tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy bacillus sp. sv1 sinh protease kiềm tính

Kết quả tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy nhằm mục đích tăng sản lượng protease kiềm tính ngoại bào của dòng vi khuẩn này cho thấy với lượng vi khuẩn chủng vào môi trường là 1ml vi khuẩn

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY

BACILLUS sp SV1 SINH PROTEASE

KIỀM TÍNH

MSSV: 3092561 LỚP: CNSHTT K35

Cần Thơ, Tháng 12/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

TRƯỞNG BỘ MÔN

(ký tên)

Để hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp, ngoài sự nổ lực, cố gắng không ngừng của bản thân Tôi còn nhận được sự quan tâm chân thành từ gia đình, thầy cô, bạn bè

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS Dương Thị Hương Giang đã tận tình giúp đỡ và góp ý trong quá trình thực hiện luận văn

Xin cảm ơn tới các thầy, cô, các anh chị quản lý trong các phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi nhất về cơ sở vật chất

Cảm ơn các anh chị trong phòng Công nghệ Enzyme đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn những kiến thức cơ bản trong phòng thí nghiệm

Cảm ơn tập thể lớp Công nghệ Sinh học Tiên tiến khóa 35 đã nhiệt tình giúp đỡ

và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn gia đình tôi đã luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để tôi

có thể hoàn thành luận văn tốt nhất

Một lần nữa xin chân thành cảm ơn và trân trọng

Cần Thơ, ngày 4 tháng 12 năm 2013

Nguyễn Hoàng Vũ

TÓM LƯỢC

Protease kiềm tính từ vi khuẩn là nguồn enzyme có giá trị cao trong công nghệ enzyme Quá trình phân lập và khảo sát sơ bộ một số chủng sinh protease kiềm tính ở phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ đã xác định được dòng vi khuẩn Bacillus sp SV1 là dòng có tiềm năng sinh tổng hợp protease kiềm tính Kết quả tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy nhằm mục đích tăng sản lượng protease kiềm tính ngoại bào của dòng vi khuẩn này cho thấy với lượng vi khuẩn chủng vào môi trường là 1ml vi khuẩn (10 9 CFU/ml) trong 30ml môi trường nuôi cấy, nguồn nitơ là yeast extract với nồng độ 1,0%, nguồn carbon là glucose nồng

MỤC LỤC

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về enzyme protease 2

2.1.1 Giới thiệu chung về protease 2

2.1.2 Protease kiềm tính 4

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus 5

2.2.1 Vi khuẩn Bacillus .5

2.2.2 Đặc điểm protease kiềm tính của Bacillus sp .5

2.3 Ứng dụng của protease kiềm tính 8

2.3.1 Công nghiệp thực phẩm 8

2.3.2 Công nghiệp thuộc da 8

2.3.3 Công nghiệp dược 8

2.3.4 Công nghiệp chất tẩy rửa 9

2.4 Các phương pháp định lượng và xác định hoạt tính của protease 9

2.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein (Bradford, 1976) .9

2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính protease (Kunitz cải tiến, 1947) 9

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 9

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 9

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 10

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Phương tiện nghiên cứu 11

3.1.1 Dụng cụ thiết bị 11

3.1.2 Nguyên vật liệu 11

3.1.3 Hóa chất 11

3.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.2.1 Quy trình chung về nuôi cấy và thu nhận protease kiềm tính từ vi khuẩn Bacillus sp SV1 .11

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ đến khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 .12

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ đến khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 .13

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng tương tác giữa nhiệt độ và pH lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 .13

3.3.5 Phương pháp phân tích thống kê 15

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

4.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ đến khả năng sản sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 16

4.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ đến khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 17

4.3 Ảnh hưởng tương tác giữa nhiệt độ và pH lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 18

4.3.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh protease kiềm tính Bacillus sp SV1 .18

4.3.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh protease kiềm tính Bacillus sp SV1 .19

4.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 .20

4.3.4 Ảnh hưởng tương tác giữa các nhân tố nhiệt độ và pH lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 .21

