Tối ưu hóa một số điều kiện thu sinh khối của các chủng Baciillus ứng dụng tạo chế phẩm nuôi tôm

MỞ ĐẦU : Trong những năm gần đây, nền kinh tế nước ta có những bước chuyển biến rõ rệt, đặc biệt là từ khi nước ta gia nhập tổ chức thương mại thế giới WTO (2007). Cùng với sự phát triển đ

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Bảng 9: Ảnh hưởng của peptpone đối tới khả năng sinh B.subtilis ATCC 6330 54

Để đạt được mục tiêu trên, quy hoạch phát triển ngành thủy sản đã có những bước thay đổi cơ bản trong cơ cấu chuyển từ đánh bắt thuần túy sang cơ cấu vừa nuôi trồng vừa đánh bắt Đối với phương thức nuôi trồng thủy sản thực sự phát triển với quy mô lớn trên toàn quốc, chủ yếu tập trung vào nuôi cá basa, cua, tôm,… Đặc biệt trong nuôi trồng thủy sản nước lợ, nước mặn mà đối tượng chính là con tôm sú đang được quan tâm nhiều nhất Nuôi tôm thương phẩm mang lại hiệu quả rất cao, tạo công ăn việc làm cho dân cư vùng duyên hải, tận dụng vùng diện tích ven biển bị nhiễm mặn, quan trọng và ý nghĩa hơn ở chỗ tôm sú là đối tượng xuất khẩu mang lại nhiều ngoại tệ

Nhiều năm trở lại đây, nghề nuôi tôm sú thương phẩm phát triển mạnh Hiện nay cả nước có hơn 500.000 ha diện tích nuôi tôm, trải dài dọc theo ven biển từ Quảng Ninh đến Kiên Giang Do việc phát triển diện tích nuôi quá nhanh, kinh nghiệm của người nuôi tôm còn hạn chế, sự tiếp nhận khoa học kĩ thuật vào nghề nuôi tôm còn chậm, người nuôi chưa theo kịp như kĩ thuật chọn con giống, chăm sóc, cho ăn, phòng ngừa bệnh, quản lý môi trường ao nuôi và lựa chọn các sản phẩm, sử dụng cho nghề nuôi còn nhiều hạn chế và thiếu sót.

Mặt khác, ở hầu hết các tỉnh trong cả nước tôm sú được nuôi dưới hai hình thức nuôi bán thâm canh hoặc thâm canh Việc nuôi thâm canh càng phát triển thì môi trường ao nuôi lẫn các khu vực lân cận càng bị ô nhiễm Bởi vì tất cả các hệ thống dùng cho việc nuôi tôm đều có khả năng gây ô nhiễm môi trường như thức ăn, chất thải hữu cơ do quá trình bài tiết và lột xác định kì của tôm,… Những chất cặn bã này tích tụ và lắng đọng lâu ngày gây ô nhiễm môi trường làm ảnh hưởng đến sự bền vững của hệ sinh thái, đặc biệt ảnh hưởng tới sự phát triển và tăng trưởng của vật nuôi Đây cũng là nguyên nhân gây dịch bệnh cho tôm Để ngăn ngừa nguy ngừa nguy cơ này thì biện pháp thường được sử dụng hiện nay là dùng vôi bột hoặc một số hóa chất vệ sinh ao nuôi trước khi thả giống Tuy nhiên vấn đề ô nhiễm thường phát sinh trong quá trình nuôi Mặt khác, đối với các trại giống thì việc sử dụng hóa chất để đối phó với tình trạng ô nhiễm không được phép, do vậy khó mà đảm bảo con giống sạch bệnh Chính vì vậy, cho dù diện tích ao nuôi tôm tăng nhanh trong nhiều năm trở lại đây nhưng sản lượng tăng không nhiều Đây chính là những thách thức và vấn đề đáng quan tâm của lĩnh vực nuôi tôm thâm canh va nuôi tôm công nghiệp.

Một vấn đề nữa đáng đề cập đến ở đây là: ngày nay, các chế phẩm từ các vi sinh vật có hoạt tính enzyme ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp và chế biến thực phẩm Mười năm trở lại đây, thị trường này gia tăng không ngừng và đang trở thành ngành công nghiệp phát triển ở các nước trên thế giới Vì thế giải pháp hiệu quả và an toàn được lựa chọn hiện nay là sử dụng chế phẩm sinh học ở các dạng khác nhau( dạng bột, dịch) trong nuôi trồng thủy sản để làm giảm ô nhiễm ao nuôi, tăng khả năng phòng chống bệnh và kích thích vật nuôi sinh trưởng tốt

Trong đề tài này chủ yếu đề cập đến việc sử dụng các vi khuẩn Bacillus trong chế phẩm Probiotic cho tôm Các vi khuẩn Bacillus đặc biệt là các chủng thuộc loài Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis là các chủng có khả năng tham gia vào hệ

vi sinh vật đường ruột của tôm, cạnh tranh vị trí bám dính , cạnh tranh thức ăn, đặc biệt có thể sản sinh ra các hợp chất ức chế như bactabacteriocins, sideropheres, hydro peroxit… ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật có hại giúp tôm tăng trưởng tốt và chống chịu với bệnh tật Mặt khác các vi khuẩn này tăng cường chức năng miễn dịch cho tôm, giảm nguy cơ mắc bệnh ở tôm Ngoài ra khi các vi khuẩn này tồn tại trong thức ăn thì chúng có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ trong thức ăn thừa, góp phần làm sạch môi trường nuôi tôm Khi môi trường nước nuôi không bị ô nhiễm bởi thức ăn thừa thì cải thiện điều kiện sống của con tôm Khi bổ sung các chế phẩm sinh học này vào thức ăn của tôm giúp tôm tăng khả năng sinh trưởng, tăng khả năng chống chịu bệnh tật, làm sạch môi trường nước nuôi tôm đồng thời làm giảm đáng kể lượng kháng sinh và hóa chất sử dụng trong nuôi tôm, góp phần làm giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường.

Hiện nay ở Việt Nam có hàng trăm loại chế phẩm xử lý môi trường nuôi tôm cá với nhiều nhãn hiệu khác nhau được nhập khẩu cũng như sản xuất trong nước Tuy nhiên các chế phẩm nước ngoài hiệu quả nhưng quá đắt, còn các chế phẩm trong nước lại hạn chế do chủng giống không giữ được hoạt tính ban đầu.

Trước những khó khăn chung người nuôi đang gặp phải và với mong muốn góp phần nhỏ bé của mình vào việc giải quyết những vướng mắc trên, tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Tối ưu hóa một số điều kiện thu sinh khối của các chủng Baciillus

ứng dụng tạo chế phẩm nuôi tôm ”

Mục đích của đề tài là : tìm điều kiện tối ưu nhất ( nhiệt độ, pH, dinh dưỡng…) để lượng sinh khối thu được là lớn nhất làm cơ sở cho việc phối trộn với chất mang tạo ra chế phẩm sinh học hiệu quả.

Nội dung nghiên cứu gồm các vấn đề sau:

1 Kiểm tra hoạt tính enzyme các chủng Bacillus

2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các

chủng Bacillus tác động đến việc thu sinh khối

3 Sử dụng lý thuyết quy hoạch thực nghiệm và phần mềm tối ưu hóa Desgin Expert 8.0 lập ma trận thực nghiệm và tiến hành tối ưu hóa điều

kiện thu sinh khối của các chủng Bacillus

PHẦN I: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

I- TÌNH HÌNH PHÁT TRIỂN NGHỀ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

1 Lịch sử phát triển nghề nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới1.1 Tình hình phát triển nghề nuôi trồng thủy sản trên thế giới

Lịch sử của nghề nuôi trồng thủy sản trên thế giới đã được bắt đầu từ khoảng 500 năm trước công nguyên tại Trung Quốc với loài cá được nuôi đầu tiên là cá chép (Cyprinus carpio) Hình thức sơ khai là thu cá giống từ sông để ương nuôi trong ao vùng nước ngọt Nghề nuôi cá chép sau đó được lan rộng ra nhiều nơi ở Châu Á, Trung Đông và Châu Âu do sự di dân của người Hoa Tuy nhiên, vào thế kỷ thứ 6 sau công nguyên, do cá Chép không được phép nuôi ở Trung Quốc, vì thế các loài các loài cá chép Trung Quốc (cá trắm cỏ, cá mè hoa, mè trắng) bắt đầu được phát triển ương nuôi Ở Ấn Độ, các loài cá trôi Ấn Độ được ương nuôi từ thế kỷ 11 Trong khi đó, loài cá nước lợ được nuôi đầu tiên là loài cá Măng (Chanos chanos) vào thế kỷ 15 tại Indonesia [10]

