khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết tương gia cầm theo thời gian bằng phương pháp hplc

Hằng số phân bố của một chất cho biết khả năng hòa tan của chất đó với hai pha lỏng không hòa tan vào nhau tại thời điểm cân bằng, hệ số phân bố của một chất ít thay đổi theo nhiệt độ và

  

NGUYỄN VĂN NHỚ

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG CỦA DOXYCYCLINE TRONG HUYẾT TƯƠNG GIA CẦM THEO THỜI GIAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA DƯỢC

Cần thơ, 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC

NGUYỄN VĂN NHỚ

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG CỦA

DOXYCYCLINE TRONG HUYẾT TƯƠNG GIA CẦM THEO THỜI GIAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS NGUYỄN TRỌNG TUÂN

Cần thơ, 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Năm học 2013-2014

Đề tài: “Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết tương

gia cầm theo thời gian bằng phương pháp HPLC”

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là Nguyễn Văn Nhớ, là tác giả của Luận văn xin xác nhận đã chỉnh sửa hoàn chỉnh theo những ý kiến và góp ý của các Thầy, Cô phản biện và Hội đồng chấm bảo vệ luận văn

Cần thơ, ngày 25 tháng 12 năm 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập - Tự Do - Hạnh phúc

BỘ MÔN HÓA HỌC -   -

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: TS Nguyễn Trọng Tuân

2 Đề tài: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết

tương gia cầm theo thời gian bằng phương pháp HPLC

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Nhớ

MSSV: 2102468 Lớp: Hóa Dược – Khóa 36

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

b Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

c Nhận xét đối tượng sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

d Kết luận, đề nghị, điểm:

Cần thơ, ngày… tháng… năm 2013

Cán bộ chấm hướng dẫn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập - Tự Do - Hạnh phúc

BỘ MÔN HÓA HỌC -   -

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện:

2 Đề tài: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết

tương gia cầm theo thời gian bằng phương pháp HPLC

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Nhớ

MSSV: 2102468 Lớp: Hóa Dược – Khóa 36

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

b Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

c Nhận xét đối tượng sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

d Kết luận, đề nghị, điểm:

Cần thơ, ngày… tháng… năm 2013

Cán bộ chấm phản biện

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô đặc biệt là thầy cô bộ môn hóa học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại Học Cần Thơ, các Thầy, Cô đã truyền đạt tận tình cho em kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian

em theo học tại trường

Em xin chân thành cảm ơn Cô, Chú, Anh, Chị công tác tại Trung Tâm R&D

đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo công ty Vemedim đã chấp nhận và tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn này

Một lần nữa em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình đã động viên giúp đỡ con thực hiện luận văn này Cùng tất cả các bạn sinh viên ngành Hóa dược, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại Học Cần Thơ đã hỗ trợ nhiệt tình và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn!

Cần thơ, ngày tháng năm 2013

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Văn Nhớ

TÓM TẮT

Đối với mỗi loại dược phẩm thì việc xác định các chỉ số dược động học rất

cần thiết Đề tài “Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết

tương gia cầm theo thời gian bằng phương pháp HPLC” được thực hiện nhằm

xác định hàm lượng doxycycline trong huyết tương gia cầm sau khi sử dụng thuốc Từ đó tạo cơ sở khoa học sử dụng doxycycline đúng, hợp lý, an toàn và hiệu quả Đề tài được thực hiện bằng phương pháp chiết pha rắn SPE và sau đó được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Qua quá trình thực hiện đề tài đã thu được các kết quả: xác định được hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết SPE, H% = 96,7%, giá trị LOD = 0,18, LOQ = 0,6, RSD = 6,18, R = 0,999 của phương pháp HPLC

Nồng độ doxycycline trong huyết tương đạt mức cao nhất ở thời điểm 2 giờ sau khi sử dụng thuốc và sau 48 giờ vẫn còn tồn tại trong máu nên cần chú ý đến thời gian ngưng sử dụng thuốc trước khi giết

Từ khóa: HPLC, SPE, doxycycline

ABSTRACT

For each drug, the determination of pharmacokinetic indices are necessary The project “Survey changes in content of plasma doxycycline birds over time by HPLC method” was implemented in order to determine the concentration of doxycycline in plasma of poultry after use drug From that point, we create a true, reasonable, safe and effective scientific basis of using doxycycline The topic is performed by using Solid Phase Extraction method and quantified by High Performance Liquid Chromatography

The results of the topic are: determining the efficiency of recovery of the SPE extraction method, H% = 96.7%, the values of LOD = 0,18, LOQ = 0,6, RSD = 6,18, R = 0,999 of the HPLC method

The concentration of Doxycycline in plasma is peak at 2 hours after using drugs and still exists in the blood after 48 hours Therefore, we need to pay attention to the time of discontinuation of using drugs before killing

Key words: HPLC, SPE, doxycycline

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan kết quả luận văn này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm của tôi và các kết quả nghiên cứu này chưa được dung cho bất

kì luận văn cùng cấp nào

Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2013

Sinh viên cam đoan

Nguyễn Văn Nhớ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮC ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Nội dung đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Sơ lược về doxycycline 3