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 24

5.1 Kết luận 24

5.2 Đề nghị 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 PHỤ LỤC: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Phụ lục

kiềm tính của Bacillus sp SV1 Phụ lục

Bảng 10 Ảnh hưởng của cơ chất nguồn carbon và nồng độ lên khả năng sinh protease

kiềm tính của Bacillus sp SV1 Phụ lục Bảng 11 Ảnh hưởng của thời gian lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus

tính của Bacillus sp SV1 Phụ lục

Bảng 15 Hoạt tính của protease trong môi trường Horikoshi-I Phụ lục Bảng 16 Hoạt tính của protease theo nguồn nitơ và nồng độ Phụ lục Bảng 17 Hoạt tính của protease kiềm tính theo nguồn carbon và nồng độ Phụ lục Bảng 18 Hoạt tính của protease kiềm tính theo thời gian nuôi cấy Phụ lục Bảng 19 Hoạt tính của protease kiềm tính theo pH Phụ lục Bảng 20 Hoạt tính của protease kiềm tính theo nhiệt độ Phụ lục Bảng 21 Hoạt tính protease kiềm tính theo sự tương tác giữa pH và nhiệt độ Phụ lục

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Cơ chế phản ứng của serine proteases 3

Hình 2 Cơ chế phản ứng của cystein proteases 3

Hình 3 Cơ chế phản ứng của aspartic proteases 4

Hình 4 Cơ chế phản ứng của zinc proteases 4

Hình 5 Biểu đồ hoạt tính protease của chủng Bacillus sp SV1 theo nồng độ và nguồn Nitơ .16

Hình 6 Biểu đồ hoạt tính protease với nguồn carbon và nồng độ khác nhau của dòng Bacillus sp SV1 .17

Hình 7 Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 19

Hình 8 Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 20

Hình 9 Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 .21

Hình 10 Hoạt tính protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 theo nhiệt độ và pH môi trường .22 Hình 11 Biểu đồ đường chuẩn BSA Phụ lục Hình 12 Biểu đồ đường chuẩn Tyrosine Phụ lục

CÁC TỪ VIẾT TẮT

EDTA Ethylendiaminetetraacetic acid

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Enzyme đã được sử dụng trong sản xuất và đời sống từ lâu, tuy nhiên việc nâng cao chất lượng sản phẩm enzyme và giảm chi phí sản xuất là vấn đề mà các nhà khoa học đang chú tâm Enzyme là chất xúc tác sinh học không thể thiếu trong quá trình trao đổi chất của sinh vật Enzyme tinh sạch hay enzyme thô được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chế biến thực phẩm, thuộc da, công nghiệp chất tẩy rửa, trong y dược học, trong kỹ thuật phân tích xét nghiệm, trong sinh học phân tử, xử lý chất thải v.v

Protease đóng vai trò quan trọng nhất trong công nghệ enzyme, protease được

sử dụng rộng rãi, chiếm hơn 60% tổng sản lượng enzyme sản xuất trên thế giới (Kalisz, 1998; Beg et al., 2003; Ellaiah et al, 2003) Đã có rất nhiều nghiên cứu về protease ở nước ta nhưng về protease kiềm tính vẫn còn khá ít Phần lớn các protease hoạt động ở một dãy pH hẹp, chủ yếu ở pH acid và trung tính nhiều hơn Riêng protease kiềm tính hoạt động trong phổ pH rộng và hoạt tính khá bền ở nhiệt độ cao cho thấy ưu việt của nhóm enzyme này

Các enzyme của vi khuẩn Bacillus có nhiều lợi ích về mặt sản xuất với quy mô

lớn Ngoài ra, ứng dụng vi khuẩn này trong việc sản xuất protease kiềm tính có lợi thế

hơn về mặt phát triển cạnh tranh so với các vi sinh vật khác, do vi khuẩn Bacillus có

khả năng thích ứng với sự biến đổi của môi trường và vẫn phát triển khi môi trường không thuận lợi (Hirokoshi, 2011)

Một dòng vi khuẩn Bacillus sp SV1 sinh protease đã được phân lập, định danh

và khảo sát hoạt tính protease trong phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ, tuy nghiên dòng này cần phải được tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để có thể nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp enzyme

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài nhằm mục đích nâng cao khả năng sinh tổng hợp protease kiềm tính của

dòng vi khuẩn Bacillus sp SV1 vừa được phân lập ở phòng thí nghiệm Công nghệ

Enzyme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về enzyme protease

2.1.1 Giới thiệu chung về protease

Enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide trong phân tử protein để giải phóng các acid amin, pepton hoặc di-, tripepton Các nhóm protease khác nhau sẽ cắt những liên kết peptide đặc trưng khác nhau Pepsin, trypsin, bromelain, papain, chymotrypsin, và subtilisin là các loại protease phổ biến trong công nghiệp sản xuất enzyme

