Báo cáo: Phân lập và nhận dạng nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư cà phê ở Việt Nam dựa trên đặc điểm hình thái học và phương pháp phân tử docx

PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG NẤM Colletotrichum GÂY BỆNH THÁN THƯ CÀ PHÊ Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI HỌC VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ Nguyn Thanh Hà, Hoàng Th Ngát, Nguyn Thu Hà, Lê Th Ánh Hng và Phm Xuân Hi Summary Isolation and identification of Colletotrichum caused anthracnose disease on coffee in Vietnam based on morphological and molecular characters The genus Colletotrichum consists of 900 species and is responsible for anthracnose on number of crops. To determine which species of Colletotrichum are present in Vietnamese coffee plantation, a total of 55 Colletotrichum isolates were isolated from 111 anthracnose disease samples on leaves, twigs and berries at coffee plantation of Ba Vi and Buon Me Thuot. Twenty eight isolates from coffee berry diseases were selected for identification based on morphological characters and PCR amplification of a region in the mitochondrial small subunit (mtSSU) using NMS1/NMS2 primers. Basing on morphological and physiological studies, we classified these isolates into three groups named group 1, group 2 and group 3 corresponding to C. gloeosporioides, C. acutatum and possible C. capsici respectively. In combining with molecular analysis, we reconfirmed with group 1 and group 2 but not with group 3. The group 3 with falcate conidia was found on coffee plantation of Ba Vi. However, it was unable to identify by NMS1/NMS2 primers. Since, different techniques supposed to be address to identify these isolates. Keywords: Anthracnose, Colletotrichum, Coffee berry, PCR, Identification. I. T VN  Chi Colletotrichum bao gm hơn 900 loài, có ph ký ch rng, là nguyên nhân gây bnh thán thư trên nhiu loài cây trng khác nhau. Tuy nhiên, hin nay trên th gii ch phân lp ưc 3 loài: Colletotrichum kahawae, C. gloeosporioides và C. acutatum t các mu bnh cà phê. Loài nm C. kahawae ch ưc phát hin  châu Phi; có mc  gây bnh rt mnh  các giai on ca cây t lúc ra hoa n khi qu chín, gây khô cành t ngn xung, qu khô và rng hàng lot nên thưng gi là bnh khô cành khô qu. Thit hi v năng sut do nm C. kahawae có nơi, có lúc lên n 80% [7]. Ti Vit Nam hin nay bnh thán thư ã có mt  tt c các vùng trng cà phê trên c nưc. T l bnh ti mt s a im trng cà phê  Tây Nguyên bin ng t 7,02% - 13,57% năm 1996 và tăng lên 10,25% - 19,82% năm 1997 [4]. Nguyên nhân gây bnh thán thư  cà phê Vit Nam cho n nay ưc xác nh là do các loài nm C. gloeosporioides, C. acutatum và C. capsici gây ra [1]. Do tính a dng v c im hình thái gia các chng nm Colletotrichum rt cao nên vic phân loi nm Colletotrichum da trên c im sinh lý và hình thái hc vn gp nhiu hn ch. Trong nghiên cu này, chúng tôi kt hp các c im hình thái và k thut sinh hc phân t  nhn dng s có mt ca các loài nm Colletotrichum trên cà phê  Ba Vì và Buôn Mê Thut, làm cơ s cho các nghiên cu a dng di truyn và hưng ti các bin pháp phòng tr hiu qu nm Colletotrichum gây bnh thán thư trên cà phê Vit Nam. II. VT LIU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 1. Vật liệu nghiên cứu - Mu bnh: 111 mu bnh thán thư trên thân, lá và qu ưc thu thp t năm 2006 n năm 2007. Trong s mu thu thp, 90 mu bnh thu t 8 tiu vùng trng cà phê ti hai xã Sơn à và Tn Lĩnh thuc Trung tâm Nghiên cu Cà phê chè Ba Vì và 21 mu bnh còn li thu ti Tri Cà phê thuc Vin KHKT Nông Lâm Tây Nguyên. - Mu i chng: Isolate C. gloeosporioides PR220 phân lp t Olea Europaea (M) và isolate C. acutatum 397 phân lp t Fragaria x Ananssa (M). 