2.1.1 Cấu tạo 3

2.1.2 Tính chất 3

2.1.3 Phương pháp xác định 5

2.2 Phương pháp chiết tách 6

2.2.1 Chuẩn bị mẫu phân tích 6

2.2.2 Một số phương pháp chiết tách 7

2.3 Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 16

2.3.1 Lịch sử phát triển HPLC 16

2.3.2 Khái niệm và nguyên tắc hoạt động của HPLC 17

2.3.3 Phân tích định tính 22

2.3.4 Phân tích định lượng 22

2.3.5 Hiệu suất thu hồi 25

2.3.6 Xác định RSD, LOD, LOQ 25

2.3.7 Các thông số đặc trưng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao 27

2.3.8 Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 28

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Phương tiện nghiên cứu 29

3.1.1 Thiết bị 29

3.1.2 Dụng cụ 29

3.1.3 Hóa chất 29

3.2 Thực nghiệm 29

3.2.1 Địa điểm tiến hành 29

3.2.2 Bố trí thí nghiệm và lấy mẫu 29

3.2.3 Khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ của doxycycline 31

3.2.4 Xác định hiệu suất thu hồi 33

3.2.5 Khảo sát sự thay đổi hàm lượng doxycycline trong huyết tương gia cầm theo thời gian 35

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Kết quả khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ của doxycycline 37

4.2 Kết quả tính hiệu suất thu hồi 38

4.3 Kết quả khảo sát sự thay đổi hàm lượng doxycycline trong huyết tương gia cầm theo thời gian 39

4.3.1 Mẫu tiêm (IM 10) 39

4.3.2 Mẫu uống (PO 10, PO 20, PO 30) 41

Chương 5 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 49

Kết luận 49

Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công thức cấu tạo doxycycline 3

Hình 2.2 Sơ đồ chiết Soxhlet 9

Hình 2.3 Hình dạng cột SPE 11

Hình 2.4 Cấu tạo bộ chiết SPE 12

Hình 2.5 Các bước tiến hành kỹ thuât chiết SPE 14

Hình 2.6 Hệ thống HPLC 18

Hình 2.7 Đồ thị phương pháp ngoại chuẩn 23

Hình 3.1 Trại thử nghiệm, công ty Vemedim, quận Ô Môn, TP.Cần Thơ 30

Hình 3.2 Lấy mẫu máu từ trại thực nghiệm 31

Hình 3.3 Cân phân tích 4 số 32

Hình 3.4 Hệ thống HPLC 33

Hình 3.5 Quy trình chiết doxycycline bằng phương pháp SPE 34

Hình 3.6 Hệ thống máy cô quay chân không 35

Hình 3.7 Máy siêu âm 35

Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn phương trình đường chuẩn của doxycycline 37

Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ doxycycline trong huyết tương theo thời gian mẫu IM 10 40

Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ doxycycline trong huyết tương theo thời gian mẫu PO 10 42

Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ doxycycline trong huyết tương theo thời gian mẫu PO 20 44

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ doxycycline trong huyết tương theo thời gian mẫu PO 30 46

Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ doxycycline trong huyết tương theo thời gian mẫu: IM 10 , PO 10, PO 20 và PO 30 47

gia cầm mẫu IM 10 39 Bảng 4.5 Kết quả phân tích hàm lượng doxycycline trong huyết tương

gia cầm mẫu PO 10 41 Bảng 4.6 Kết quả phân tích hàm lượng doxycycline trong huyết tương

gia cầm mẫu PO 20 43 Bảng 4.7 Kết quả phân tích hàm lượng doxycycline trong huyết tương

gia cầm mẫu PO 30 45

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tên ACN Acetonitrile EDTA Etilendiamin tetraacetic axit

GC Gas Chromatography

HPLC High performance liquid

chromatography

LC Liquid Chromatography LOD Limit of detection LOQ Limit of quantitation Mẫu PT Mẫu phân tích Mẫu T Mẫu trắng MeOH Methanol ppm Parts Per milion RSD Relative Standard Deviation

SD Standard Deviation SPE Solid phase extraction

SPME Solid Phase Micro

Extraction TFA Trifluoroacetic acid THF Tetra Hidro Furan TLC Think layer chromatography

TT Thể trọng UV-VIS Ultraviolet-Visible

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay ở nước ta, việc nghiên cứu sinh dược học của thuốc là một lĩnh vực tương đối mới, đang ngày càng được quan tâm Một trong những vấn đề đánh giá sinh dược học của thuốc là mức độ hấp thu thuốc và nồng độ thuốc đạt được trong huyết tương Thuốc kháng sinh được sử dụng ngày càng nhiều vào các mục đích: phòng, trị bệnh cho người và vật nuôi Tuy nhiên trong chăn nuôi, do thiếu hiểu biết, người chăn nuôi đã sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị chưa đúng nguyên tắc, không có cơ sở khoa học dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng như:

- Tạo sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, giảm hiệu lực của thuốc, gây khó khăn cho công tác phòng và điều trị

- Ngoài việc có thể gây độc hại cho gia súc, thuốc kháng sinh còn tồn lưu trong thịt, trứng, sữa ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm chăn nuôi

và gây hại cho sức khoẻ người tiêu dùng

Trong số rất nhiều các loại kháng sinh đang lưu hành trên thị trường, doxycycline là loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm tetracycline có hoạt phổ kháng khuẩn rộng đang được sử dụng rộng rãi trong việc phòng trị bệnh cho vật nuôi, đặc biệt ở gia súc gia cầm

Vấn đề đặt ra là tồn dư của kháng sinh trong gia súc gia cầm ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng và môi trường, là một trong những nguyên nhân gây bệnh cho con người và làm tăng nguy cơ xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các chủng vi sinh vật, đặc biệt vi sinh vật gây bệnh Xuất phát từ nhu cầu trên của

thực tiễn, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của

doxycycline trong huyết tương gia cầm theo thời gian bằng phương pháp HPLC” với sự giúp đỡ của Công ty Cổ Phần sản xuất Kinh Doanh Vật Tư và

Xác định hàm lượng thuốc trong huyết tương gia cầm sau khi tiêm thuốc

Từ đó tạo cơ sở khoa học sử dụng doxycycline đúng, hợp lý, an toàn và hiệu quả

1.3 Nội dung đề tài

Phân tích định tính

Dựa vào HPLC để phân tích định tích doxycycline dựa vào thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn

Phân tích định lượng

Xây dựng đường chuẩn

Tính toán hiệu suất thu hồi

Xác định giới hạn phát hiện (LOD)

Xác định giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành định lượng doxycycline trong huyết tương của các mẫu tiêm (IM 10) và mẫu uống (PO 10, PO 20, PO 30) ở những khoảng thời gian khác nhau

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 Sơ lược về doxycycline

2.1.1 Cấu tạo

Công thức phân tử: C22H24N2O8,H2O

Khối lượng phân tử: 462.5 g/mol

Công thức cấu tạo:

3

44a55a

12a6

78

Tên khác: 6-deoxy-5-oxytetracycline

2.1.2 Tính chất [1], [2]

2.1.2.1 Tính chất vật lý

Doxycycline dạng bột tinh thể màu vàng, có vị đắng

Tan rất ít trong nước nhưng tan nhiều trong acid loãng hoặc trong hydroxyd kiềm loãng và tan vừa phải trong ancol, không tan trong cloroform và ether Nhiệt độ nóng chảy 201oC

Nhiệt độ sôi 685,2oC

2.1.2.2 Tính chất hóa học

Phát huỳnh quang trong môi trường kiềm

Nhóm dimethylamin ở vị trí 4 tạo nên tính kiềm Cũng như các kháng sinh thuộc họ tetracycline khác thì khi kết hợp với các ion hóa trị 2 và 3 (Fe3+, Cu2+,

Fe2+, Co2+, Zn2+) cho ra phức chelate không tan, kém hấp thu qua ruột

Cho phản ứng tạo màu với Fe3+

Dược động học [3]

Hấp thu: Doxycyclin được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa (95% liều uống),

nồng độ huyết tương tương đương khi uống hoặc tiêm doxycyclin Vì các tetracyclin dễ phức hợp với các cation hóa trị 2 hoặc hóa trị 3, như calci, magnesi, nhôm, nên các thuốc có chứa các cation nói trên, cũng như thức ăn và sữa có chứa calci đều làm ảnh hưởng đến hấp thu doxycyclin

Phân bố: Doxycyclin phân bố rộng trong cơ thể vào các mô và dịch tiết,

gồm cả nước tiểu và tuyến tiền liệt Thuốc tích lũy trong các tế bào lưới - nội mô của gan, lách, và tủy xương, và trong xương, ngà răng, và men răng chưa mọc

Chuyển hóa: Có thể uống doxycyclin 2 lần/ngày, vì thuốc có thời gian bán

thải dài (15 - 20 giờ) Phần lớn các tetracyclin thải trừ chủ yếu qua thận, mặc dù tetracyclin cũng được tập trung ở gan và thải trừ qua mật vào ruột, và chúng lại được tái hấp thu một phần qua sự tái tuần hoàn ruột - gan Có sự khác biệt quan trọng trong trường hợp doxycyclin là doxycyclin không thải trừ giống như các tetracyclin khác, mà thải trừ chủ yếu qua phân, thứ yếu qua nước tiểu (qua thận),

và không tích lũy nhiều như các tetracyclin khác ở người suy thận, do đó là một trong những tetracyclin an toàn nhất để điều trị nhiễm khuẩn ở người bệnh này

Tác dụng: Doxycycline là kháng sinh phổ rộng có tác dụng kìm khuẩn,

thuốc ức chế vi khuẩn tổng hợp protein đồng thời thuốc có thể gây thay đổi ở màng bào tương, doxycycline có phạm vi kháng khuẩn rộng với vi khuẩn ưa khí

và kỵ khí, gram âm và gram dương và cả một số vi khuẩn kháng thuốc tác dụng

với màng tế bào như: Rickettsia, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, Mycobacterium,…

Doxycycline không có tác dụng trị nấm lâm sàng, trong các tetracycline thì doxycycline ít độc với gan hơn

Chỉ định: Doxycycline được chỉ định trong các trường hợp sau: Viêm phổi,

nhiễm khuẩn đường hô hấp (viêm họng, viêm amidan, viêm xoang, viêm tai giữa, viêm phế quản,…), nhiễm khuẩn đường tiết niệu (viêm thận-bể thận, viêm bàng quan, viêm niệu đạo,…), nhiễm khuẩn da và mô mềm (chốc lỡ, mụn nhọt, viêm

mô tế bào, nhiễm khuẩn vết thương…), nhiễm khuẩn đường tiêu hóa

Chống chỉ định: Chống chỉ định với bệnh nhân mẫn cảm với bất kì một

tetracycline nào Do việc sử dụng các thuốc nhóm tetracycline trong quá trình phát triền của răng có thể gây biến màu răng vĩnh viễn và thuốc có thể gắn vào và ảnh hưởng đến sự phát triển của xương nên không dùng cho phụ nữ mang thai,

trẻ em dưới 8 tuổi

2.1.3 Phương pháp xác định [1], [4]

2.1.3.1 Định tính

Theo phương pháp hóa học: Cho doxycycline phản ứng với acid sulfuric

đậm đặc thì thấy xuất hiện kết tủa màu vàng Sau đó cho phản ứng với dung dịch kẽm clorid 50% chuyển sang mất màu

Phản ứng phát huỳnh quang: Hòa tan chế phẩm trong dung dịch NaOH

loãng, thấm lên giấy lọc, sấy ở 60oC, soi UV 360 nm phát hiện vết có màu vàng

Sắc ký lớp mỏng

Tiến hành sắc ký với các điều kiện:

Hệ dung môi : Nước - methanol - dicloromethan (6 : 35 : 59)

Dung dịch thử: Lấy một lượng mẫu thử có chứa doxycycline hòa tan trong dung môi và lọc, thu được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Hoà tan 1 mg doxycyclin hyclate cho vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng acetonitrile