Protease cần thiết cho đời sống của các sinh vật vì khả năng thủy phân protein cung cấp các acid amin cần thiết cho sự phát triển của sinh vật Enzyme này rất đa dạng về chức năng từ mức độ bào quan, tế bào, cơ quan tới toàn bộ cơ thể sinh vật và được phân bố rộng rãi trên các đối tượng từ vi sinh vật tới thực vật và động vật So với động vật và thực vật, protease vi sinh vật rất đa dạng, cùng một loại protease nhưng ở các vi sinh vật khác nhau lại khác nhau về các đặc điểm hóa lý như tính chịu kiềm, chịu nhiệt…

Phân loại protease

- Protease được phân làm hai loại: endopeptidase và exopeptidase

- Dựa vào phản ứng với mạch polypeptide, exopeptidase được chia làm hai loại:

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu mút C của chuỗi poly peptide và giải phóng tuần tự từng acid amin hay từng dipeptide

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hay tripeptide

- Dựa vào động học của phản ứng xúc tác, endopeptidase được chia làm 4 nhóm:

+ Serine proteases: là những enzyme có chứa nhóm –OH của serine trong trung tâm hoạt động của enzyme và có vai trò đặc biệt trong phản ứng xúc tác của enzyme Nhóm này chia thành hai nhóm nhỏ hơn là chypmotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin có ở động vật như trypsin, elastase Nhóm subtilisin gồm hai loại protease kiềm tính từ vi khuẩn như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN’ Các serine

protease hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

Hình 1 Cơ chế phản ứng của serine proteases

(Nguồn: http://www.jiaowu.buct.edu.cn/Courseware/Harvard/BCMP201/pdf/ctw_proteases1.pdf,

19/11/2013)

+ Cysteine proteases: bao gồm các protease có chứa –SH trong trung tâm hoạt động Các cysteine protease gồm papain, bromelin và các enzyme của kí sinh trùng Các enzyme này hoạt động ở vùng pH trung tính

Hình 2 Cơ chế phản ứng của cystein proteases

(Nguồn: http://www.jiaowu.buct.edu.cn/Courseware/Harvard/BCMP201/pdf/ctw_proteases1.pdf,

19/11/2013)

+ Aspartic proteases: các protease nhóm này thuộc nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin

Hình 3 Cơ chế phản ứng của aspartic proteases

(Nguồn: http://www.jiaowu.buct.edu.cn/Courseware/Harvard/BCMP201/pdf/ctw_proteases1.pdf,

19/11/2013)

+ Zinc proteases: còn được gọi là matalloprotease, là nhóm được tìm thấy nhiều ở vi khuẩn, nấm mốc Các zinc protease thường hoạt động ở pH trung tính và hoạt tính giảm mạnh nếu có sự xuất hiện của EDTA

Hình 4 Cơ chế phản ứng của zinc proteases

(Nguồn: http://www.jiaowu.buct.edu.cn/Courseware/Harvard/BCMP201/pdf/ctw_proteases1.pdf, ngày

và tốc độ xúc tác so với các protease từ nấm và các loại vi sinh vật khác Đa số các

protease thương mại được sản xuất hiện nay, đều được sản xuất từ các chủng Bacillus

sp

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus

có khả năng thay đổi pH môi trường sang kiềm tính có lợi và chiếm ưu thế hơn

(Horikoshi, 2011) Bacillus sp là những sinh vật hiếu khí, thường có dạng hình que,

gram dương, có khả năng tạo thành bào tử khi điều kiện sống trở nên bất lợi vì thế nó tồn tại dưới nhiều điều kiện về nhiệt độ và pH khắc nghiệt