Ở Việt Nam, nghề nuôi thủy sản truyền thống được bắt đầu từ những năm 1960 Sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi thủy sản được bắt đầu từ những năm thập niên 1970 Đến nay, nghề nuôi thủy sản vẫn liên tục phát triển đa dạng lẫn thâm canh hóa Nếu như năm 1970, tốc độ tăng trưởng hằng năm về sản lượng là 3,9%, thì năm 2006, tốc độ tăng trưởng là 36% Sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi đã góp phần tăng tỷ lệ tiêu dùng sản phẩm thủy sản nuôi trồng từ 0,7 kg/người/năn vào năm 1970 lên 7,8 kg/người/năm vào năm 2006 Sản phẩm thủy sản nuôi trồng chiếm 46% tổng sản phẩm thủy sản tiêu dùng hàng năm Ở Trung Quốc, tỷ lệ này là 90% [10]

Trên thế giới, Châu Á cho sản lượng thủy sản nuôi trồng lớn nhất, chiếm 89% tổng sản lượng và 77% tổng giá trị sản phẩm thủy sản nuôi trồng thế giới năm 2006 Năm 2010, theo dự báo của tổ chức FAO tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới là 147 triệu tấn và sản lượng khai thác là 89,8 triệu tấn [10]

Mười nước đứng đầu thế giới về sản lượng nuôi trồng thủy sản theo thứ tự gồm: Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh, Chile, Nhật Bản, Na Uy và Philippines Năm 2010, sản lượng nuôi trồng thủy sản của Việt Nam là 5,3 triệu tấn, đứng thứ 3 thế giới.[10]

1.2 Tình hình phát triển nghề nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghề nuôi thủy sản cũng phát triển rất năng động Nghề nuôi thủy sản truyền thống bắt đầu từ thập niên 1960, tuy nhiên trong vòng 10 năm nay, nghề nuôi thủy sản có tốc độ phát triển rất nhanh chóng Theo thống kê của Bộ Thủy sản (2006) thì năm 1999 cả nước có tổng cộng trên 524.619 ha, đạt sản lượng 480.767 tấn Năm 2005, cả nước có gần 1.000.000 ha nuôi thủy sản, đạt sản lượng 1.437.356 tấn, trong đó, sản lượng nuôi thủy sản nước lợ - măn là 546.716 tấn, sản lượng nuôi nước ngọt đạt 890.650 tấn Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá phong phú, tuy nhiên, chủ lực nhất vẫn là nuôi cá tra thâm canh ở vùng nước ngọt và nuôi tôm ở vùng nước lợ ven biển Đặc biệt, năm 2007, sản lượng nuôi cá tra và basa đạt trên 1.200.00 tấn và sản lượng tôm nuôi đạt 307.000 tấn [10]

Năm 2010, diện tích nuôi trồng thủy sản cả nước là 1.096.722 ha , đạt sản lượng 2.828 ngàn tấn và kim ngạch xuất khẩu vượt ngưỡng 5 tỉ đô la ( Theo kế hoạch 5 năm phát triển ngành thủy sản 2011- 2015 của Tổng cục thủy sản Việt Nam)

2 Hiện trạng môi trường và dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản

Sự phát triển nhanh chóng của hoạt động nuôi trồng thủy sản đã kéo theo tình trạng ô nhiễm nặng nề, làm lây lan và bùng phát dịch bệnh Trong điều kiện nuôi trồng thủy sản hiện nay, môi trường ao nuôi rất phú dưỡng Nguyên nhân là do chúng ta đưa vào ao nuôi lượng thức ăn tổng hợp rất lớn mà chỉ có một lượng thức ăn rất nhỏ được đồng hóa thành sinh khối tôm ( 17%), còn lại là không ăn được do bị hòa tan vào trong nước hoặc bài tiết ra ngoài môi trường Lượng thức ăn thừa, uế thải hữu cơ và phế thải do lột xác để duy trì hoạt động sống của tôm cùng với xác động vật thủy sinh phù du là những yếu tố làm cho ao nuôi nhiễm bẩn Sự nhiễm bẩn của ao đầm ngoài ô nhiễm hữu cơ còn nhiễm bẩn do dùng hóa chất, kháng sinh trong quá trình nuôi Việc sử dụng hóa chất khử trùng

ao nuôi bên cạnh tác dụng mong muốn, các loại hóa chất còn gây ra tác hại với môi trường như tồn lưu hóa chất trong môi trường thủy sinh, làm giảm số lượng thủy sinh, làm giảm số lượng vi sinh vật có lợi trong ao nuôi, làm cho quá trình phân hủy hữu cơ bị đình trệ và hậu quả là môi trường bị phú dưỡng, kích thích sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, tăng cơ hội nhiễm bệnh Ngoài ra việc sử dụng hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm hải sản gây ra hiện tượng kháng thuốc, dư lượng chất kháng sinh trong sản phẩm hải sản gây hại cho ngoài tiêu dùng như : tăng mẫn cảm với dư lượng thuốc hoặc xuất hiện vi khuẩn đường ruột kháng lại các chất kháng khuẩn [13]

3 Về tình hình ô nhiễm ao nuôi

Nuôi tôm đang có những bước chuyển biến nhanh từ hình thức nuôi quảng canh Tuy nhiên trong nuôi tôm thâm canh ngoài vấn đề giống tôm sạch thì vấn đề làm sạch và duy trì ao nuôi sạch còn gặp nhiều khó khăn, đơn cử tỉnh Long An đầu năm 2002 đã có 1050 ha ao nuôi tôm bị chết trắng, trong đó có những huyện bị mất trắng 100% diện tích ao nuôi Tình hình đó đặt ra cho các nhà khoa học và sản xuất nhiều vấn đề cần giải quyết, trong đó có việc xử lý bùn đáy ao, đặc biệt trong những ao, đầm nuôi thả tôm mật độ cao Nền đáy có vai trò quan trọng là nơi các vật nuôi sinh sống, săn bắt mồi, đặc biệt đối với tôm thì nền đáy gắn liền với vòng đời của chúng Nền đáy cũng là nơi chứa đựng các sản phẩm tồn dư do quá trình nuôi chúng ta đưa xuống như vôi, hóa chất, xác tôm Các sản phẩm hữu cơ theo thời gian do sự rửa trôi, xói mòn, rò rỉ tích tụ dần xuống đáy ao Cũng tại đây quá trình hấp thu, phân giải, phân hủy các chất hữu cơ diễn ra mạnh mẽ, các loại khí độc như H2S, NO2 được sinh ra nhiều và liên tục với cường độ mạnh dần qua các tháng nuôi.

Tình trạng nhiễm bẩn nặng của ao nuôi tôm mặc dù đã được khắc phục bằng việc thay nước sạch thường xuyên hay nước đã qua xử lý, song phần bùn ao nơi các chất thải tích tụ trong quá trình nuôi là môi trường lý tưởng cho các vi trùng và ký sinh trùng gây bệnh phát triển là nguyên nhân gây ô nhiễm thường xuyên và lâu dài ao nuôi vẫn chưa có biện pháp xử lý hữu hiệu, kể cả khi bùn được vớt lên khỏi ao, đầm nuôi

Bùn ao nuôi tôm được hình thành do thức ăn tôm thừa, xác vi sinh vật và động thực vật phù du, chất thải của tôm lắng đọng Mỗi năm lượng bùn tích tụ ở đáy ao nuôi tôm thâm

canh hình thành một lớp bùn dày 10-15cm tương đương 30-50 tấn chất khô hữu cơ/ ha Bùn có thành phần chủ yếu là chất hữu cơ, sinh khối vi sinh vật và động vật thủy sinh nên khi phân hủy tự nhiên ở đáy ao sẽ làm cạn kiệt nguồn oxy hòa tan và là nguồn sinh ra các chất độc hại đối với tôm như NH3, H2S, CH4 gây ra ô nhiễm nặng cho các ao nuôi tôm Bên cạnh đó bùn còn chứa các thành phần vô cơ, trong đó đáng quan ngại nhất là NaCl khoảng 1% Điều này đòi hỏi phải có các chủng vi sinh vật hữu hiệu chuyển hóa các chất hữu cơ trong điều kiện nhiễm mặn và có đủ các chất nền phối trộn nếu muốn xử lý bùn.[1]