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt 1 µL mỗi dung dịch trên lên bản mỏng Sau khi triển khai dung môi đi được khoảng 15 cm, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm

Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu về vị trí màu sắc và kích thước

Đo vị trí các vết và vị trí mực dung môi di chuyển được rồi tính giá trị Rf

của từng vết So sánh Rf của vết bên dung dịch chuẩn và vết bên dung dịch mẫu

để xác định xem trong mẫu có chứa chất cần phân tích hay không

b

a

R f 

a: Đoạn đường di chuyển của chất phân tích

b: Đoạn đường di chuyển của pha động

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nguyên tắc phân tích định tính của phương pháp là: so sánh thời gian lưu của các peak trong mẫu phân tích với thời gian lưu của các peak trong mẫu chuẩn

2.1.3.2 Định lượng [4]

Phương pháp HPLC

Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: Cân chính xác 10.6 mg doxycyclin hyclate

chuẩn đã cho vào bình định mức 10 mL, thêm 6 mL ACN, lắc siêu âm cho tới khi hoà tan hoàn toàn thêm ACN tới vạch, lắc đều

Dung dịch chuẩn 10 ppm: Hút 1mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm pha động tới vạch, lắc đều

Dung dịch thử: Cân một lượng chất thử, chuyển vào trong bình định mức

100 mL Thêm khoảng 75 mL dung môi pha loãng, trộn đều và lắc siêu âm cho tới khi tan hoàn toàn, thêm dung môi vừa đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 µm

2.2 Phương pháp chiết tách

2.2.1 Chuẩn bị mẫu phân tích [5],[6]

Chuẩn bị mẫu là công việc cần thiết cho quá trình phân tích nhằm tách các chất cần xác định ra khỏi mẫu Công việc này rất quan trọng vì nó ảnh hưởng trực tiếp kết quả phân tích

Yêu cầu chung của quá trình chuẩn bị mẫu:

- Dụng cụ phải sạch không bị nhiễm bẩn

- Dung môi chiết tách phải tinh khiết không lẫn tạp chất

- Không làm nhiễm mẫu

- Không đưa chất khác vào gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích

- Làm giàu mẫu một cách thích hợp

Mẫu phải được lấy theo một quy trình lấy mẫu đã được ban hành của phòng thí nghiệm, người lấy mẫu phải được huấn luyện phương pháp lấy mẫu và đồng thời mẫu được lấy phải có khối lượng lớn hơn khối lượng mẫu cần phân tích và lấy đúng theo yêu cầu

2.2.2 Một số phương pháp chiết tách [7],[8]

2.2.2.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (Liquid – liquid extraction)

Nguyên tắc cơ bản của quá trình chiết lỏng – lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng, hai pha này không hòa tan vào nhau

Khi thêm một cấu tử thứ ba vào hệ dung môi có hai cấu tử không tan hoàn toàn vào nhau hoặc tan có giới hạn thì sự hòa tan của cấu tử này vào hai cấu tử kia theo một tỉ lệ nhất định ở một nhiệt độ nhất định gọi là hằng số phân bố Nernst K

Trong đó:

 Ca: là nồng độ của chất tan trong pha (a)

 Cb: là nồng độ của chất tan trong pha (b)

 Sa,Sb: là độ tan của hai cấu tử

Hằng số phân bố của một chất cho biết khả năng hòa tan của chất đó với hai pha lỏng không hòa tan vào nhau tại thời điểm cân bằng, hệ số phân bố của một chất ít thay đổi theo nhiệt độ và nồng độ của chất đó trong dung dịch ban đầu, tuy nhiên nó phụ thuộc nhiều vào dung môi (độ phân cực, tính ưa nước…), pH, lực ion…

Chiết lỏng – lỏng là một kỹ thuật tách đơn giản nhất được sử dụng để làm sạch hoặc tách một cấu tử riêng hoặc một loại cấu tử khỏi mẫu Mẫu rắn hoặc lỏng được chiết bằng dung môi thích hợp Sự lựa chọn dung môi chiết phụ thuộc vào tính tan của chất phân tích ở trong dung môi đó và phụ thuộc vào sự dễ dàng tách được chất cần tách ra khỏi mẫu

Quá trình chiết lỏng-lỏng được tiến hành theo 3 bước:

Bước 1: Cho dung môi thích hợp tiếp xúc với dung dịch chứa chất phân tích Bước 2: Phân tách thành hai pha: dịch chiết và dịch bã

Bước 3: Tách và thu hồi dung môi chiết từ hai pha dịch chiết và dịch bã

Sự làm giàu chất và hiệu quả của phương pháp chiết phụ thuộc tỉ số thể tích của mẫu và dung môi chiết, phụ thuộc hệ số phân bố của chất cần phân tích trong dịch chiết và dịch bã Tỷ lệ thể tích của mẫu và dung môi không thể lấy quá rộng

vì nó ảnh hưởng đến độ chính xác khi định lượng Hệ số phân bố có thể cải thiện nhờ thay đổi pH mẫu, khử muối…

b a b

a

S

S C C

K  

Ưu điểm [9]

Được ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích tách, phân li, làm giàu các chất, đặc biệt khi cần tách một lượng rất nhỏ các tạp chất ra khỏi một lượng lớn các chất khác Ưu điểm lớn nhất của phương pháp là quá trình thực hiện nhanh Thông thường là vài phút là có thể thực hiện được một phép chiết Các thiết bị chiết lại rất đơn giản, khi tiến hành chiết, trừ phiễu chiết, thường người ta không đòi hỏi thiết bị gì thêm

Nhược điểm [7]