Bảng 1 Một số các protease kiềm tính được sản xuất theo qui mô công

nghiệp bởi Bacillus sp

Bacillus stearothermophilus 9.5 Công nghiệp chất tẩy, bột giặc

Bacillus sp Y (BYA) 10.0 – 12.5 Công nghiệp chất tẩy

Bacillus sp (AH-101) 12.0 – 13.0 Công nghiệp thuộc da

Bacillus firmus 8.0 Công nghiệp chất tẩy

Bacillus sp (Savinase/Durazym) 9.0 – 11.0 Công nghiệp chất tẩy

Bacillus licheniformis (Alcalase) 8.2 Sinh tổng hợp các peptide hoạt động

Bacillus subtilis 8.5 Tác nhân chất trong công nghiệp thuộc da

2.2.2 Đặc điểm protease kiềm tính của Bacillus sp

- pH tối ưu

Một đặc điểm quan trọng của nhiều vi khuẩn sinh protease kiềm tính là các chủng này phụ thuộc vào pH môi trường để phát triển và sinh lượng protease, vì pH tác động mạnh mẽ đến hoạt động của enzyme và hệ thống vận chuyện tế bào Về tổng thể, pH hoạt động của các protease thương mại có trong chất tẩy rửa thường có pH

khoảng rộng từ 8 – 12 Protease của các loài Bacillus có độ pH tối ưu hẹp hơn 9 – 11

Tuy nhiên cũng có một vài protease có pH tối ưu cao khoảng 12 – 13 như enzyme

được sản xuất bởi Bacillus sp No AH-101 (Takami et al., 1989) hay từ Bacillus sp

B18’ (Fujiwara et al., 1991)

- Nhiệt độ tối ưu

Nhiệt độ tối ưu của các protease kiềm tính dao động khá rộng, từ 40 – 80oC như

các enzyme được sinh tổng hợp từ một số loài như Bacillus brevis có nhiệt độ tối ưu là

60oC (Banerjee et al., 1999) hay Bacillus horikoshii với nhiệt độ ở 45oC (Joo et al., 2002) Protease kiềm tính có nhiệt độ tối rất cao, đương cử là enzyme được sản xuất từ

Bacillus P-2, hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 90oC (Kaur et al., 2001) Bênh cạnh đó, một

số dòng khác lại có nhiệt độ tối ưu hoạt động ở khoảng thấp hơn, từ 30 – 37oC

Bacillus firmus cho hoạt tính cao nhất ở 37oC (Moon S H., 1991) và dòng Bacillus sp

B21-2 cho sinh lượng protease tối ưu khi nhiệt độ môi trường ở 30oC (Fujiwara at el., 1987)

- Sự hiếu khí

Trong quá trình lên men, khi ta nói đến tỉ lệ hiếu khí nghĩa là mức độ hòa tan

của oxy trong môi trường dinh dưỡng Đa số các dòng Bacillus sp sản sinh protease

kiềm tính là vi khuẩn hiếu khí nên trong quá trình phát triển oxy sẽ được sử dụng, sau một thời gian, lượng oxy trong môi trường sẽ cạn kiệt nếu không được cung cấp oxy,

điều này làm hạn chế sự phát triển và sinh protease (Moon và Parulekar, 1991) Hai

phương pháp thường được sử dụng để cung cấp oxy cho môi trường là bơm sục khí và

lắc ủ môi trường Hàm lượng protease sản sinh đạt tối ưu của dòng B subtilis ATCC

14416 (Hubner et al., 1993) và B licheniformis (Sen và Satyanarayana, 1993) khi

được nuôi lắc ủ ở 200 vòng/phút Cũng có một số dòng khác có tỉ lệ hiếu khí cao hơn, hoạt tính protease đạt tối ưu khi nuôi ủ lắc ở 600 vòng/phút

- Ion kim loại

Nhiều ion kim loại có hóa trị II như canxi, coban, đồng, bo, sắt, magie, mangan cần thiết cho môi trường lên men nếu muốn tối ưu hóa các sản phẩm enzyme Vì những enzyme khác nhau sẽ cần ion kim loại đặc trưng khác nhau, phụ thuộc vào tâm hoạt động của mỗi enzyme Bên cạnh đó, môi trường cơ bản nuôi dưỡng vi sinh của nhiều nghiên cứu có chứa kali photphate (Moon và Parulekar, 1991; Mao W et al., 1992; Hubner U et al., 1993) với vai trò là một chất đệm, ổn định pH của môi trường

Tuy nhiên, hàm lượng chất đệm này quá cao sẽ hạn chế sự phát triển của tế bào và ức chế protease