4 Các bệnh thường xảy ra cho tôm khi ao nuôi bị nhiễm bẩn

Khi ao bị nhiễm bẩn một số loại vi khuẩn từ bên ngoài xâm nhập vào trong vỏ tôm Bệnh thường gặp nhất là bệnh hoại tử do vỏ tôm bị tổn thương vì nhiễm khuẩn hay không cứng được Nhiều loại vi khuẩn ăn mòn lớp kitin của vỏ gây ra lở loát hay tạo ra các vết nhỏ làm cho vỏ bị nhăn nheo Ngoài vi khuẩn thì một số sinh vật khác có thể xâm nhập qua vỏ như nấm hay động vật nguyên sinh Nấm có thể xâm nhập mang và vỏ tạo nên những khối đen trên con tôm Động vật nguyên sinh gây tổn thất cho mang tạo ra những

đốm đen nhỏ, còn gọi là bệnh đen mang Bệnh đen mang thường do nhiễm khuẩn vibrio, nhiễm nấm Fuarium, động vật nguyên sinh Đôi khi cũng do nhiễm hóa chất như kim loại

nặng, hàm lượng nitrat cao [12]

Nhóm vi khuẩn vibrio là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội chúng tồn tại trong môi trường

nước nuôi tôm như một quần thể vi sinh vật trong ao nuôi Khi điều kiện môi trường bất lợi chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệnh Khi nhiễm vi khuẩn này tôm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn, đổi màu đỏ hoặc xanh Nếu môi trường tiếp tục xấu đi, hay số lượng vi khuẩn phát triển mạnh, tôm sẽ chết trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ trở thành bệnh nhiễm khuẩn mãn tính Để ngăn ngừa bệnh này phải cải thiện môi trường ao nuôi [13]

Ngoài bệnh đen mang Vibrio cũng gây ra một số bệnh khác như bệnh phân trắng, bệnh

phát sáng Các bệnh này cũng làm tôm chết hàng loạt [12]

Ngoài ra một số loài virut cũng là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng cho tôm Các bệnh truyền nhiễm do virus như WSSV( white spot syndrome virus) hay YHD( Yellow Head

Disease) là những bệnh điển hình gây thiệt hại nghiêm trọng Bệnh đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm Bệnh MBV( Monodon Baculo Vius) khá phổ biến ở tôm sú nuôi [12]

5 Những chỉ số cơ bản đánh giá nước nuôi tôm

+ Nhiệt độ nước:

Tôm là nhóm động vật biến nhiệt, nhiệt độ của chúng thay đổi theo nhiệt độ của nước( nhiệt độ môi trường) N hiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều không thuận lợi cho đời sống của tôm Nhiệt độ ảnh hưởng tới đời sống của tôm như: hô hấp, tiêu thụ thức ăn, đồng hóa thức ăn, chống bệnh, sự tăng trưởng Nhiệt độ thay đổi theo mỗi mùa, vì thế tại miền Nam Việt Nam có thể nuôi tôm quanh năm trong khi miền Bắc chỉ khai thác được vào mùa nóng Nhiệt độ mặt trời làm lớp nước trên mặt nóng hơn lớp nước dưới sâu, mặt khác tỉ trọng nước giảm cùng với sự gia tăng nhiệt độ, kết quả lớp nước phía trên nhẹ hơn và có xu hướng không pha trộn lớp nước phía dưới Lớp trên có nhiệt độ cao và nồng độ oxy hòa tan lớn, trong khi lớp dưới có hàm lượng chất dinh dưỡng cao Do vậy việc sục khí để phá vỡ 2 lớp nước là cần thiết Tại các ao hồ vùng nhiệt đới khoảng 28-300C là nhiệt độ thích hợp với tôm sú nuôi thương phẩm Tôm sú có thể chịu được nhiệt độ 280C tôm lớn chậm, trên 300C tôm lớn nhanh hơn nhưng dễ mắc bệnh nhất là bệnh MBV [11]+ Độ mặn:

Độ mặn là tổng số các ion có trong nước, độ mặn đơn vị tính là ‰ Nhìn chung nước được chia làm 6 loại độ mặn khác nhau:

Bảng 1 Độ mặn của các loại nước

Đây là yếu tố quan trọng nhất cần đặc biệt chú trọng trong kỹ nghệ nuôi tôm Số oxy hòa tan trong nước rất thấp, chỉ cần 5ppm( 1ppm= 1 phần triệu) trong nước là đủ cho tôm hô hấp một cách an toàn Trong ao hồ, hiện tượng quang tổng hợp của các sinh vật là yếu tố chính tạo nên oxy hòa tan Vì hiện tượng này chỉ xảy ra ban ngày dưới ánh nắng mặt trời, do vậy để giải quyết hiện tượng này ta sử dụng máy sục khí hoặc thay nước mới vào ao để tạo thêm oxy

Bảng 2 Nồng độ oxy hòa tan và sức khỏe của tôm

Oxy hòa tan( ppm) Tình trạng của tôm

5.0-6.0-7.0 Tôm khỏe mạnh và tăng trưởng nhanh

Triệu chứng của tôm khi bị thiếu oxy: tôm tập trung gần mặt nước, gần vị trí dẫn nước vào ao hồ, tôm di chuyển chậm nhưng tăng tốc độ hô hấp [12]

+ Độ đục của nước:

Độ đục của nước được xác định bởi đĩa Secchi, một cách đơn giản ta kết luận là độ đục của nước ao thích hợp nếu đĩa Secchi được đọc ở trong khoảng 25-40cm Điều này có nghĩa là nếu độ đọc trên đĩa Secchi mà ngắn hơn 25cm thì nước ao quá đục, ngược lại nếu độ đọc này ở mức xa hơn 40cm thì nước ao lại quá trong, đồng nghĩa với nước quá nghèo chất dinh dưỡng.[12]

Trong ao, độ đục thường do các phiên sinh vật phát triển quá nhiều Độ đục trong nước sẽ bất lợi nếu gây ra bởi chất sét hoặc các vật vô sinh vì cản trợ sự xuyên qua của ánh sáng, làm giảm khả năng sản xuất của ao hồ Nếu độ đục gây ra bởi các chất vô sinh mà quá cao thì tôm, cá sẽ bị nghẹt bộ phận hô hấp

Ngoài đĩa Secchi người ta còn dùng kính hiển vi để đếm số tế bào phiêu sinh trong 1 ml để xác định sự phát triển phiêu sinh trong ao nhiều hay ít.

+Độ cứng của nước

Độ cứng của nước liên quan tới tổng số nguyên tử kim loại hoá trị 2 (divalent metal ions) mà chính yếu là calcium và magnesium trong môi trường đó Độ cứng của nước được tính bằng mg/l của chất calcium carbonate (CaCO3) trong nước và có các tên gọi khác nhau được ghi dưới đây:

+ Độ pH:

Độ pH trong môi trường nước là một yếu tố quan trọng trong quá trình phát triển và ảnh hưởng trực tiếp, gián tiếp lên tôm Sự biến động lớn của pH trong ngày, trong tuần là nguyên nhân dẫn đến gây sốc tôm, làm tôm bỏ ăn và yếu đi Phần lớn các loài tôm phát triển tốt trong phạm vi từ pH= 6.5-9 Nếu độ pH quá thấp hoặc quá cao đều bất lợi cho tôm: chậm tăng trưởng, còi cọc, khả năng chống bệnh tật kém [12]

+ Độ kiềm:

Độ kiềm trong nước chủ yếu là các ion HCO3-( bicarbonate), CO3-( cacbonate kiềm), OH- ( Hydroxit kiềm), đơn vị biểu thị tương đương mg/l CaCO3 Ao hồ có độ kiềm 20- 150 mg/l thì thích hợp cho phiêu sinh vật cũng như tôm cá Chất kiềm quan trọng trong ao hồ vì vai trò chất đệm và cung cấp CO2 cho hiện tượng quang tổng hợp.+ H2S

Hydro sulfide là một chất khí, được tạo thành dưới điều kiện kị khí Lượng độc H2S dù rất nhỏ( 0,001ppm) hiện diện trong thời gian liên tục có thể làm giảm sự sinh sản của tôm và phụ thuộc vào pH của nước, nếu pH thấp thì H2S rất độc Nồng độ H2S trong ao nuôi cho phép là 0.02mg/l Tuy nhiên H2S có thể loại bỏ khỏi ao nuôi bằng máy sục khí hoặc dùng KMnO4 để oxy hóa thành hợp chất sulfur không độc[12]+ Hợp chất của Nitơ:

Gồm 3 chất chính là ammoniac, nitrite và nitrate

Ammoniac : chỉ có dạng NH3( khí hòa tan) là gây độc cho ao hồ

+ Nhu cầu oxy hóa sinh học BOD: Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước BOD là lượng oxy cần thiết để oxy hóa các chất hữu cơ trong nước bằng vi sinh vật hiếu khí Quá trình này được gọi là quá trình oxy hóa sinh học BOD được dùng để đánh giá mức độ nhiễm hữu cơ của nước nuôi BOD càng cao thì ô nhiễm càng lớn BOD thích hợp cho nước nuôi tôm cá 5- 10 mg/l [12]

+ Nhu cầu oxy hóa học (COD): cũng được dùng để đánh giá mức độ nhiễm bẩn của nước nhưng không có sự tham gia của VSV COD là lượng oxy cần thiết cho quá trình oxy hóa toàn bộ các chất hữu cơ có trong nước thành CO2 và H2O bằng 1 chất oxy hóa mạnh COD thích hợp < 20mg/l [12]

Trong ao nuôi BOD, COD càng giảm càng tốt điều đó chứng tỏ nước nuôi tôm càng sạch.

