I. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 1 Đối tượng nghiên cứu:
1. Phương pháp tuyển chọn chủng có hoạt tính cao.
1.1.Tuyển chọn chủng có hoạt tính protease
Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease trên môi trường thạch bổ sung 5% sữa gầy, 3% NaCl và thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó đổ vào hộp peptri đã thanh trùng. Các chủng vi khuẩn được cấy chấm điểm trên đĩa thạch. Nuôi trong tủ ấm 30-350C. Theo dõi ở 48h và 72h, tại mỗi thời điểm này đem các hộp peptri có cấy chấm điểm các chủng cần thử hoạt tính xác định vòng phân giải. khi VK phát triển trên môi trường thạch sẽ sinh ra protease ngoại bào, enzyme này thủy phân casein có
Thành phần Khối lượng(g/l)
Tinh bột tan 10
NaCl 30
Agar 10
trong sữa thành các peptide và axid min. Do vậy xung quanh vùng thủy phân sẽ tạo thành một vòng tròn thủy phân có màu trong suốt so với nền đục xung quanh( do sữa tạo thành). Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng phân giải.[2]
1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính amylase cao
Kiểm tra khả năng sinh amylase trên môi trường thạch bổ sung 1% tinh bột, 3% NaCl và thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó đổ vào hộp peptri đã thanh trùng. Các chủng vi khuẩn được cấy chấm điểm trên đĩa thạch. Nuôi trong tủ ấm 30-350C. Theo dõi ở 48h và 72h, tại mỗi thời điểm này đem các hộp peptri có cấy chấm điểm các chủng cần thử hoạt tính nhỏ dung dịch I2 0,1N để xác định vòng phân giải. Khi vi khuẩn phát triển trên môi trường thạch sẽ giải phóng ra các enzyme amylase ngoại bào, enzyme này sẽ thủy phân tinh bột tan thành đường. Do vậy khi nhỏ I2 vào đĩa thạch xung quanh vùng thủy phân sẽ tạo thành vòng tròn thủy phân có màu môi trường trong suốt so với nền xanh đen xung quanh( do I2 kết hợp với tinh bột tạo thành). Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng phân giải tạo thành. [2]
1.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao:
Kiểm tra hoạt tính enzyme môi trường thạch có bổ sung 0,5% CMC, 3% NaCl thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó đổ vào hộp peptri đã thanh trùng. Các chủng vi khuẩn được cấy chấm điểm trên đĩa thạch. Nuôi trong tủ ấm 30-350C. Theo dõi ở 48h và 72h, tại mỗi thời điểm này đem các hộp peptri có cấy chấm điểm các chủng cần thử hoạt tính nhỏ dung dịch Lugol 0,1N để xác định vòng phân giải. Khi vi khuẩn phát triển trên môi trường thạch sẽ giải phóng ra enzyme cellulose ngoại bào, enzyme này thủy phân cellulose tan trong môi trường thành đường. Do vậy khi nhỏ Lugol vào đĩa thạch xung quanh vùng thủy phân sẽ tạo thành 1 vòng tròn thủy phân có mầu môi trường trong suốt so với màu nâu xung quanh( do KI kết hợp với tinh bột tạo thành). Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng phân giải tạo thành[14]
1.4. Xác định khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn
Do môi trường nước nuôi tôm là nước lợ và nước mặn nên việc xác định khả năng chịu muối của các chủng rất quan trọng. Nó quyết định khả năng tồn tại của các vi khuẩn trong môi trường nước nuôi tôm đồng thời ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng chế phẩm
Môi trường kiểm tra khả năng chịu mặn là môi trường NB có bổ sung NaCl với các nồng độ tương ứng là 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 9%. Sau 36h đánh giá khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn Bacillus thông qua chỉ só mật độ OD 620nm và CFU/ml[14]