Là do phải lắc bình lóng nhiều lần nên ở những lần chiết sau dung môi trong bình lóng tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp Sử dụng một lượng lớn dung môi và chỉ sử dụng dung môi không trộn lẫn nên việc lựa chọn dung môi rất khó khăn, thao tác thí nghiệm phức tạp và hiệu suất làm giàu không cao

2.2.2.2 Kỹ thuật chiết rắn - lỏng

Chiết rắn-lỏng là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn.Được áp dụng để tách các chất phân tích ra khỏi mẫu vật rắn như thực vật, đất, các mẫu sinh học,… bằng dung môi thích hợp Các chất phân tích trong mẫu rắn thường nằm ở thành nang nhỏ hoặc phân tán trong chất rắn, vì vậy cần nghiền nhỏ để tăng bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất phân tích Tùy vào thuộc tính

phân cực của chất cần tách mà lựa chọn dung môi chiết phù hợp

a Chiết bằng phương pháp xay trộn với dung môi [7]

Áp dụng đối với mẫu rau cải, thịt cá Dung môi phải đi sâu được vào nền mẫu vì vậy cần xay nhuyễn mẫu để tạo diện tích tiếp xúc lớn giữa mẫu và dung môi Sau đó, dùng dung môi thích hợp để hòa tan chất phân tích Mục đích của quá trình này là tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu và hạn chế đến mức tối thiểu chất đồng trích ly

b Chiết bằng phương pháp cơ học trộn rung (Vortex) [7]

Áp dụng cho các mẫu rau cải đã xắt nhuyễn, hạt nhỏ, chất lỏng Mẫu được trộn đều với dung môi ở tốc độ cao, với tác động mạnh của lực cơ học, dung môi

sẽ thấm sâu vào bên trong các cơ thịt, mô tế bào và làm phá vỡ cấu trúc của chúng thành những mảnh vụn Do đó chất phân tích dễ dàng phân bố vào pha hữu

cơ hơn Dịch chiết thu được sau quá trình này cần phải xử lý tiếp để loại bỏ hết tạp chất

c Chiết bằng phương pháp chiết Soxhlet [7]

Hình 2.2 Sơ đồ chiết Soxhlet Chưng cất hồi lưu liên tục mẫu với dung môi hữu cơ, làm chất phân tích trong mẫu tan vào dung môi hữu cơ Chất phân tích phải tan tốt vào trong dung môi hữu cơ, pha chiết phải tinh khiết, bền, không làm hỏng chất phân tích, nhiệt

độ thích hợp Thích hợp cho các mẫu rắn như lá cây, rau quả, đất…

Ưu điểm

Tiết kiệm dung môi, không phải tốn công lọc và bổ sung thêm dung môi mới như các kỹ thuật chiết khác, tương đối trích được hết chất Ly trích tự động liên tục

Nhược điểm

Không chiết được lượng lớn mẫu, không chiết được các chất kém bền nhiệt

do dịch lượng mẫu chiết phụ thuộc vào kích thước của máy Soxhlet chiết liên tục

bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi hơn nữa giá thành thiết bị khá cao, dễ hư hỏng, dễ vỡ và khó thay thế

d Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method) [7]

Tuy đã được biết đến cách đây rất lâu (1879) nhưng mãi đến thập niên 1980, phương pháp này mới được áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật chiết các hợp chất thiên nhiên ra khỏi thực vật như tinh dầu cà phê, trà, gia vị…

Một hợp chất sẽ hiện diện ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt

độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn tương ứng của nó

Ưu điểm

Chất lỏng siêu tới hạn có khả năng khuếch tán thấm vào bên trong mẫu

chiết nhiều so với sự chiết bằng dung môi theo các phương pháp khác

Chất lỏng siêu tới hạn có độ nhớt thấp, có áp suất hơi cao Đồng thời có sự chọn lọc cao đối với chất cần chiết tách, phù hợp với loại hợp chất nhạy với nhiệt

độ và là phương pháp thân thiện với môi trường

Nhược điểm

Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền Sự hiện diện của nước trong mẫu chiết

thường gây khó khăn cho quá trình chiết, không thích hợp đối với mẫu chiết ở

dạng lỏng Phương pháp này thường sử dụng dung môi là CO2 lỏng nên không phù hợp để chiết các hợp chất có tính phân cực

e Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid phase extraction, SPE) [7], [10], [8]

Ngày nay hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký đều sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn Ứng dụng cho nhiều loại nền mẫu khác nhau như: các loại mẫu môi trường, mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu thực phẩm…

Kỹ thuật chiết pha rắn là sự tương tác giữa các chất tan trong một dung dịch lên trên chất hấp thu

Kỹ thuật chiết pha rắn thường được áp dụng nhằm các mục đích sau:

- Xác định mức độ phân cực của một hợp chất chưa biết

- Làm giàu mẫu nhằm làm tăng độ nhạy cho quá trình phân tích mẫu, loại

bỏ các tạp chất gây nhiễu nền không mong muốn, thay đổi nền mẫu của chất phân tích

- Phân chia hỗn hợp ban đầu chứa các hợp chất từ không phân cực đến phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Các cấu tử cần phân tích và các chất cản trở nằm trong pha lỏng Khi cho chất lỏng chảy qua cột nhồi chứa chất hấp thu, quá trình chiết tách xảy ra theo các trường hợp sau:

- Các cấu tử cần phân tích được lưu giữ lại trên chất hấp thu, còn các chất cản trở không bị lưu giữ được thải ra khỏi cột theo dòng chảy, sau đó chất cần phân tích được rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp

- Ngược lại, các chất cản trở bị lưu giữ lại trên chất hấp thu, còn cấu tử cần phân tích không bị lưu giữ chảy ra khỏi cột theo dòng chảy