6 Các phương pháp sinh học xử lý ô nhiễm môi trường trong nuôi trồng thủy sản.

Có nhiều phương pháp sinh học đã và đang được ứng dụng trong xử lý nước thải Tiêu biểu là việc sử dụng hệ sinh vật để phân hủy hoặc hấp thụ/ hấp phụ các chất ô nhiễm hữu cơ, vô cơ từ chất thải sản xuất và sinh hoạt như:

+ Sử dụng hệ vi sinh vật để phân hủy các chất hữu cơ trong chất thải+ Sử dụng hệ động thực vật thủy sinh để hấp thụ các chất hữu cơ.

6.1 Phương pháp sử dụng hệ vi sinh vậtMột số loài vi sinh vật có khả năng sử dụng

các chất hữu cơ, vô cơ làm nguồn dinh dưỡng và tạo ra năng lượng, các vi sinh vật này được sử dụng để phân hủy các chất ô nhiễm có trong nước nuôi trồng thủy sản [9]

+ Phương pháp hiếu khí: sử dụng nhóm vi sinh vật hiếu khí Để đảm bảo hoạt động sống của chúng cần cung cấp oxy liên tục cho chúng và duy trì ở 20- 400C

+ Phương pháp yếm khí: sử dụng các vi sinh vật yếm khí

6.2 Phương pháp sử dụng hệ động thực vật để hấp thụ các chất ô nhiễm.

Bản chất của việc sử dụng hệ động thực vật để loại bỏ các chất ô nhiễm dựa trên cơ sở của quá trình chuyển hóa vật chất trong hệ sinh thái thông qua chuỗi thức ăn Sử dụng hệ thực vật làm sinh vật hấp thụ các chất dinh dưỡng là N2, P, C, để tổng hợp các chất hữu cơ làm tăng sinh khối đó là tảo hay thực vật phù du, rong câu và các loài thực vật ngập mặn[11]

6.3 Các hệ thống xử lý ô nhiễm môi trường bằng các phương pháp sinh học6.3.1 Hệ thống xử lý bằng phương pháp hiếu khí

Tác nhân tham gia vào quá trình này là vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn bằng việc sử dụng bể sinh học Aroten hoặc các bể lọc sinh học[11]

Qúa trình diễn ra như sau:

- Bùn hoạt tính có trong nước thải từ các đầm nuôi tôm được đưa vào hệ thống xử lý.

- Tiến hành sục khí làm cho nước được bão hòa oxy và bùn hoạt tính ở trạng thái lơ lửng

- Bể lọc sinh học: là bể phản ứng sinh học trong đó vi sinh vật sinh trưởng và phát triển cố định trên một lớp màng bám trên các giá thể và nước thải được phân bố đều trên các giá thể

- Đĩa lọc sinh học: gồm một loạt các đĩa tròn lắp trên cùng một trục cách nhau 1 khoảng Khi trục quay một phần đĩa ngập trong hồ/ bể chứa nước thải, phần còn lại tiếp xúc với nước thải Các vi khuẩn bám trên đĩa lọc phân hủy các chất hữu cơ có trong nước thải

6.3.2 Hệ thống xử lý bằng phương pháp kị khí:

Phương pháp này sử dụng các vi sinh vật kỵ khí để phân hủy chất ô nhiễm cơ Hệ thống này không thích hợp cho xử lý ô nhiễm môi trường trong nuôi trồng thủy sản do chi phí xây dựng cao Tuy nhiên nó có ưu điểm là có thể giải phóng N2, giảm ô nhiễm NO3 cho nước mặt và nước ngầm.

7 Chế phẩm sinh học( probiotics)

Đây là công nghệ thân thiện với môi trường và đang có xu hướng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và Việt Nam Thuật ngữ probiotic được đề xuất năm 1965 để mô tả những chất sinh ra từ vi sinh vật có tác dụng tăng trưởng đối với vi sinh vật khác Năm 1969, R.Fuller định nghĩa rõ hơn:

Probiotics bao gồm vi sinh vật sống có tác dụng hữu ích cho động vật và người khi sử dụng Tác dụng bao gồm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột hay chất đối kháng làm giảm số lượng cá thể, hay tăng lượng kháng thể kích thích hệ thống miễn dịch hoặc là cung cấp những enzyme trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn.

7.1 Lợi ích của chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản

+ Sản xuất các hợp chất ức chế: vi khuẩn Probiotic sản sinh ra một loạt các hợp chất ức chế Chất ức chế bao gồm bacteriocins, sideropheres, lysozymes, protease, hydro peroxit Vi khuẩn lactic acid vv (LAB) được biết là để sản xuất các hợp chất như bacteriocins để ức chế các vi khuẩn khác [17]

+ Cạnh tranh vị trí bám dính: Vi sinh vật probiotic có khả năng cạnh tranh vị trí bám dính và cạnh tranh thức ăn với vi sinh vật gây bệnh trên bề mặt biểu mô ruột và cuối cùng ngăn chặn sự phát triển của chúng Khả năng bám dính cao, sinh trưởng trên hoặc trong niêm mạc ruột hoặc bên ngoài đã được chứng minh trong ống nghiệm với

vi khuẩn chỉ thị Vibrio anguillarum và Aeromonas hydrophila [17].

+ Cạnh tranh các chất dinh dưỡng: các vi sinh vật probiotic sử dụng các chất dinh dưỡng được tiêu thụ bởi các vi khuẩn gây bệnh Cạnh tranh chất dinh dưỡng có thể đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động sống của vi sinh vật của đường ruột hoặc môi trường xung quanh của sinh vật sống dưới nước [17].

+ Nguồn dinh dưỡng và sự tiết enzyme để tiêu hóa: các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vật probiotic tác động tích cực đối với quá trình tiêu quá của động vật dưới nước Đối với loài cá ,các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng Bacteroides và Clostridium sp

góp phần tổng hợp dinh dưỡng của vật chủ, đặc biệt là cung cấp acid béo và các

vitamin Một vài vi sinh vật như Agro- bacterium sp., Pseudomonas sp.,

Brevibacterium sp., Microbacterium sp…, và Staphylococcus sp có thể đóng góp

trình tiêu hóa của sinh vật hai mảnh vỏ bằng cách sản xuất enzym ngoại bào, như protease, lipases, cũng như cung cấp các chất tăng trưởng cần thiết [17].

+ Tăng cường đáp ứng miễn dịch: Hệ miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi các VSV probiotic Người ta đã chứng minh rằng uống bào của vi khuẩn

Clostridium Butyricum giúp cá hồi tăng cường sức đề kháng đối với vibriosis bằng cách tăng cường hoạt động thực bào của các bạch cầu Các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng sử dụng các chủng Bacillus( chủng S11) ngăn ngừa bệnh bằng cách kích hoạt cả

tế bào và dịch thể bảo vệ miễn dịch ở tôm sú(Penaeus monodon) Balcazar đã chứng minh rằng việc cho một hỗn hợp của các chủng vi khuẩn (Bacillus và Vibrio sp.) vào

thức ăn ảnh hưởng tích cực đến sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm trắng chưa

trưởng thành và biểu hiện tác dụng bảo vệ chống lại các mầm bệnh vi khuẩn Vibrio harveyi và hội chứng virus đốm trắng Tác dụng bảo vệ này là do sự kích thích của

hệ thống miễn dịch, bằng cách tăng thực bào (phagocytosis) và hoạt tính kháng khuẩn Ngoài ra, Nikoskelainen đã chứng mình việc cho acid lactic của vi khuẩn

Lactobacillus rhamnosus (chủng ATCC 53103) ở nồng độ l05 g/cfu, kích thích sự hô hấp mạnh mẽ ở cá hồi [17].