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Phân lập các mẫu nấm Colletotrichum Mu bnh ưc ra dưi vòi nưc chy cho trôi ht t và cht bNn. Sau ó mu ưc kh trùng bng NaOCl 1% trong 5 phút, tráng bng cn 70%, ra bng nưc ct 3 ln và thm khô bng giy thm. Ct mu cy vi kích thưc 0,5 - 0,7 mm ti mép vùng b bnh (bao gm c vùng bnh và vùng không bnh) và t mu cy lên ĩa môi trưng PDA có cha kháng sinh Streptomycin (100 g/ml) (10 mu cy/ĩa).   nhit  22 0 C ± 2. Sau khi nm mc, tách si nm chuyn sang môi trưng PDA. To chng thun bng phương pháp cy bào t ơn. 2.2. hận dạng nấm + Da trên c im hình thái hc: Màu sc khuNn lc, hình thái bào t ưc mô t sau 7 ngày cy trên môi trưng PDA. + Kích thưc bào t: 25 bào t ưc o chiu dài và chiu rng bng kính hin vi in t Leica vi  phóng i 40 x 16 ln. T l chiu dài/chiu rng ưc tính và ưc phân nhóm  thun li cho mc ích so sánh da theo tiêu chuNn ca Sander [6]. 2.3. Tốc độ phát triển của nấm T các mu nm 7 ngày tui, ct mu cy vi kích thưc ng u nhau ưng kính 5 mm, t trên môi trưng PDA   nhit  25 0 C. Mi isolate nhc li 3 ln. o ưng kính phát trin ca khuNn lc hàng ngày trong 5 ngày. 2.4. Tách chiết AD tổng số Sau khi chng nm nuôi cy t 7 ngày tui, tách lp màng nm và khi bào t, nuôi cy lc (220 v/p) trong 100 ml môi trưng lng theo Sreenivasaprasad [9]  nhit  27 0 C  trong 3 ngày. Chúng tôi thu sinh khi và tin hành tách chit ADN ca nm da trên phương pháp ca J.L. Cenis (1992) [5]. 2.5. Phản ứng PCR đặc hiệu S dng cp mi NMS1 (CAGCAGT GAGGAATATTGGTCAATG)/NMS2 (GC GGATCATCGAATTAAATAACAT)  nhân on ADN c hiu vùng tiu ti th (mtSSU) cho mi loài nm Colletotrichum [2,10]. Các chng nm Colletotrichum ưc nhn dng bng phn ng PCR vi vic s dng cp mi NMS1/NMS2 và si khuôn là ADN tng s ca các chng nm. Phn ng PCR ưc thc hin trong hn hp phn ng th tích 25 l cha 1 l ADN ca nm (20 - 30 ng), 2,5 l dung môi phn ng 10X, 0,2 mM dNTP, 2 mM MgCl 2 , 1 mM ca mi primer, 1U Taq polymerase (Promeaga). Chương trình chy phn ng PCR: ưc bt u  95 0 C trong 3 phút; 35 chu kỳ, mi chu kỳ ưc thit lp như sau: 95 0 C trong 1’, 50 0 C trong 1,15’, 72 0 C trong 2’ và cui cùng ti 72 0 C trong 10’. Sn phNm PCR ưc tách trên bn gen 1% agarose trong dung dch TBE 1X. Sau khi in di, gen ưc nhum vi ethidium bromide và quan sát dưi èn UV. III. KT QU VÀ THO LUN 1. Phân lập nấm Qua iu tra kho sát, bnh thán thư xut hin ch yu trên qu cà phê, tuy cũng có mt  các b phn khác ca cây như lá và cành vi tn s thp hơn. Trên lá vt bnh là nhng m khô cháy, màu nâu hoc nâu tái, vi nhng qung ng tâm. Vt bnh trên qu và cành là nhng m rng có màu nâu, nâu en, lõm và khô (hình 1). Hình 1. Triệu chứng bệnh thán thư trên quả và lá cà phê Kt qu phân lp các chng nm gây bnh thán thư trên cà phê  Ba Vì và Buôn Mê Thut ưc th hin  bng 1. Bảng 1. Các isolate Colletotrichum được phân lập tại Ba Vì và Buôn Mê Thuột Địa điểm Mẫu bệnh thu thập Số lượng isolate nấm phân lập được Quả Cành Lá Tổng số Ba Vì 90 35 5 10 50 Buôn Mê Thuột 21 2 0 3 5 Thit hi do bnh thán thư gây ra ch yu t các mu bnh trên qu. Vì vy chúng tôi chn các isolate phân lp t qu  phc v cho các nghiên cu tip theo. 2. hận dạng nấm 2.1. hận dạng nấm dựa vào đặc điểm hình thái