- Trọng lượng phân tử

Phương pháp xác định trọng lượng phân tử thường được áp dụng là PAGE, SDS và Gel filtration Trọng lượng phân tử protease kiềm tính dao động từ 15 – 30 kDa Một số nghiên cứu chỉ ra trọng lượng phân tử của các protease kiềm tính có

SDS-trọng lượng phân tử lớn hơn như protease kiềm tính của Bacillus lichenformis MIR 29 (Ferrero el al., 1996) và Bacillus stearothemophilus F1 (Rahman el al., 1994)

Bảng 2 Trọng lượng của các phân tử protease kiềm tính tổng hợp bởi các

dòng Bacillus sp

(kDa) Phương pháp xác định Nguồn tham khảo

Bacillus sp No AH-101 30 SDS-PAGE Takami et al., 1989

Bacillus Pumilus MK 6-5 28 SDS-PAGE Kumar, 2002

Bacillus stearothermophilus F1 33.5 SDS Rahman et al., 1994

Bacillus licheniformis MIR 29 40 SDS-PAGE Ferrero et al., 1996

Bacillus pseudofirmus AL-89 24 SDS-PAGE Gessesse et al., 2003

Bacillus sp B18’

30

28

SDS PAGE Gel filtration

và ổn định Do vậy, một protein nếu có ít nhóm mang điện tích và nhiều nhóm kị nước thì protein đó sẽ ít tan trong nước Khi sự chênh lệch giữa giá trị pH và pI càng cao,

các nhóm điện tích sẽ tăng lên do vậy độ tan của chất sẽ tăng lên

Bảng 3 Điểm đẳng điện pI của các protease chịu kiềm được sản xuất bởi các

dòng Bacillus sp

Bacillus sp PS719 4.8 Hutadilok-Towana et al., 1999

Bacillus sp NKS-21 8.2 Tsudchida et al., 1989

Bacillus sp No AH-101 9.2 Takami et al., 1989

Bacillus sp GX6638 4.2 Durham et al., 2003

Bacilluspumilus UN-31-C-42 9.0 Huang et al., 2003

Bacillus subtilis no 16 3.9 Kato et al., 1992

Bacillus sphaericus 8.6 Singh et al., 2001

(*Nguồn: Hande Genckal, 2004)

2.3 Ứng dụng của protease kiềm tính

2.3.1 Công nghiệp thực phẩm

Protease kiềm tính thủy phân protein của thực vật và động vật tạo ra các sản phẩm có vai trò quan trọng trong việc điều hòa huyết áp, trong thành phần thức ăn của trẻ em, trong thực phẩm dinh dưỡng và trong công nghiệp nước giải khát Vào những năm gần đây, các enzyme cũng được sử dụng để thủy phân nhiều protein như những protein trong đậu, gelatin, casein nhằm nâng cao chất dinh dưỡng trong thực phẩm

2.3.2 Công nghiệp thuộc da

Đối với công nghiệp thuộc da, xử lý bằng protease có thể xóa được các màu không mong muốn, tăng diện tích sử dụng được của da nên tăng năng xuất sản xuất (Gupta et al., 2002) Phương pháp sử lý da bằng protease có nhiều ưu thế hơn so với phương pháp sử lí lý hóa khác vì khả năng điều khiển thời gian xử lí dễ hơn và giảm lượng chất thải Protease kiềm tính được úng dụng trong cả ba giai đoạn của công nghiệp thuộc da là quá trình ngâm, cạo bỏ lông và ngâm mềm da

2.3.3 Công nghiệp dược

Protease cũng có vai trò quan trọng trong công nghiệp thuốc Dòng vi khuẩn

Bacillus subtilis 316M sinh ra elastoesterase giúp chữa các vết bỏng, vết thương có

mủ, các mụn nhọt (Gupta et al., 2002; Kudrya và Simonenko 1994) Bên cạnh đó các

protease kiềm tính từ Bacillus dòng CK11-4 có tác dụng làm tan các vết máu tụ

(Gupta, 2002)

2.3.4 Công nghiệp chất tẩy rửa

Protease là một trong những chất được ngành công nghiệp chất tẩy ứng dụng để tẩy các chất dơ có nguồn gốc protein Enzyme được sử dụng rộng rãi ở rất nhiều nước

và tới hơn 30% lượng emzyme sản xuất được sử dụng làm chất tẩy

Trong các protease thì protease kiềm tính có nhiều lợi thế hơn vì khả năng hoạt động ở các phổ pH và nhiệt độ rộng Và được sử dụng với liều lượng ít (0.4-0.8%) nên tăng tính kinh tế