+ Ảnh hưởng đến chất lượng nước: vi sinh vật probiotic cũng có tác dụng cải thiện chất lượng nước trong ao, đầm nuôi thủy sản Điều này là do khả năng chúng sinh ra hàng loạt các enzyme phân giải như: protease, amylase, cellulase, lipase… phân giải các chất hữu cơ, các chất độc như NH3, NO2,NO3 Nồng độ các chất NH3, NH4+

trong ao, hồ cao gây ngộ độc cho tôm, cá Một số ví dụ như vi khuẩn Nitrosomonas, biến đổi amoniac thành nitrit và vi khuẩn khác như Nitrobacter, khoáng hóa nitrit

thành nitrate Vi khuẩn lưu huỳnh ôxi hóa carbon hữu cơ bằng cách sử dụng lưu huỳnh như là một nguồn phân tử oxy Các ion hydro được sản sinh khi các mảnh carbon hữu cơ bị oxy hóa được kết hợp với sulfat hình thành sulfide là ít độc hại cho các loài thuỷ sản vi khuẩn methane sử dụng carbon dioxide như là một nguồn phân

tử oxy Khí mê-tan khuếch tán vào không khí và do đó cải thiện chất lượng nước [17].

+ Tương tác với thực vật phù du: vi khuẩn Probiotic có một ảnh hưởng lớn đến nhiều loài vi tảo, đặc biệt là thủy triều đỏ sinh vật phù du Vi khuẩn đối kháng đối với tảo sẽ là bất lợi trong sản xuất giống tảo đơn bào [17]

+ Hoạt động kháng vi-rút: Một số vi khuẩn được sử dụng tạo chế phẩm probiotics có các hoạt động chống virút Mặc dù cơ chế chính xác của chúng vẫn chưa được biết đến, các xét nghiệm cho thấy sự bất hoạt virus có thể xảy ra bởi các hóa chất và các chất sinh học, chẳng hạn như chất chiết xuất từ tảo biển và các chất ngoại bào của vi

khuẩn Các nhà khoa học chỉ ra rằng các chủng Pseudomonas sp., Vibrios sp, Aeromonas sp, và Nhóm coryneforms phân lập từ cá hồi,… Cho thấy hoạt động

kháng virus chống lại virus trong lây nhiễm bệnh hoại tử tạo máu (IHNV) ở cá hồi giảm hơn 50% [17].

Thành phần của chế phẩm probiotic thường là tập hợp của các chủng vi sinh vật sống, được tuyển chọn, tối ưu hóa, làm khô bằng sấy phun, đóng khô hoặc bọc trong alginate Một thành phần khác được thấy trong chế phẩm probiotic đó là tập hợp các enzyme có nguồn gốc vi sinh như amylase, protease, lipase, cellulose… một số vit amin hoặc chất khoáng nhằm kích thích họat tính ban đầu của vi sinh vật và xúc tác cho hoạt động của enzyme trong môi trường

7.2 Nguyên tắc lựa chọn các chủng vi sinh vật được chọn làm chế phẩm sinh học[17]:

+ Không sinh độc tố, không gây bệnh cho vật chủ và không ảnh hưởng xấu tới hệ sinh thái và môi trường

+ Có khả năng bám dính niêm mạc đường tiêu hóa và các mô khác của vật chủ, cạnh tranh vị trí bám với vi sinh vật gây bệnh, không cho chúng tiếp xúc trực tiếp với các cơ quan trong cơ thể.

+ Có khả năng sinh ra các chất ức chế, ngăn cản sự sinh trưởng mạnh mẽ của các vi sinh vật gây bệnh

+ Có khả năng sinh trưởng nhanh, cạnh tranh thức ăn, hóa chất, năng lượng với các vi sinh vật có hại Ví dụ vi khuẩn probiotic có khả năng sinh siderphore, liên kết với ion sắt, làm cho vi sinh vật gây hại không sinh trưởng được vì thiếu sắt.

+ Tăng cường khả năng miễn dịch, tăng cường đáp ứng miễn dịch tự nhiên và khả năng tạo thành kháng thể.

+ Có khả năng cải thiện chất lượng nước ao nuôi do sự hình thành hàng loạt enzyme phân giải các chất hữu cơ, làm giảm hàm lượng BOD, giảm các khí độc như: NH3, H2S Không những thế, sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật probiotic còn cung cấp enzyme, các nguyên tố đa, vi lượng, giúp chúng sử dụng thức ăn hiệu quả hơn và do đó tăng trưởng tốt hơn.

7.3 Nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm sinh học:

Nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh: chúng có khả năng sinh enzyme phân hủy các chất hữu cơ: protease, amylase, celluase Ngoài chức năng phân hủy các chất hữu cơ chúng còn có tác dụng kiểm soát sự phát triển quá mức của các vi sinh vật gây bệnh qua cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng đồng thời chúng có khả năng tiết các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn giữ cho môi trường ở trạng thái cân bằng sinh học Nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh này bao gồm các loài thuộc chi Bacillus.

Nhóm vi khuẩn đóng vai trò tích cực trong kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trong môi trường nhờ chất đối kháng là nhóm vi khuẩn lactic Nhóm này 1 số thuộc chi Lactobacillus, Streptococus Ngoài ra chúng có tác dụng giảm mùi hôi thối của môi trường [19]

8 Bản chất của phương pháp sử dụng vi sinh vật trong công nghệ môi trường.8.1 Mục tiêu đạt được khi làm giảm ô nhiễm môi trường bằng vi sinh vật

+ Nhóm VSV hô hấp hiếu khí: các VSV thuộc nhóm này sử dụng O2 trong quá trình chuyển hóa chất hữu cơ.

+ Nhóm VSV hô hấp yếm khí: các VSV thuộc nhóm này hoạt động trong điều kiện không có oxy, ví dụ: vi khuẩn methane.

+ Nhóm VSV hô hấp tùy tiện: các VSV có thể hoạt động trong môi trường có hoặc

không có oxy Ví dụ: vi khuẩn thuộc Bacillus

Theo phương thức dị dưỡng có thể chia VSV thành 2 nhóm sau:

+ Nhóm VSV dị dưỡng: sử dụng nguồn cacbon hữu cơ( gluxit, lipit, protein…) để tổng hợp tế bào.

+ Nhóm VSV tự dưỡng: sử dụng nguồn cacbon vô cơ để tổng hợp tế bào Nguồn cacbon vô cơ chủ yếu là CO2 Ví dụ : các vi khuẩn lưu huỳnh

Cơ chế của quá trình chuyển hóa các chất ô nhiễm dưới tác động của VSV bao gồm 3 giai đoạn:

+ Qúa trình di chuyển các chất ô nhiễm từ pha lỏng đến bề mặt VSV nhờ quá trình khuếch tán phân tử, khuếch tán đối lưu.

+ Qúa trình di chuyển của cơ chất từ bề mặt VSV vào trong tế bào do sự chênh lệch nồng độ của cơ chất ở trong và ngoài tế bào.

+ Qúa trình di chuyển các hợp chất hữu cơ và vô cơ trong tế bào VSV sinh ra năng lượng và tổng hợp các tế bào mới sử dụng một phần năng lượng.

→ Mỗi loại chất ô nhiễm có những chủng VSV riêng thực hiện quá trình phân giải nên muốn xử lý có hiệu quả cần phải chọn đúng chủng VSV thích hợp Ngoài ra hoạt động sống của VSV phụ thuộc rất nhiều yếu tố vào môi trường như DO, pH, nhiệt độ… Cần nắm vững ảnh hưởng của các yếu tố này để tạo ra môi trường tối ưu cho VSV hoạt động [6]

8.1.1 Làm ổn định bùn thải để có thể sử dụng:

Bùn thải trong tự nhiên được chuyển hóa liên tục nhưng chậm Vì vậy phần lớn nó chưa được khoáng hóa và chưa thể sử dụng làm phân bón ngay được Qúa trình lên men VSV sẽ nhanh chóng làm ổn định bùn bằng những phản ứng sinh hóa và sản phẩm sau này có thể sử dụng trực tiếp làm phân bón.