học Các isolate Colletotrichum nghiên cu có c im hình thái và sinh lý rt a dng. im d phân bit nht là c im bào t ca các isolate ưc chia thành 3 nhóm vi hình thái khác nhau. Nhóm 1 bao gm 26 isolate có bào t hình tr thng, hai u tròn, hoc nhn mt u; nhóm 2 gm 01 isolate có bào t hình thuôn mnh, nhn hai u (isolate BMTQ18) và nhóm 3 là isolate vi bào t có hình lưi lim (isolate BV8.80b) (hình 2). Hình 2. Hình thái bào tử nấm Colletotrichum: (a) hóm 1; (b) hóm 2; (c) hóm 3 Kích thưc bào t cũng là mt ch tiêu quan trng  phân loi các chng nm Colletotrichum. Kích thưc bào t rt a dng dao ng t 12,38 - 25,26 x 3,53 - 7,46 (m), a b c nhưng phn ln các isolate Colletotrichum vi hình thái bào t thuc nhóm 1 có kích thưc thuc nhóm 6 (32,14%), các isolate còn li ri rác rơi vào nhóm 2 n nhóm 9. Trong khi các isolate Colletotrichum có hình thái bào t thuc nhóm 2 (BMTQ18) và thuc nhóm 3 (BV8.80b) u có t l chiu dài/chiu rng thuc nhóm 10. Kt qu kích thưc bào t các isolate Colletotrichum phân lp ưc tng kt  hình 3. Hình 3. Phân nhóm bào tử nấm của các isolate Colletotrichum theo nguyên tắc của Sanger Da vào hình thái và kích thưc bào t, chúng tôi phân loi 26 isolate thuc nhóm 1 là loài C. gloeosporioides và isolate nhóm 2 (BMTQ18) là loài C. acutatum. Theo Olga [11], C. acutatum có bào t ngn và mnh hơn bào t ca loài C. gloeosporioides. Nhng kt qu nghiên cu bnh thán thư trên cà phê Arabica ca Kenny [7] cũng cho thy rng, các loài C. gloeosporioides có bào t hình tr, tròn hai u hoc nhn mt u, còn loài C. acutatum có bào t hình thoi. Chúng tôi nhn thy các c im hình thái khuNn lc không th hin s liên quan n hình thái bào t. Ví d, các isolate có hình thái bào t thuc nhóm 1, khuNn lc rt a dng t màu sc khuNn lc (trng bông, trng bNn, trng xám, xám, ), n dng si nm (bông xp, chc mn ) và mép khuNn lc phát trin u hoc không u (hình 4).  nhit  25 0 C, các isolate Colletotrichum phân lp ưc có tc  phát trin dao ng t 4,45 mm/ngày n 7,13 mm/ngày. Trong khi hu ht các isolate bào t dng 1 có tc  phát trin khuNn lc ln hơn 5,5 mm/ngày thì isolate có bào t thuc dng 2 và dng 3 (BV8.80b) có tc  phát trin < 5 mm/ngày, tương ng là 4,45 ± 0,52 mm/ngày và 4,72 ± 0,00 mm/ngày (hình 5). Theo nghiên cu ca Olga [11] và Kenny [7] thì loài C. acutatum có tc  phát trin ca khuNn lc < 5 mm/ngày, còn C. gloeosporioides có tc  phát trin khuNn lc > 5 mm/ngày. Nhóm tỷ lệ chiều dài/chiều rộng Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4 Nhóm 5 Nhóm 6 Nhóm 7 Nhóm 8 Nhóm 9 Nhóm 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Số lượng bào tử Hình 4. M ột số dạng h ình thái khu n lạc của nấm Colletotrichum: (a) BMTQ18; (b) BV6.49; (c) BV6.50; (d) BV4.24 (4); (e) BV1.6; (f) BV3.20 (1) Hình 5. So sánh t ốc độ phát triển của khun lạc tại nhiệt độ 25 0 C 2.2. hận dạng nấm dựa vào phản ứng PCR Kt qu chy PCR cho thy tt c các phn ng PCR s dng si khuôn là các ADN tng s isolate Colletotrichum u cho sn phNm PCR là các băng ADN c hiu có chiu dài trùng vi chiu dài ca C. gloeosporioides i chng (750 bpp), tr isolate BMTQ18 có sn phNm PCR là các băng ADN c hiu có chiu dài trùng vi chiu dài ca isolate C. acutatum i chng (650 bp) (hình 6). Kt hp kt qu nghiên cu nhn dng nm Colletotrichum qua các ch tiêu hình thái và phương pháp phân t thông qua phn ng PCR s dng cp mi N MS1/N MS2 cho phép chúng tôi kt lun các isolate có bào t thuc nhóm 1 là loài C. gloeosporioides và isolate có bào t thuc nhóm 2 là loài C. acutatum. S dng cp mi N MS1/N MS2 có th nhn dng ưc 2 loài C. gloeosporioides và C. acutatum gây hi trên cà phê. Hình 6. Kết quả nhận dạng nấm Colletotrichum gây hại trên cà phê Việt am thông qua phản ứng PCR sử dụng cặp mồi MS1/MS2 và AD tổng số của các chủng nấm Colletotrichum. (1) và (17): Marker; (2) đối chứng C. acutatum; (3) đối chứng C. gloeosporioides; (4 - 12, 15 - 16) isolate từ Ba vì; (13 - 14) isolate BMTQ18, BMTQ10 50 0bpp 750bpp 50 0bpp 75 0bpp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6 Riêng isolate có bào t thuc nhóm 3 (BV8.80b) không nhn dng ưc bng cp mi NMS1/NMS2 vì có kích thưc băng DNA trùng vi kích thưc băng ca isolate C. gloeosporioides. Tuy nhiên, nhng c im hình thái hc ca isolate BV8.80b tương t vi nhng c im hình thái hc ca loài C. capsici [8]. Mc dù trên th gii, loài này chưa ưc công b liên quan n bnh thán thư cà phê, nhưng ti Vit Nam, TS. Trn Kim Loang ã phân lp ưc loài này trên cà phê ti Tây Nguyên năm 1998 [3]. Có th gii thích mt nguyên nhân ca iu này là cà phê ưc trng xen cnh nhng cây ch ca nm C. capsici. ây ang là vn  s ưc quan tâm trong các nghiên cu tip theo ca chúng tôi. IV. KT LUN T 111 mu cà phê b bnh thán thư thu thp ưc ti Ba Vì và Buôn Mê Thut, chúng tôi ã phân lp ưc 55 isolate Colletotrichum, trong ó chim phn ln t qu cà phê (37 isolate). Các isolate phân lp t qu cà phê bnh ưc chúng tôi s dng cho các nghiên cu nhn dng n cp  loài. Bng s kt hp các c im hình thái hc, sinh lý hc cùng vi kt qu ca phương pháp PCR chúng tôi ã phân loi ưc 26 isolate thuc v loài C. gloeosporioides, mt isolate t Buôn Mê Thut là loài C. acutatum, mt isolate thuc vùng Ba Vì ưc gi thit là loài C. capsici. Trong tương lai, chúng tôi s tip tc nghiên cu sâu hơn v isolate này. Thêm na, chúng tôi còn phi tin hành ánh giá c tính ca các isolate nm phân lp ưc qua vic lây nhim trên cây con. TÀI LIU THAM KHO 1 guyễn Thị Hằng Phương, Lê Thị Ánh Hồng, Jamshid Fatehi và Olga Vinnere, 2003. Phân loi mt s loài thuc chi Colletotrichum thu thp t Vit Nam và Thái Lan. Hi ngh công ngh sinh hc toàn quc 2003. 358 - 363. 2 Trần Kim Loang và cộng sự, 1998. Kt qu nghiên cu bnh khô cành, khô qu trên cà phê chè catimor. Tp chí Khoa hc, Công ngh và Qun lý kinh t s 6, 253 - 255. 3 Gina M. Sander và Korsten. L., 2003). A comparative morphological study of South African avocado and mango isolates of Colletotrichum gloeosporioides. Can. J. Bot. 81, 877 - 885. 4 Kenny, M. K., Galea, V.J., Scott, P.T. và Price, T.V, 2006. A comparison of Colletotrichum species associated with berry diseases of Coffea arabica L. Pest and disease incursions: Risks, threats and management in Papua New Guinea. Canberra, ACIAR Technical Reports No.62, 192 - 199. 5 Sreenivasaprasad, S.; Averil E. Brown và Mills, P.R., 1993. Coffee berry disease pathogen in Africa: Genetic structure and relationship to the group species Colletotrichum gloeosporioides. Myco. Res 97(8): 995 - 1000. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 7 gười phản biện: guyễn Văn Viết . PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG NẤM Colletotrichum GÂY BỆNH THÁN THƯ CÀ PHÊ Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI HỌC VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ Nguyn. lõm và khô (hình 1). Hình 1. Triệu chứng bệnh thán thư trên quả và lá cà phê Kt qu phân lp các chng nm gây bnh thán thư trên cà phê  Ba Vì và