2.4 Các phương pháp định lượng và xác định hoạt tính của protease

2.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein (Bradford, 1976)

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi màu của thuốc thử Bradford khi hết hợp với protein trong môi trường acid Thuốc thử Bradford là hợp chất bao gồm Coomassie Brilliant Blue (CCB) G250, phosphoric acid hòa tan trong hỗn hợp ethanol 95% và nước cất Khi chưa gắn với protein, thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thụ cực đại 465nm Sau khi kết hợp với protein, thuốc thử chuyển sang màu xanh dương và hấp thụ cực đại ở bước sóng 595nm Vì vậy, lượng protein có thể được biết bằng cách xác định thuốc nhuộm màu xanh dương khi đo hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 595nm Độ hấp thu tỉ lệ thuận với hàm lượng protein có trong dung dịch 2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính protease (Kunitz cải tiến, 1947)

Phương pháp đo dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất protein bởi enzyme Phản ứng sẽ được dừng lại bằng acid trichloroacetic Sau đó sản phẩm tạo thành được xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng của sản phẩm acid amin sinh ra ở bước sóng 280

nm

Đơn vị hoạt tính enzyme được biểu hiện qua đơn vị Tyrosin 1U là lượng enzyme cần thiết để xúc tác thủy phân casein, cho ra lượng sản phẩm sản phẩm tương đương với 1µM Tyrosin sinh ra

Hoạt tính đặc hiệu enzyme là số đơn vị hoạt tính enzyme có trong 1mg protein (U/mg)

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện đã có rất nhiều nghiên cứu ở nước ta về enzyme và protease nói riêng ở nước ta nhưng số lượng nghiên cứu về protease kiềm tính vẫn còn hạn chế Đa số các

nghiên cứu quan tâm về các protease có nguồn gốc từ động và thực vật như bromelain, papain, trypsin, pepsin Tuy nhiên, đã có một số nghiên cứu về ứng dụng của protease

kiềm tính trong việc xử lý môi trường bằng nấm mốc như Asperillus Oryzae trong đề

tài nghiên cứu thu nhận protease kiềm tính và ứng dụng trong xử lý phế liệu da giầy (Đặng Thị Đăng Phương, 2005) Bên cạnh đó, đề tài “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa” (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn, 2006) nghiên cứu về quy trình thu nhận protease từ ruột cá và trong điều kiện chiết enzyme với độ

pH = 9.5

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, trước năm 1971 có rất ít các nghiên cứu về protease kiềm tính

Nhưng kể từ khi dòng Bacillus 221 được phân lâp và có khả năng sản xuất serine

protease kiềm tính (Hirokoshi, 1971) thì rất nhiều các nghiên cứu khác đã tìm hiểu và ứng dụng những chủng khác vào sản xuất

Chủng Bacillus Mycoides cũng được Mohamed và các cộng sự (1997) tìm hiểu

và có khả năng sản xuất protease kiềm tính Các điều kiện phát triển tối ưu của chủng này là pH 9.0, dextrin 3%, (NH4)2SO4 0,1%, peptone (0-1%) và KH2PO4 Nhiệt độ tối

ưu cho enzyme của chủng này hoạt động là 50 – 55oC

Nghiên cứu về chủng Bacillus cereus strain 146 (Norazizah Shafee et al., 2005)

cho thấy chủng này phát triển tối ưu nhất dưới nhiệt độ 37oC được ủ lắc ở 170 vòng/phút với nguồn nitơ tối ưu là beef extract, nguồn carbon là glucose và thời gian ủ

là 48 giờ

Gần đây hơn, Kumar và các cộng sự (2012) cũng tinh sạch sản phẩm protease

kiềm tính của dòng Bacillus MPTK 712 được phân lập từ nước thải của nhà máy sản

xuất bơ Nghiên cứu cho thấy hoạt tính của protease kiềm tính cao nhất ở pH 9.0, nhiệt

độ 55oC

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Dụng cụ thiết bị

Đầu cone, pipet, ống nghiệm, ống đong, đĩa petri, que cấy, máy ủ lắc, nồi khử trùng nhiệt ướt, pH kế, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ ủ, và một số dụng cụ thiết bị thường dùng khác trong phòng thí nghiệm