8.1.2 Tiêu diệt các kí sinh trùng & VSV gây bệnh

Trong bùn thải rác thải có mặt rất nhiều của ký sinh trùng và VSV gây bệnh Sau 70 ngày lên men Biogaz thì 99% trứng giun bị tiêu diệt Chỉ số Ecoli cũng giảm xuống

Vi khuẩn gây bệnh lỵ cũng bị tiêu diệt sau 30 ngày Trong quá trình ủ hiếu khí phối trộn bùn, nhiệt độ của khối ủ tăng lên tiêu diệt phần lớn các VSV gây bệnh như: Salmonella typhi không phát triển ở 460C và bị tiêu diệt ở 55- 600C

8.1.3 Cải tạo chất dinh dưỡng

Các chất dinh dưỡng như ( N,K, P) có mặt trong bùn thải thường nằm ở dạng hữu cơ Sau quá trình xử lý VSV chúng trở thành những chất vô cơ như NH4+, NO3- rất thích hợp cho cây trồng được bón vào đất.

8.1.4 Thu nhận năng lượng dễ sử dụng dạng khí

90% các chất hữu cơ có thể chuyển hóa thành hỗn hợp khí sinh học qua quá trình xử lý kị khí Trong đó CH4 là khí chủ yếu chiếm 50-70% và được sử dụng như một nguồn nhiên liệu sạch

8.2 Cơ chế phân giải các hợp chất trong tự nhiên của VSV [1]8.2.1 Các hợp chất Cacbon:

C4- β-glucosidaza thủy phân xenlobioza thành glucoza

Các VSV phân giải xenluloza:

Nấm mốc Tricoderma, Aspergillus, Fusarium

Nhóm vi khuẩn hiếu khí: Pseudomonas, xenlulomonas

Nhóm kị khí sống trong dạ cỏ của động vật nhai lạiXạ khuẩn

+ Tinh bột

VSV phân giải tinh bột tiết ra môi trường hệ enzyme amylaza gồm:

α- amylaza tác động vào liên kết 1,4 glucozit, sản phẩm là các dextin, đường Mantoza và 1 ít glucose

β- amylaza chỉ có khả năng cắt đứt mối liên kết ở cuối phân tử tinh bột, cắt 2 gốc một, sản phẩm là đường Mantoza

glucoamylaza cắt cả liên kết α-1,4 và α-1,6 glucozit , sản phẩm là glucozaCác VSV phân giải tinh bột

Vi khuẩn: Bacillus subtilis, B.mesterices, PseudomonasVi nấm: Aspergillus candida

các VSV tham gia lên men lactic: đồng hình có Lactobaterium và Streptococus; lactic

dị hình qua con đường Pentozo Phosphate

8.2.2 Các hợp chất Nito Sự amon hóa Urê

Dưới tác động củ enzyme Ureeaza phân hủy ure thành cacbonat amon sau đó chuyển sang NH4+, hoặc NH3

Các VSV tham gia: Planosaricna ureae, Micrococus

Sự amon hóa protein

Dưới tác dụng của enzyme proteinaza, protein được phân giải thành các chuỗi polypetit và oligopeptit Sau đó, dưới tác dụng của enzyme peptidaza các polyeptit và oligopeptit sẽ được phân giải thành các axit amin Một phần axit amin sẽ được tế bào vi sinh vật hấp thụ làm chất dinh dưỡng Phần khác sẽ thông qua quá trình khử amin tạo thành NH3 và nhiều sản phẩm trung gian khác[1]

Nhóm VSV tham gia:

Vi khuẩn: Bacillus mycoides, B mesentericus, B.subtilis

Xạ khuẩn:StreptomycesVi nấm: Aspergillus oryzae

Quá trình Nitrat hóa:

Gồm 2 giai đoạn là nitrit hóa và nitrat hóaNitrit hóa:

NH4 + 3/2 O2 → NO2- + H2O+ 2H++ năng lượng

Các VSV tham gia: Nitrozomona, Nitrozolobus là các vi khuẩn tự dưỡng hóa năng

Quá trình phản nitrat hóa

Các vi sinh vật tham gia:

Nhóm tự dưỡng hóa năng: Thibacillus denitrificans, Hydrogenomonas agilis

Nhóm dị dưỡng: Pseudononas denitrificans, Micrococus denitrificans, Bacillus licheniformis

9 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong xử lý môi trường

Hiện nay trên thế giới các chế phẩm sinh học tăng cường xử lý nước thải, bùn thải công nghiệp, chế biến và nuôi trồng thủy sản đang được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới hư BZT, EPICIN, BRF2 của Mĩ, EM và Boski của Nhật, Vlmedin của Thái Lan [1]

Ở nước ta , đối với vấn đề ứng dụng chế phẩm VSV phục vụ nuôi trồng thủy sản: Trong những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóa chất trong môi trường thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học trong quá trình nuôi tôm đang phát triển mạnh Theo cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản, hiện có khoảng 200 thương hiệu chế phẩm sinh học và vitamin đang được bán trên thị trường nước ta Đa số các chế phẩm sinh học có nguồn gốc nhập ngoại và một số chế phẩm được sản xuất trong nước nhưng phần lớn các chế phẩm này chưa được công bố về nguồn gốc xuất xứ Hiện nay cũng chưa có nghiên cứu nào đánh giá việc đưa các chủng VSV ngoại nhập có phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam không? Có làm ảnh hưởng đến sự bền vững của hệ sinh thái môi trường hay không?

NH2OH →NH3 (amon hóa nitrat)NO3 → NO2 → NO

N2O→N2 (phản nitrat hóa)

Một số chế phẩm sinh học được sử ở Việt Nam ứng dụng xử lý môi trường nuôi tôm đang được thương mại hóa: ACCEL OBCđAG, AGROSTIMTM, VIME- Yucca, BIO- DIABAPES, ENVIRON- ACTM, BIOTIC For Shrimp, Super MAZAL ,EMS có tác dụng khử ô nhiễm bùn, nước , loại thải khí độc( NH3, H2S, NO2), phân hủy các chất thải và các chất hữu cơ, tăng nguồn dinh dưỡng, cải thiện hệ số chuyển hóa thức ăn, giảm chất cặn bã, độ acid ở đáy, ổn định pH, cho môi trường, ngăn ngừa dịch bệnh, tăng độ oxy hòa tan, kiểm soát các chất lư lửng trong nước [1]

II- ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN BACILLUS

1 Đặc điểm chung:

Bacillus là những vi khuẩn gram dương, nhóm vi khuẩn này được tìm thấy trong

môi trường pH có độ biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí

không bắt buộc Thuộc chi Bacillus, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi

Chúng có khả năng tạo bào tử khi xẩy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao…phần lớn tế bào có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở 1 đầu Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu Khi gặp điều kiện thuận lợi thì nảy mầm phát triển thành tế bào sinh dưỡng

Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình que, que có bào tử hình oval có khuynh

hướng phình ra một đầu

Một đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy, bao nhầy cấu tạo bởi các

polypeptit Việc hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn có thể chịu được các điều kiện khắc nghiệt là do bao nhầy có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi gặp khô hạn [2]

Bacillus tồn tại khắp nơi trong tự nhiên Tính dễ sống, dễ tồn tại là một lợi thế để sử dụng Bacillus làm chế phẩm sinh học Trong quá trình hình thành bào tử Bacillus

thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học như sản sinh ra các enzyme phân

hủy các chất hữu cơ là: enzyme amylase, protease, cellulose Bacillus là các cơ thể

hiếu khí thường phải kể đến là Bacillus subtilis, B mensentericus, B mycoides, B megaterium…

+Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí có bào tử có thể sống sót ở nhiệt độ cao B

subtilis có khả năng sinh tổng hợp riboflavin, tạo cho nó có khả năng cạnh tranh thức ăn với một số loài khác.

+B mensentericus: chúng có hoạt tính amylase, protease cao hơn B subtilis nhưng

khả năng lên men đường kém hơn Trong tự nhiên có thể sinh ra chất đối kháng với các sinh vật khác ức chế sinh vật gây bệnh và hoại sinh

+B megaterium : khuẩn lạc tròn đều, giống giọt nến, lồi, nhẵn, thường có vòng viền

quanh, màu trắng sữa Trong tế bào có nhiều giọt mỡ glycogel, bào tử hình oval hay hình trụ

2 Các đặc tính của Bacillus subtilisvà Bacillus licheniformis

2.1 Đặc tính cơ bản của Bacillus subtilis

+ Tế bao :hình que, xếp thành chuỗi, kích thước (2.0-2.5)µm x 0.6µm.

+ Khuẩn lạc: khô, màu trắng hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch

+ Bào tử: hình bầu dục, kích thước 1.2µm x 0.6µm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm.