Trong đa số trường hợp, các cấu tử cần phân tích và các chất cản trở cùng bị giữ lại trên cột chất hấp thu Khi đó cần rửa chọn lọc bằng những dung môi đủ mạnh để loại bỏ các chất cản trở, nhưng lại đủ yếu để các cấu tử cần phân tích

nằm lại sau, hoặc rửa giải chọn lọc các cấu tử cần phân tích trong dung môi và để lại các chất cản trở bị lưu giữ mạnh trên cột chất hấp thu

Cấu tạo của cột SPE: Cột gồm hai bộ phận chính:

- Thân cột: có dạng giống vỏ bơm tiêm, thể tích từ 1 mL – vài chục mL,

vỏ bên ngoài được chế tạo bằng chất dẻo chịu dung môi, có ghi ký hiệu, chủng loại và tính chất của cột

- Lòng cột: từ 0,5 - vài cm chứa luợng pha rắn có khối lượng thường từ

100 – 500 mg, kích thước hạt thường 5 µm

Hình 2.3 Hình dạng cột SPE

1 Thân cột: chứa dung môi và các dung dịch cho qua cột

2 Chất hấp thu: lưu giữ các chất phân tích lại trên cột

3 Đuôi cột: gắn kết cột với bộ chiết

Hình 2.4 Cấu tạo bộ chiết SPE

1 Bình chiết làm bằng thủy tinh, có nắp đậy kín, trên nắp có các vị trí gắn

cột SPE vào, phía dưới có đầu gắn nối với máy bơm

2 Van điều chỉnh tốc độ dòng chảy của dung môi và các dung dịch đi qua

cột

3 Đầu gắn máy bơm: máy bơm dùng để hút dung dịch thải ra khỏi bình

chiết, tạo vùng chân không trong bình để làm khô cột trong quá trình chiết

4 Van điều chỉnh áp suất: dùng để điều chỉnh độ chân không trong bình

Bảng 2.1 Các chất hấp phụ dùng trong kỹ thuật chiết pha rắn [7]

C18 – octadecyl Không phân cực

C8 – octyl Không phân cực vừa phải

C2 – etyl Không phân cực yếu

CH – cyclohexyl Không phân cực yếu

PH – phenyl Không phân cực vừa phải

CN – cuối dây có cyanopropyl Không phân cực vừa phải/phân cực

SCH – acid benzensulfonic Cation mạnh

PRS – acid propylsulfonic Cation mạnh

CAB – acd carboxylic Cation yếu

Chất

trao

đổi

anion

SAX – amin thứ cấp Anion mạnh

PSA – amin nhất và nhị cấp Anion yếu/phân cực

NH2 – aminopropyl Anion yếu/phân cực

DEA – dietylaminopropyl Anion yếu/phân cực

Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn

Hình 2.5 Các bước tiến hành kỹ thuât chiết SPE

Bước 1: Lựa chọn cột

Chọn loại cột phù hợp với chất phân tích thường thì chất nhồi quyết định sự

phù hợp của chất phân tích so với cột

Bước 2: Hoạt hoá pha tĩnh

Chuyển dạng chất hấp thụ pha rắn Đầu tiên, vật liệu hấp thụ được chuyển

từ dạng ban đầu (của hãng sản xuất) sang dạng thích hợp cho quá trình hấp thụ (dạng H+ hoặc OH-) bằng cách cho dung môi chạy qua làm ướt vật liệu, hoạt hóa các nhóm chức của chất hấp thụ và đuổi không khí, lấp đầy các khoảng trống bằng dung môi Sau đó, cột được làm ướt bằng dung dịch đệm hoặc nước cất để

có hiệu quả hấp thụ tốt đối với các mẫu là dung dịch nước (chất hấp thụ phải luôn được ngâm trong dung môi) Trong thực tế, nếu để khô cột thì khả năng hấp thụ xảy ra không hoàn toàn và độ thu hồi chất phân tích giảm, do vậy phải tiến hành quá trình chuẩn bị cột (pha tĩnh) lại từ đầu Trong quá trình chuyển dạng, nếu cần thiết nên có thêm bước làm sạch cột để loại bỏ các tạp chất

Bước 3: Cho mẫu qua cột

Dung dịch mẫu chứa chất phân tích được cho qua cột với tốc độ thích hợp (thông thường từ 0.5-1 mL/phút) Chất phân tích được giữ lại trên cột còn các chất khác cùng dung môi đi ra khỏi cột Cũng có trường hợp chất gây cản trở bị giữ lại trên cột, còn chất phân tích đi ra khỏi cột cùng với dung môi Sau đó chất phân tích được thu hồi và xác định bằng một phương pháp phân tích thích hợp đã chọn Ở bước này, điều quan trọng nhất là cơ chế lưu giữ chất phân tích trên chất

hấp thụ khi cho mẫu chảy qua cột Các cơ chế của quá trình lưu giữ bao gồm tương tác Van der Wall, tương tác lưỡng cực - lưỡng cực, liên kết hydro, trao đổi cation, trao đổi anion, tạo phức vòng càng… Quá trình hấp thụ này có thể giữ lại một số thành phần khác trên cột cùng với chất phân tích Có thể nạp một lượng mẫu khoảng 5% lượng pha tĩnh

Bước 4: Rửa các tạp chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột

Quá trình này sẽ loại bỏ tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại chất phân tích Nếu mẫu hoà tan trong nước thì nên sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nước- dung môi hữu cơ Nếu mẫu được hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể dùng chính dung môi đó

Bước 5: Giải hấp chất phân tích khỏi cột

Đây là bước cuối cùng để thu hồi chất phân tích Dung môi được chọn phải phá vỡ dễ dàng tương tác giữa chất phân tích và chất hấp thụ Thể tích dung môi

sử dụng rửa giải càng ít càng tốt nhưng phải đảm bảo rửa sạch chất phân tích ra khỏi vật liệu hấp thụ Tách từ từ cấu tử các phân tích ra khỏi cột bằng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp

Trường hợp dung môi dùng để giải hấp không tan trong dung môi đã sử dụng để rửa tạp thì phải rút chân không nhẹ để làm khô cột trước khi cho dung môi giải hấp vào Về nguyên tắc không nên sử dụng dung môi có khả năng chiết tách quá mạnh vì có thể lôi kéo theo cả những chất không mong muốn trong quá trình giải hấp Ngược lại nếu khả năng chiết tách của dung môi quá yếu thì sẽ phải sử dụng một lượng dung môi lớn mới có thể giải hấp hết các chất phân tích trên cột

Ưu điểm

Phương pháp SPE có khả năng tự động hóa và làm hàng loạt cao Tính đặc hiệu và chọn lọc đối với chất phân tích cao, có khả năng tương thích với phân tích sắc ký Tiết kiệm dung môi tiêu thụ và tiết kiệm thời gian Hiệu suất thu hồi cao,

khả năng làm sạch chất phân tích lớn

Nhược điểm

Giá cả của thiết bị đắt tiền, muốn thu được chất phân tích sạch thì phải chọn được dung môi rửa giải thích hợp Các bước thực hiện đòi hỏi phải có tay nghề Ngoài ra, còn nhiều kỹ thuật chiết tách khác như ly trích bằng siêu âm, ly trích bằng vi sóng, kỹ thuật vi ly trích trên pha rắn SPME, kỹ thuật phân tán trên pha rắn,… cũng được áp dụng với các mục đích như làm giàu mẫu và phân lập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu khác nhau

Bảng 2.2 Các dung môi thường dùng trong chiết pha rắn có tính phân cực tăng dần dựa vào hằng số điện môi [11]

Độ phân cực Dung môi Khả năng tan

trong nước

Hằng số điện môi ở 25oC Không phân

cực

Phân cực

Hexan Cyclohexan Carbon tetrahydrochloride Diethyl ether

Chloroform Ethyl acetate Acid acetic Tetrahydrofuran Dichlorometan Aceton

Methanol Acetonitrile Nước

Không Không Không Không Không

ít

Có

Có Không

2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12], [13]

2.3.1 Lịch sử phát triển HPLC [14], [15]

Năm 1906 Tswett (Nga) cho dung dịch sắc tố thực vật lên cột nhồi bằng CaCO3, các sắc tố di chuyển xuống với tốc độ riêng, tách thành những vùng màu Ông gọi phương pháp này là sắc ký

Năm 1938 Izmailov và Schaiber xây dựng sắc ký lớp mỏng

Năm 1958 Stahl hoàn thiện sắc ký lớp mỏng

Năm 1941 Martin và Synge đặt nền tảng cho sắc ký phân bố

Năm 1952 Martin và Tames công bố sắc ký khí

Năm 1967, Horvath C là tác giả đầu tiên đã tạo ra máy HPLC để nghiên cứu

về nucleotid Ngày nay, với các ưu điểm như áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc ký nhanh… HPLC được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa dạng như phân tích dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polymer thiên nhiên hoặc tổng hợp, các loại dư lượng trong môi trường, nhiều loại hợp chất vô cơ, các loại nguyên tố hiện diện trong mẫu phân tích ở dạng vết… Hơn nữa, các loại đầu dò

dùng cho HPLC không làm hư hại mẫu phân tích, có thể thu hồi mẫu để thực hiện các nghiên cứu khác như phân tích phổ, thử nghiệm hoạt tính sinh học…

Trong sắc ký cột (dạng rắn - lỏng hay lỏng - lỏng), kỹ thuật sắc ký lỏng áp suất thường đã ra đời và được ứng dụng từ lâu (trên 60 năm) Nhưng hiệu suất tách không cao, độ nhạy thấp, tốn nhiều thời gian và dung môi để chạy sắc ký Ngược lại kỹ thuật HPLC tuy mới ra đời và phát triển trong khoảng thời gian gần đây, nhưng hiện nay đang được phát triển rất nhanh và đã ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của nghiên cứu khoa học và công nghệ

Vì kỹ thuật tách sắc ký này có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao, tốn ít thời gian cũng như tốn ít mẫu

2.3.2 Khái niệm và nguyên tắc hoạt động của HPLC [8], [16]

2.3.2.1 Khái niệm

Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất trong những điều kiện nhất định Các tính chất đó có thể là tính chất hấp phụ của chất rắn, tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion, sự rây phân tử theo kích thước của chúng, sự tạo phức và

sự liên hợp phân tử, sự phân bố của các chất giữa hai pha không tan vào nhau…

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động

là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử)

Pha tĩnh (stationnary phase) có tác dụng giữ hóa chất

Pha động (mobile phase) có tác dụng hòa tan chất phân tích

Nguyên tắc: Hợp chất có ái lực ít với pha tĩnh thì có xu hướng tách ra khỏi cột trước Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị giữ lại lâu hơn trong cột và

ra sau

2.3.2.2 Nguyên tắc hoạt động

Hệ thống dung môi đóng vai trò là pha động được máy bơm cao áp hút qua

bộ khử khí nhằm loại bỏ hết bọt khí còn sót lại trong dung môi trước khi qua máy bơm, sau đó dung môi được trộn với nhau theo tỷ lệ thích hợp và được bơm liên tục qua cột tách

Mẫu phân tích được đưa vào cột tách bằng bộ phận tiêm mẫu sau đó được pha động đẩy qua cột tách, quá trính tách chất phân tích xảy ra ở đây

Các chất sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào detector và được chuyển thành tín hiệu, được khuếch đại và chuyển đến bộ phận ghi, xử lý kết quả

2.3.2.3 Cách phân loại sắc ký trong HPLC [8], [16]

Trong HPLC được chia thành hai loại chính:

HPLC với pha thường (Normal – phase HPLC)

- Pha tĩnh như silica (pH = 2 – 8), alumina (pH = 2 – 12), diol, -NH2 ghép nhánh…

- Pha động: Dung môi ít phân cực hơn như hexan, CHCl3…

HPLC với pha đảo (Reversed – Phase HPLC)

- Pha tĩnh: bề mặt kỵ nước tạo bởi các dây nhánh C18, C8, C4, Phenyl…

- Pha động: thông dụng Metanol, Acetonitrile, nước…

2.3.2.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC [7], [8], [16]

Hình 2.6 Hệ thống HPLC

a) Bình chứa pha động (dung môi)

Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn nhờ bộ phận trộn sau máy bơm và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%.

Dung môi dùng cho HPLC có thể là nước, các loại dung dịch đệm, methanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp các loại trên Tất cả dung môi phải có độ tinh khiết cao đạt tiêu chuẩn HPLC, không có lẫn bụi bẩn, bọt khí Trước khi sử dụng các bình dung môi cần được khử hết bọt khí còn lẫn trong dung môi bằng cách siêu âm loại bỏ bọt khí

b) Bộ khử khí (Degases)

Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau: tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi, trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC

c) Bơm cao áp (pump)

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải đạt được áp suất cao khoảng 250-600 bar và tạo dòng liên tục Có thể

điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0.05-10 mL/phút

d) Bộ phận tiêm mẫu (injector)

Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc kývới thể tích từ 1 µL – 100 µL Có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu tự động (Autosampler)

e) Cột sắc ký (column)

Là cột chứa pha tĩnh, nó là một yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu Cột được làm bằng thép không rỉ, cột tách có nhiều kích cỡ khác nhau, tùy thuộc vào mức độ sắc ký Nói chung, các cột tách phân tích thường có kích thước chiều dài thường từ 10-25 cm, đường kính trong từ 3-10 mm, cỡ hạt pha tĩnh từ 3-10 µm Thường dùng cột dài 15cm, 25cm, đường kính trong 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm Trước các cột sắc ký thường kèm theo bộ phận

tiền cột có tác dụng giữ lại phần bẩn từ dung môi, bảo vệ cột phân tích

f) Đầu dò (Detector) [7], [12]

Khi chất phân tích đi qua đầu dò tạo tín hiệu điện, tín hiệu này được đọc trên máy ghi, tín hiệu điện tỉ lệ với lượng chất phân tích đi qua đầu dò Đầu dò phải đạt các yêu cầu về: phát hiện nhanh và lặp lại, độ nhạy cao, không làm thay đổi

độ phân giải, không làm hỏng chất phân tích

Hiện nay, có nhiều loại đầu dò và mỗi loại đầu dò có những tính chất đặc trưng khác nhau:

Đầu dò UV (UV-Vis)

- Detector loại này thực chất là các máy phổ hấp phụ phân tử vùng tử ngoại (UV) và vùng khả kiến (Vis) Nhưng ở đây buồng đặt cuvet đo được thay thế bằng cuvet động (flowcell) Việc đo để phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ

quang phân tử của chất ở trong dung dịch tại một độ dài sống nào đó, nhưng dung dịch ở đây là pha động của quá trình sắc ký, nó chảy liên tục qua buồng đo Các chất phân tích tan trong pha động có thể cho phổ hấp thụ trực tiếp của chính nó như: phenol, toluene, benzene, nitrobenzene…ở bước sóng 254 nm Nhưng đối với một số chất khác như: các ion kim loại, thì là đo các hợp chất của chúng với một thuốc thử nào đó, ví dụ phức Fe-CNS, ở sóng 480 nm…

- Như vậy nói chung tất cả các chất phân tích hay hợp chất của nó đối với một thuốc thử phân tích theo phản ứng có tính chất định lượng mà có khả năng hấp thụ quang nhạy tại một bước sóng nào đó trong vùng phổ UV-VIS đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại detector này

- Nguyên tắc của việc phát hiện định lượng ở đây là dựa theo định luật Lamber- Beer: L C

I

I

Alog 0 

- Trong đó:

 A: là độ hấp thụ quang của chất phân tích hay hợp chất phức của

nó với thuốc thử phân tích đã chọn

 I0: cường độ ánh sáng trước khi đi qua lớp hấp thụ

 I: cường độ ánh sáng sau khi đi qua lớp hấp thụ

 L: bề dày của lớp hấp thụ

 C: nồng độ của chất hấp thụ

  : là hệ số hấp thụ của chất hấp thụ

Đầu dò Photodiod array (PDA)

- Đầu dò photodiod cho phép một cách liên tục quang phổ hấp thu của một chất phân tích đang hiện diện trong dòng chảy của dung môi giải ly, nên không cần phải làm ngưng dòng chảy

- Máy quang phổ photodiod có cách sắp xếp bố trí ngược lại với đầu dò hấp thu tử ngoại, trong đó tất cả ánh sáng đều đến nguồn sáng đều được tập trung chiếu vào dung dịch mẫu phân tích Toàn phổ ánh sáng sau khi

đi xuyên ngang qua ống chứa mẫu, được một máy nhiễu xạ ánh sáng toàn phổ, tán xạ thành những bước sóng đơn, các bước sóng đơn sắc này được tập trung vào một mạng diod quang, mạng diod quang là một dãy đầu dò, mỗi diod nhận một bước sóng khác nhau

- Khi tia sáng truyền đến diod quang, những dòng điện miliamper được phát sinh và được xử lý để cho dữ liệu hấp thu, và như thế có thể xác định được chất phân tích