3.1.2 Nguyên vật liệu

Dòng vi khuẩn Bacillus sp SV1 được cung cấp từ phòng Công nghệ Enzyme,

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh Học, Đại học Cần Thơ

3.1.3 Hóa chất

Glucose, KH2PO4, polypeptone, MgSO4, Na2CO3, Tris-HCl, EDTA, Comassive Brilliant Blue G250, yeast extract, casein

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Quy trình chung về nuôi cấy và thu nhận protease kiềm tính từ vi khuẩn

Bảng 4 Thành phần môi trường Horikoshi-I (pH 9.0)

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ đến khả năng sinh protease

kiềm tính của Bacillus sp SV1

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố là nguồn nitơ và nồng

Thí nghiệm 3 lần lặp lại với 12 nghiệm thức Tổng đơn vị thí nghiệm là 36

Bảng 5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ

Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ đến khả năng sinh protease

kiềm tính của Bacillus sp SV1

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với hai nhân tố là nguồn carbon và nồng độ

Nhân tố A: nguồn carbon

Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng tương tác giữa nhiệt độ và pH lên khả năng sinh

protease kiềm tính của Bacillus sp SV1

3.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh protease

kiềm tính của Bacillus sp SV1

- Chủng Bacillus sp SV1 được nuôi cấy theo môi trường dinh dưỡng nhận từ

thí nghiệm 3.2.2 và 3.2.3

- Thí nghiệm được khảo sát với một nhân tố là thời gian theo các khoảng 24h, 48h, 72h và 96h

- Thí nghiệm có 3 lần lặp lại với tổng đơn vị thí nghiệm là 12

Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)

3.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh protease kiềm

Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)

3.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh protease kiềm tính

của Bacillus sp SV1.

- Mẫu vi khuẩn được nuôi trong 30ml môi trường nhận được từ thí nghiệm 3.2.2 và 3.2.3 Nhân tố To thay đổi trong khoảng 32, 37, 42, 47 độ C lắc ủ ở 120 vòng/phút

- Thời gian lấy mẫu theo kết quả khảo sát thí nghiệm thời gian Thí nghiệm 3 lần lặp lại với tổng số đơn vị thí nghiệm là 12

Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)

3.2.4.4 Ảnh hưởng tương tác giữa pH ban đầu và nhiệt độ tới khả năng sinh

protease kiềm tính của Bacillus sp SV1

- Vi khuẩn được nuôi trong môi trường có nguồn carbon và nitơ nhận được từ thí nghiệm 3.2.2 và 3.2.3

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí với hai nhân tố gồm nhiệt độ và pH theo bảng sau:

Bảng 7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng giữa nhiệt độ và pH

Nghiệm thức

Nhân tố Nhiệt độ pH

Thí nghiệm có ba lần lặp lại với số nghiệm thức là 9 Tổng số đơn vị thí nghiệm

là 27

Chỉ tiêu khảo sát: hoạt tính (U/ml)

3.3.5 Phương pháp phân tích thống kê

Dữ liệu được nhập vào phần mềm Microsoft excel, xử lý và phân tích số liệu bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ đến khả năng sản sinh protease kiềm

tính của Bacillus sp SV1

Biểu đồ kết quả ảnh hưởng của nguồn Nitơ và nồng độ (Hình 5) cho thấy chủng

Bacillus sp SV1 trong nghiên cứu này khi được cung cấp các nguồn nitơ dinh dưỡng

khác nhau với nồng độ tăng từ 0,5-2,0%, lượng protease kiềm tính được sinh ra cũng khác nhau

Hình 5 Biểu đồ hoạt tính protease của chủng Bacillus sp SV1 theo nồng độ

và nguồn Nitơ

Trên cơ chất casein, hàm lượng protease sinh ra tăng dần theo nồng độ nhưng không cao, trong đó lượng enzyme đạt cao nhất ở nồng độ 2,0% casein (0,293 U/ml) Bên cạnh đó với nguồn pepton, hoạt tính của protease sinh ra thấp hơn so với casein Hàm lượng enzyme tăng dần và đạt mức cao nhất ở 1,5% pepton (0.16 U/ml), sau đó giảm ở nồng độ 2,0% pepton Đặc biệt hơn với nguồn từ yeast extract, lượng protease kiềm tính đạt cao nhất ở nồng độ 1,0% yeast extract (1,4 U/ml) sau đó giảm mạnh ở nồng độ cao hơn (1,5% và 2,0%)