+ Tính chất nhuộm màu: gram dương.+ Điều kiện sống: hiếu khí.

Hình 1 Hình thái vi khuẩn B subtilis Hình 2 Bào tử của B subtilis

2.2 Đặc tính cơ bản của Bacillus licheniformis

+ Tế bào hình que ( sau 2 ngày cấy)

+ Khuẩn lạc: hình tròn, dẹt, mép có răng cưa, giữa khuẩn lạc có màu trắng đục, xung quanh trắng trong, kích thước 1.2-2.5cm ( sau 2 ngày cấy)

+ Tính chất nhuộm: gram dương+ Điều kiện sống hiếu khí

Hình 3.Hình thái tế bào B licheniformis

2.3 Các ưu điểm nổi bật của Bacillus subtilisvà Bacillus licheniformis

Ngoài những ưu điểm chung của Bacillus như: tính phổ biến, dễ sống, sinh trưởng

trong vùng pH biến động, tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt… thì các chủng

thuộc loài Bacillus subtilis và Bacilluslicheniformis có những ưu điểm riêng so với

các chủng khác cùng loài và khác loài tiêu biểu như:

1, Sản sinh ra các hợp chất ức chế và điều chỉnh sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột.

+ Trong quá trình sinh trưởng, phát triển và sự trao đổi chất Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis có thể kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh thông

qua cơ chế cạnh tranh oxy, dinh dưỡng, vị trí bám dính và sản sinh một loạt các chất

kháng khuẩn, tiêu diệt các loài như Staphylococcus aureus, Candida albicans Các

chất kháng khuẩn này bào gồm riboflavin, Bacitracin, Iturins, polymyxin, nystatin,

gramicidin (Bacillus subtilis) và Bacitracin (Bacillus licheniformis) nhanh chóng đi vào bộ phận tiêu hóa, sau khi vi khuẩn thích ứng và sinh sản, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis nhanh chóng phát triển làm cạn kiệt oxy tự do của môi trường,

dẫn đến tình trạng thiếu oxy trong ruột thúc đẩy các vi khuẩn kỵ khí sinh lý đường

ruột như Bifidobacterium, Lactobacillus, Peptostreptococcus, Bacteroides, tăng

trưởng và sinh sản các chất như acid lactic và các axit hữu cơ khác, làm giảm giá trị

PH đường ruột, và gián tiếp ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác do đó điều chỉnh để khôi phục lại chức năng tiêu hóa [17]

2, Sản sinh ra nhiều loại enzyme tiêu hóa động vật và làm tăng hoạt động của chúng.

+ Các vi khuẩn Bacillus subtilis và Bacilluslicheniformis có thể sản xinh ra nhiều loại

enzym hoạt động, như protease, amylase, lipase, enzyme cellulase pectinase, glucanase, mà còn tạo ra một loạt các yếu tố enzyme và thúc đẩy các hoạt động của các enzym tiêu hóa ở động vật, và thúc đẩy sự tăng trưởng của vật nuôi để cải thiện việc sử dụng thức ăn Mặt khác khi các vi khuẩn này tồn tại trong ao nuôi chúng sẽ phân hủy các thức ăn thừa của tôm, giúp cải thiện chất lượng ao nuôi tôm [15]

3, Kích thích tăng trưởng ở vật nuôi và phát triển các cơ quan miễn dịch để kích hoạt các lymphoT, B Nâng cao mức globulin miễn dịch và kháng thể, tăng cường miễn dịch trung gian tế bào và chức năng miễn dịch dịch thể, nâng cao khả năng miễn dịch của vật nuôi [20]

3 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus

Dựa vào những đặc điểm đã được nghiên cứu về các chủng vi khuẩn Bacillus người ta thấy rằng các vi khuẩn Bacillus này đều không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại

trong môi trường đất và nước nghèo dinh dưỡng Đặc biệt chúng có khả năng phân hủy thức ăn thừa của tôm, phế thải hữu cơ, làm sạch môi trường nhờ enzyme do chúng tổng hợp được Ngoài ra chúng có khả năng chúng có khả năng sinh ra các chất

kháng khuẩn như , Bacitracin, Iturins, polymyxin, nystatin, gramicidin (Bacillus subtilis) và Bacitracin (Bacillus licheniformis) là các chất kháng sinh được dùng trong

chăn nuôi để nâng cao hiệu suất tăng trưởng, hiệu suất sử dụng thức ăn cho gia súc, làm giảm sự phát triển của vi sinh vật có hại Lợi dụng những đặc điểm này người ta đã sản xuất một số chế phẩm vi sinh cải thiện cải thiện môi trường nước nuôi tôm.

Các chủng Bacillus có hoạt tính protease cao được dùng trong công nghiệp chế biến sữa, làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi chế biến Các chủng thuộc loài B subtilis và B Licheniformis có hoạt tính enzyme proteaza cao nên được bổ sung vào

các loại nước tẩy rửa và bột giặt nhằm loại bỏ các chất bẩn có nguồn gốc protein [22]

B subtilis được ứng dụng làm thuốc chống rối loạn tiêu hóa cho người và động vật

4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

+ Nguồn dinh dưỡng: C, N, muối khoáng Nito được cung cấp vào môi trường nuôi cấy

như cao thịt, peptone, cao men Các nguyên tố đa lượng và vi lượng cho vi sinh vật cung cấp dưới dạng muối khoáng

+ Sự sinh trưởng và phát triển của VSV không những phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mà còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: nhiệt độ, pH,

oxy hòa tan…Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm Bacillus có thể phát triển ở nhiệt độ cao, nhưng phát triển tốt ở nhiệt

III- QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM [8]

1 Vai trò của quy hoạch thực nghiệm

Nhiều công trình nghiên cứu khoa học công nghệ thường dẫn đến giải bài toán cực trị, tìm điều kiện tối ưu để tiến hành các quá trình hoặc lựa chọn thành phần tối ưu để tiến hành quá trình Chẳng hạn, khi xem xét các quá trình CN hóa học mới, nhiệm vụ nghiên cứu thường là thay đổi nhiệt độ, áp suất và tỉ lệ các chất phản ứng để tìm hiệu suất phản ứng cao nhất, tính toán, lựa chọn giá trị thích hợp nhất của các thông số cấu trúc và động học nhằm đạt đến chất lượng làm việc và hiệu quả kinh tế cao nhất Những bài toán này thường giải quyết ở mức độ nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hệ, lập mô hình biểu diễn mối phụ thuộc giữa các phần tử của hệ, điều khiển hệ theo mục đích cho trước, hoặc đưa về trạng thái tối ưu theo những chỉ tiêu đánh giá đã chọn Thông thường các hệ cần điều khiển và tối ưu rất phức tạp, đối tượng nghiên cứu ngày càng đa dạng, hệ thống trở lên phức tạp hơn với số yếu tố tác động và chỉ tiêu đánh giá ngày càng lớn Mối quan hệ

giữa các thành phần trong hệ thống càng không thể mô tả bằng hàm lý thuyết Vì vậy đa số các bài toán cực trị được giải quyết bằng thực nghiệm [8]

Ngày nay người ta thường đề cập tới phương pháp kết hợp lý thuyết và thực nghiệm Có thể nói, lý thuyết quy hoạch thực nghiệm từ khi ra đời đã thu hút sự quan tâm và nhận được nhiều đóng góp hoàn thiện của các nhà khoa học

Vai trò của quy hoạch thực nghiệm so với thực nghiệm cổ điển là:

+ Giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết.

+ Hàm lượng thông tin nhiều hơn rõ rệt, nhờ đánh giá được vai trò qua lại giữa các yếu tố và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu Nhận được mô hình toán học thống kê thực nghiệm theo các tiêu chuẩn tối ưu, đánh giá được sai số của quá trình thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê cho phép xét ảnh hưởng của các yếu tố với mức độ tin cậy cần thiết.

+ Cho phép xác định được điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu một cách chính xác bằng các công cụ toán học, thay cho cách giải gần đúng, tìm tối ưu cục bộ như các thực nghiệm thụ động.

