ty nấm
Kim mũi mác: có đầu nhọn như mũi giáo dùng để cắt miếng khuẩn lạc nấm
2.5.2 Các thao tác vô trùng
Thao tác cấy được thực hiện trong một không gian vô trùng tạo bởi ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn Bunsen Ngọn lửa đèn cồn, đèn Bunsen có tác dụng oxy hóa không khí tạo không gian vô trùng, đồng thời còn được dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ, ống nghiệm khi mở, đóng, nút bông, nắp nhựa,…
Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, trong các thao tác, nhân viên cần mang găng tay hoặc tiến hành sát trùng tay bằng cồn 70% hoặc các dung dịch diệt khuẩn Tương tự như vậy tiến hành sát trùng mặt bàn thao tác trước khi bắt đầu thao tác vô trùng Sau khi hoàn tất việc cấy chủng, tiến hành sát trùng tay, mặt bàn làm việc tương tự như trên trước khi rời phòng kiểm nghiệm
Trang 19Nhiều loài nấm hoại sinh và vi khuẩn thường phát triển thứ sinh trên mô cây bị bệnh Vì vậy, phải hết sức cẩn thận tránh phân lập các vi sinh vật thứ sinh bằng các phương pháp khử trừng Tiệt trùng bề mặt các mô cây bệnh có thể giúp loại trừ các vi sinh vật hoại sinh thường phát triển trên bề mặt mô bệnh
Chọn lá có vết bệnh mới phát triển vì nấm thường đang phát triển mạnh ở các mô
lá này Cẩn thận dùng kéo hoặc dao cắt mẫu lá thành từng mẩu nhỏ tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong dung dịch natri hypochlorite 10% khoảng 1 – 3 phút rồi rửa qua bằng nước vô trùng Dùng kẹp đã khử trùng đặt miếng mẫu lên môi trường agar
2.5.3 Phương pháp dùng kim nhọn
Sử dụng phương pháp này để phân lập tất cả mọi loại nấm phát triển trên bất kỳ một cơ chất nào
Cách làm:
1) Đặt cơ chất cần phân lập (lá, cành cây mục, ) lên kính hiển vi vật kính X10 (độ
phóng đại 10 lần) hoặc lên kính lúp
2) Chỉnh tiêu cự để quan sát được bào tử, cuống sinh bào tử từ cơ chất
3) Khử trùng que nhọn bằng ngọn lửa đèn cồn
4) Đưa que nhọn vào khoảng giữa vật kính và cơ chất, nhặt bào tử chuyển sang
môi trường phân lập
5) Nuôi cấy bào tử ở nhiệt độ 25o C, quan sát sự nảy mầm của bào tử hàng ngày
đến khi hình thành khuẩn lạc thì chuyển sang môi trường thạch nghiêng
2.5.4 Phương pháp cấy đơn bào tử
Cấy đơn bào tử là quá trình cấy truyền một bào tử đã nảy mầm để tạo một mẫu nấm thuần Phương pháp này thích hợp cho việc làm thuần những chi nấm tạo bào tử
trên môi trường nhân tạo, như Fusarium, Colletotrichum, Alternaria, Stemphylium, Bipolaris, Verticillium và Phoma
Trang 20Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Quy trình cấy đơn bào tử:
1 Khử trùng que cấy
2 Tạo dung dịch bào tử bằng cách dùng que cấy lấy một lượng nhỏ sợi nấm trên
mặt thạch có lẫn bào tử hoặc lấy một chút bào tử từ khối bào tử lớn của nấm rồi cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng
3 Lắc ống nghiệm để phân tán các bào tử và kiểm tra mật độ bào tử bằng cách
quan sát ống nghiệm trước ánh sáng hoặc kiểm tra một giọt dịch bào tử dưới kính lúp soi nổi Tránh tạo dịch bào tử với mật độ bào tử quá cao Bằng kinh nghiệm, mật độ bào tử có thể được đánh giá bằng mắt thường khi nhìn ống nghiệm
4 Làm loãng với nước vô trùng nếu cần
5 Đổ dịch bào tử vào một đĩa Petri có chứa một lớp mỏng môi trường thạch
nước cất
6 Đổ dịch bào tử thừa từ đĩa Petri đi Một số bào tử sẽ nằm lại trên mặt thạch
7 Để đĩa Petri trong khoảng 18 giờ cho đến khi bào tử nảy mầm
8 Kiểm tra đĩa Petri dưới kính lúp soi nổi với nguồn sáng phía dưới (Điều chỉnh
nguồn sáng cẩn thận để có sự tương phản tốt giữa thạch, bào tử, và các ống mầm.)
9 Dùng kim mũi mác cắt lấy ra một bào tử nảy mầm và chuyển sang một đĩa môi
trường mới
(Nguồn: Cẩm nang chuẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam, 2009)
Trang 21CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tủ cấy vô trùng Esco
Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức)
Máy ly tâm Eppendorf