Yeast extract so với pepton và casein có chứa nhiều dinh dưỡng hơn gồm acid amin, protein, vitamin cũng như các yếu tố tăng trưởng khác nên là nguồn nitơ giúp vi khuẩn phát triển tốt và sinh tổng hợp protease cao Với nồng độ yeast extract thấp, lượng acid amin trong nguồn dinh dưỡng chưa đủ nên vi khuẩn cần sản sinh enzyme

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6

để phân giải protein trong môi trường Ngược lại, với nồng độ yeast extract cao, vi khuẩn sẽ tận dụng nguồn dinh dưỡng acid amin có sẵn mà không cần phải sản sinh enzyme nhiều

Một số nghiên cứu cũng cho thấy các chủng Bacillus sp phát triển và sinh

protease khá cao trên nguồn yeast extract khi so với pepton và casein như chủng

Bacillus pumilus ATCC 7061 (Eman, 2013), B subtilis, B licheniformis (Udandi,

2009)

Kết quả của thí nghiệm này cho thấy nguồn yeast extract với nồng độ 1,0% được xem là tối ưu để chủng vi khuẩn sinh tổng hợp protease kiềm tính cao nhất Kết quả được chọn để khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sản sinh protease của

Hình 6 Biểu đồ hoạt tính protease với nguồn carbon và nồng độ khác nhau

của dòng Bacillus sp SV1

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Glucose là chất có thể được vận chuyển thụ động hoặc chủ động qua màng tế bào và đồng thời là nguồn năng lượng cơ bản trong quá trình lên men chuyển hóa cung

cấp năng lượng ở vi sinh vật Với sự hiện diện của glucose trong môi trường, Bacillus

sp SV1 cảm ứng được nguồn carbon này và phát triển tốt hơn nguồn carbon từ fructose và sucrose Bên cạnh đó, hàm lượng đường cũng ảnh hưởng đáng kể tới sự sản sinh protease, lượng enzyme sẽ được sinh ra nhiều hơn khi trong môi trường có hàm lượng đường ít nhằm giúp vi khuẩn tận dụng nguồn dinh dưỡng khác (Walker et al., 1983; Prasad et al., 1984) Tuy nhiên, nồng độ glucose cao ảnh hưởng lên hoạt động của màng bán thấm tế bào

Kết quả thí nghiệm này tương tự như đề tài phân lập vi khuẩn sinh protease

kiềm tính ngoại bào từ đất, vi khuẩn Bacillus subtilis RSKK96 được nuôi trong môi

trường có nguồn carbon là glucose sinh lượng enzyme lớn hơn so với sucrose và fructose (Nurullah và Fikret, 2011)

Thí nghiệm cho thấy Bacillus sp SV1 sản sinh protease kiềm tính tối ưu khi sử

dụng nguồn carbon là glucose với nồng độ 1,0%

4.3 Ảnh hưởng tương tác giữa nhiệt độ và pH lên khả năng sinh protease kiềm

tính của Bacillus sp SV1

4.3.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh protease kiềm tính

Bacillus sp SV1

Dựa vào biểu đồ ở hình 7 cho thấy sau 24 giờ nuôi cấy, Bacillus sp SV1 bắt

đầu sản sinh protease (0,386 U/ml), lượng protease tăng nhanh và đạt cao nhất ở thời điểm 48 giờ nuôi cấy (1,235 U/ml), sau đó giảm mạnh ở các thời điểm 72 giờ (0,214 U/ml) và hoạt tính còn rất yếu sau 96h chủng (0,069 U/ml) Có thể thấy quá trình tổng hợp enzyme phù hợp với vòng đời phát triển của vi khuẩn, lượng enzyme tăng nhanh

do vi khuẩn sản sinh mạnh trong 48 giờ đầu, sau đó tế bào vi khuẩn trưởng thành, môi trường dinh dưỡng cũng cạn kiệt, vi khuẩn sinh tổng hợp protease ở mức độ thấp hơn

72 giờ và hầu như kết thúc ở 96 giờ nuôi cấy