2 Những khái niệm cơ bản của quy hoạch thực nghiệm

2.1 Định nghĩa quy hoạch thực nghiệm

+ Là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm thí nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình làm thí nghiệm( từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng[8]

2.2 Đối tượng của quy hoạch thực nghiệm trong các ngành công nghệ

+ Là một quá trình hoặc hiện tượng nào đó có tính chất, đặc điểm chưa biết cần nghiên cứu Người nghiên cứu có thể chưa hiểu biết đầy đủ về đối tượng , nhưng đã có một số thông tin tiên nghiệm, ảnh hưởng đến tính chất đốiy tượng Ta có thể hình dung chúng như một hộp đen

Z Y

2.3 Các phương pháp quy hoạch thực nghiệm

+ Thực nghiệm sàng lọc: là thực nghiệm mà nhiệm vụ của nó là tách những yếu tố ảnh hưởng đáng kể ra khỏi những yếu tố đầu vào để tiếp tục nghiên cứu chúng trong các thực nghiệm cần thiết [8]

+ Thực nghiệm mô phỏng: là thực nghiệm liên quan tới việc mô phỏng hiện tượng cần nghiên cứu Có nhiều dạng mô phỏng, ở đây chỉ quan tâm đến dạng thực nghiệm được hoàn tất bằng mô hình hồi quy đa thức [8]

+ Thực nghiệm cực trị: là thực nghiệm được phát triển từ thực nghiệm mô phỏng Nhiệm vụ của nó là xây dựng mô hình toán thực nghiệm, theo đó xác định giá trị tối ưu của hàm mục tiêu và các tọa độ tối ưu của hàm Nói cách khác là xác định bộ kết hợp giá trị các yếu tố mà tại đó hàm tiêu đạt được cực trị Đây chính là phương pháp được lựa chọn trong đề tài này [8]

2.4 Ma trận kế hoạch thực nghiệm

+ Là dạng mô tả chuẩn các điều kiện tiến hành thí nghiệm( các điểm thí nghiệm) theo bảng chữ nhật, mỗi hàng là một thí nghiệm( còn gọi là phương án kết hợp các yếu tố đầu vào), các cột ứng với các yếu tố đầu vào [8]

2.5 Các nguyên tắc cơ bản của quy hoạch thực nghiệm

2.5.1 Nguyên tắc không lấy toàn bộ trạng thái đầu vào

+ Để có thông tin toàn diện về tính chất hàm mục tiêu về nguyên tắc cần tiến hành vô số các thí nghiệm trong miền quy hoạch

Về lý thuyết nếu không tiến hành tất cả các thí nghiệm đó có thể bỏ sót đặc điểm nào đó Qúa trình

làm việc hệ thống

của hàm mục tiêu, tuy nhiên thực tế không thể thực hiện được điều này Do vậy người nghiên cứu chỉ có thể lấy những giá trị rời rạc, chọn mức biến đổi nào đó cho các yếu tố Sự lựa chọn này cần có cơ sở khoa học, nó gắn liền với sự lựa chọn dạng hàm, tức dạng mô phỏng của bề mặt đáp ứng Dạng thông thường là bậc một hoặc bậc 3 và số mức biến đổi thường là bậc 2 hoặc bậc 3 [8]

2.5.2 Nguyên tắc phức tạp dần mô hình toán học

Khi chưa có thông tin ban đầu về các tính chất của hàm mục tiêu, thì không xây dựng mô hình phức tạp của đối tượng để tránh lãng phí vô ích về thời gian, phương tiện vật chất nếu không dùng đến mô hình đó Vì thế lý thuyết quy hoạch thực nghiệm hướng dẫn nên bắt đầu từ những mô hình đơn giản nhất, ứng với những thông tin ban đầu đã có về đối tượng [8]

+ Logic tiến hành thực nghiệm là nên làm ít thí nghiệm để có mô hình đơn giản( ví dụ mô hình tuyến tính), kiểm tra tính tương hợp của mô hình

- Nếu mô hình tương hợp, kiểm tra tính tương hợp của mô hình

- Nếu mô hình không thì tiến hành giai đoạn tiếp theo của thực nghiệm: làm những thí nghiệm mới, bổ sung để rồi nhận được mô hình phức tạp hơn ( ví dụ mô hình phi tuyến), kiểm tra mô hình mới cho đến khi đạt được mô hình hữu dụng.

2.5.3 Nguyên tắc đối chứng với nhiễu

+ Độ chính xác của mô hình phải tương xứng với cường độ nhiễu ngẫu nhiên mà chúng tác động lên kết quả đo hàm mục tiêu Trong cùng điều kiện như nhau, độ nhiễu càng nhỏ thì mô hình càng phải chính xác, phải phức tạp hơn [8]

+ Bằng các công cụ thống kê toán học, người ta xây dựng hoàn chỉnh các quy trình chuẩn theo các tiêu chuẩn thống kê để giải quyết các nhiệm vụ xác định tính tương hợp của mô hình tìm được, hiệu chỉnh dạng mô hình, kiểm tra tính đúng đắn của các giả thiết, các tiên đề mà từ đó tìm ra các mô hình [8]

2.6 Các bước quy hoạch thực nghiệm cực trị

Trong bài toán tối ưu hóa này ta lựa chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm cực trị Vậy trước khi tiến hành quy hoạc thực nghiệm ta cần biết các bước quy hoạch thực nghiệm cực trị.

2.6.1 Chọn thông số nghiên cứu

+ Lựa chọn các yếu tố ảnh hưởng chính, loại bớt những yếu tố không cần thiết, nhằm đảm bảo tính khả thi và hiệu quả thí nghiệm

+ Lựa chọn chỉ tiêu( mục tiêu) đánh giá đối tượng, sao cho các chỉ tiêu này vừa đáp ứng các yêu cầu của phương pháp quy hoạch thực nghiệm, vừa đại diện nhất cho các điều kiện tối ưu của đối tượng nghiên cứu.

+ Căn cư vào số yếu tố ảnh hưởng chính, chỉ tiêu đánh giá, mục đích nhiệm vụ thực nghiệm, vì tính hiệu quả và khả năng làm việc của các mô hình hồi quy phụ thuộc nhiều vào kết quả xác định yếu tố đầu vào của chúng [8]

2.6.2 Lập kế hoạch thực nghiệm

+ Chọn dạng kế hoạch thí nghiệm phù hợp với điều kiện tiến hành thí nghiệm và với đặc điểm các yếu tố của đối tượng.

+ Mỗi dạng kế hoạch thí nghiệm đặc trưng bởi các chuẩn tối ưu và tính chất khác nhau

2.6.3 Tiến hành thí nghiệm nhận thông tin2.6.4 Xây dựng và kiểm tra mô hình thực nghiệm

+ Sử dụng phương pháp phân tích hồi quy, phân tích phương sai để xác định các hệ số trong phương trình hồi quy đa thức, kiểm tra mô hình theo độ tương thích và khả năng làm việc Tùy theo dạng thực nghiệm mà mô hình là tuyến tính hay phi tuyến.

+ Mô hình bậc hai phi tuyến:

Trong đó B= [bo, b1 ,b2, bk, b11, b12, …bjj…] là các hệ số hồi quy

+ Mô hình thống kê thực ngiệm chỉ có thể sử dụng sau khi đã thỏa mãn các tiêu chuẩn thống kê ( Student và Fisher) [8]

3 Phần mềm quy hoạch thực nghiệm Design Expert

+ Đây là phần mềm thiết kế thí nghiệm được ứng dụng rộng rãi trong các nghành khoa học như: hóa học, thực phẩm& sinh học, vật liệu, cơ khí

+ Phần mềm được thiết kế dựa trên những ứng dụng của lý thuyết xác suất thống kê và thống kê toán học và lý thuyết quy hoạch thực nghiệm[21]

Ưu điểm của phần mềm là:

+ Giúp người nghiên cứu giảm bớt đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết, điều này rất quan trọng vì giúp ta tiết kiệm công sức, chi phí nguyên vật liệu ,thời gian thí nghiệm có ý nghĩa lớn về mặt kinh tế.

+ Design Expert cho phép lựa chọn được các mô hình toán học trong đó có sự tương

tác giữa các biến( các yếu tố) đến hàm mục tiêu bằng phương pháp đáp ứng bề mặt mô phỏng bằng không gian 3 chiều , cho biết mô hình có thực tế hay không thông qua cảnh báo mà các phần mềm khác như MS.Excel hay IRRISTAT không làm được Đặc biệt có thể phân tích tối đa 999 hàm mục tiêu cùng với số biến lên đến 50 [21]

+ Design expert đưa ra hàng loạt các dự báo xác định được điều kiện tối ưu cho cả bài toán 1 mục tiêu hay đa mục tiêu giúp người thực nghiệm có thể tìm được đáp án phù hợp với điều kiện thí nghiệm của mình [21]

Hình 4 Giao diện của phần mềm Design Expert 8.0.4

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU