TRUONG DAI HOC CAN THƠ KHOA CONG NGHE
LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC
KHẢO SÁT SỰ THAY DOI HAM LUONG
ENROFLOXACIN VA THIAMPHENICOL
TRONG HUYET TUONG HEO THEO THOI GIAN BANG PHUONG PHAP HPLC
CAN BO HUONG DAN SINH VIEN THUC HIEN
ThS Phạm Văn Dũng Nguyễn Minh Điện
MSSV: 2072136
Ngành: Công Nghệ Hóa Học Khóa 33
Trang 2TRUONG DAI HOC CAN THƠ KHOA CONG NGHE
LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC
KHAO SAT SU THAY DOI HAM LUONG
ENROFLOXACIN VA THIAMPHENICOL
TRONG HUYET TUONG HEO THEO THOI GIAN BANG PHUONG PHAP HPLC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
ThS Phạm Văn Dũng Nguyễn Minh Điện
MSSV: 2072136
Ngành: Công Nghệ Hóa Học Khóa 33
Trang 5LỜI CÁM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn quý Thây, Cô đặc biệt là Thầy Cô Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học, Khoa Công Nghệ trường Đại Học Cần Thơ Các Thay, Cô đã tận tình truyền đạt cho em kiến thức và kinh nghiệm quý báo trong suốt thời gian em theo học tại trường
Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành cảm ơn chú Phạm Văn Dũng — phòng R&D, Công ty Vemedim đã chỉ bảo tận tình và truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm vô cùng quý báu trong suốt thời gian em thực
hiện Luận Văn Tốt Nghiệp
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Vemedim đã chấp nhận và tạo điều kiện thuận lợi ø1úp em hoàn thành luận văn này
Em xin chân thành cảm ơn quý Cô, Chú, Anh Chị công tác tại phòng R&D đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài
Một lần nữa con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình đã động viên giúp đỡ con thực hiện luận văn này Cùng tất cả các bạn sinh viên ngành Công nghệ Hóa học, Khoa Công nghệ, Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ nhiệt tình và giúp tôi hoàn thành luận văn này
Em xin chân thành cảm ơn!
Cần thơ, ngày 15 tháng 4 năm 201 1
Sinh viên thực hiện
Trang 6MỤC LỤC 0089.90.0007 i 180 n5 mm ii DANH MUC HINH w.o ccccccccccccccccccscsessesesscscseesscscsscesssesessesecsesscsessesessssssseessneeseee V DANH MỤC BẢNG - - CS SH HT TH1 111 111011111111 111111 11kg vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮTT 2 - <2 £ SE EE#EE+ESEEEEEEEEEEEEErkrrkrrrrerred vii 9806710000 1 207.0806490) (649) 2 CHUONG I SO LUQC THIAMPHENICOL VA ENROFLOXACIN 3
1 So lore vé Thiamphenicol .0 0 0.ccccccsccccescssessescesesssssssessesssssesesseesseseseseeseeees 3 ñ số 3 II 3 1.3 Ứng dụng ¿2< Sẻ 2334331313 3013 31513111511 1115 11511111111 1111 1111k re 4 2 Sơ lược về Enrofloxacim - 6 + SxSz+3SxSx SE 111013 13111111 crrrei 4 2.1 CAU 4 „xát 8 5 ;»;86 1-7777 6
CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH . -cc5c 575cc 7
1 Phương pháp chuẩn bị mẫu - 2 ¿5 2+ E£E£EE£ESEE+EEEEEErErrxreerkrkered 7 2 Phương pháp chiết mẫu - 2 2E ESEE 2E E3 1513217151315 115112 x.eU 7
2.1 Kỹ thuật chiết lỏng — lỏng (Liquid — liquid extration) 5- + s s2 se scse£ 7
2.2 Kỹ thuật chiết lỏng - rắn 25+ 5c 2+2 SH triệu 8 2.2.1 Chiết bằng phương pháp xay trộn với dung môi . 2- 2 252 s¿ 8
2.2.2 Chiết bằng phương pháp cơ học trộn rung (VorteX) ¿- 7< scs+zsreccee 9 2.2.3 Chiết băng phương pháp chiết Soxhlet mẫu rắn . 2-2 252 s52: 9 2.2.4 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method) 10
2.2.5 Kỹ thuật chiết pha rắn (Soliđ phase extraction, SPE) . -5¿ 11 CHUONG III PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH . -752 555555: 19
1 Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 19
Trang 71.2 Khái niệm và nguyên tắc hoạt động của HPLC - 2 2 2 =s2 sẻ 20
I8 4 i6 .- 4 20
1.2.2 Nguyên tắc hoạt động -¿- 22+ ©sSES24 k2 SE 11113 111123111 11511 11111 e tk, 20 1.3 Cách phân loại sắc ký trong HPL/C 22 2E E£+E£E£E£EcEezerecezveceở 22 1.4 Cau tao của hệ thống HPLC . +2 22 2£ ££E+E£Ez£sereceee 22 I S0) 0 on 23 1.4.2 Bộ khử khí Degasse .- Ăn HH HH HH ng HH ng và 23 1.4.3 Bom (0n 23 1.4.4 H6 théng tiém mau (injector) oo cseesssessesesesscseseststssestsesseeteseateess 23 I S9 0(6)0) 0 24 15200100 -‹ 4 24 IV: la n0 na 25 2 Phan tich dink ii 0 25 Khu r8 000000), 00 27
3.1 Dựng đường chuẩn 2 - 6 ©< z2 SEExESEESEEE 1E EEErrrrrrrkee 27 3.2 Hiệu suất tu hỗii - 5< SE S S33 3x S SE 3111115111011 11x12 27 3.3 Xác định RSD, LOD, LOQ - ng ng Hư 28 PHAN 2 THUC NGHIỆM . - 2-56 S52 SE SE SEEEEEE1 11 1111111 1c 30 CHƯƠNG IV THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 5- 25c cc<c: 31 I3): (2/8112)0 0u 000 31
Os nh 31
IV) ác 31
1.3 ThhiẾt bị, - - 5 + S13 1 13 13111111 1211111 12111111 111111 g1 gi ưu 31 2 Địa điểm tiến hành 2 5< S< 1S T33 H T171 1111151111511 T111 e 31 3 Thực nghiệm — KẾt quả 2® SE SE eEEEE£EeExcxeEEEEEEEEErErrxrerreee 32 3.1 Định tính Thiamphenicol và Enrofloxacin bằng phương pháp sắc KY TOP MONG, 32
3.1.1 Dinh tinh Thiamphenicol 000.0 — 32
Trang 83.2 Lựa chọn quy trình phân tích Enrofloxacin va Thiamphenicol bằng
phương pháp HPLC - - - - 5 E091 1 TH ng 34 XU? 0 0i u aaaaiaaaaăaăadaaaŸ 34
3.2.2 Phương pháp tiến hành - 2-2 2 SE 2+ SEEE£EEEEEEEEEEEEEE2EEEEEExrkererrkd 34
3.2.3 Lyra Chon Quy 35
3.2.3.1 Lựa chọn quy trình phân tích Thiamphenicol «<< <+<<<<<2 35 a) Quy trình phân tích Thiamphenicol theo sự chiết tách lỏng — lỏng 35
b) Quy trình phân tích Thiamphenicol theo sự chiết tách pha rắn SPE 39
3.2.3.2 Lựa chọn quy trình phân tích EnrofÏloxacim . «<< ssscee 41
a) Quy trình phân tích Enrofloxacin theo sự chiết tách lỏng — lỏng - 41 b) Quy trình phân tích Enrofloxacin theo sự chiết tách pha rắn SPE 45
3.2.4 Danh gid Quy trinh eee .e 47
3.3 Khao sat su thay déi hàm lượng của Enrofloxacin và
(jJ)1)/2 0) 0 48
S68 0 0 48
3.3.2 Phương pháp tiến hành khảo sát . - 2 5+ + ekEEE*+EcEeEck ve 48
3.3.2.1 Khảo sát hàm lượng của ThiamphernICOlÏ (5 55 << S5 £++** +2 48 3.3.2.2 Khảo sát hàm lượng của EnrofÏoxac1n «+ ssssSs sseserereesee 51
PHAN 3 NHAN XÉT - KIÊN NGHỊ, 2 5-52 2 E2 E2 rkrrerrre 55 CHUONG V KET LUAN — KIÊN NGHỊ, - 2 2 <2 xe ceczxcsee, 56
{C100 8n 4 56
2 Kiến nghị, - (6-52 SE 32 E* E1 1 311111 1.1111 11 1111.1111 1 T111 1 gu 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 2 + 2+6 EESE* SE EESEEEEEEEEEE AE Erkrkee 58 PHỤ LỤC: HÌNH ANH MOT SO THIET BI SU DUNG TRONG QUA TRINH
THUC HIEN LUAN VAN TAI CONG TY VEMEDIM 555: 60
ĐÈ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP -. ©5525 z SE Sex rrrreở 63
Trang 9Hình 1.1 Công thức cấu tạo Thiamphenicol_ . 2-2 2s s+£z£52+s2 s2 3 Hình 1.2 Công thức cấu tạo Enrofloxacin 2-5-2 2 sex xe rtreceeee 4 Hình 2.1 Sơ đồ chiết Soxhlet -5+-5c+2 tterktitrtrrrrrrrrrrrrrrrrrrkrrrre 9
Hinh 2.2 Hinh dang c6t SPE ooo — 12
Hinh 2.3 Cau tao b6 chiét SPE .sesssssssssescssesessueeessecssuseesneessnseesnsensaeesneessasees 13
Hinh 2.4 Cac buéc tién hanh k¥ thudt chiét SPE occ cesses 15 Hình 3.1 Hệ thống HPLC -©- + <E+ SE SE SE£EEEEEEEE E112 111112 22 Hình 3.2 Bình sắc ký lớp mỏng . - 2 Sẻ kEEESEEkeEEEE SE, 25 Hình 3.3 Mô hình chấm sắc ký ¿- ¿2© 5-5622 SE+EE2EEEEEEEEEEErrrrerreee 26 Hình 4.1 Chuẩn bị bản mỏng định tính: . - 2 2 2 +E+Ee£E£E£Ez£E£EzEzreezee 32 Hình 4.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm . 2-2 2E S+E+E£EeEE+EeESEEEEeEEEEErrxrerreee 33
Hình 4.3 Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phương pháp chiết
LOMg 0 0 36 Hình 4.4 Phương trình đường chuẩn của Thiamphenicol -. - 5 38 Hình 4.5 Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phương pháp chiết
14:0) 0 39
Hình 4.6 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phương pháp chiết
LOMg o1 .).) 42
Hình 4.7 Phương trình đường chuẩn của Enrofloxacin . . 44
Hình 4.8 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phương pháp chiết
190i 077 46
Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ ThiamphenIcol
trong huyết tương theo thời gian - - 2k k SE SE rkeErrrkrreee 50 Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ EnrofloxacIn
Trang 10Bảng 2.1 Các chất hấp phụ dùng trong kỹ thuật chiết pha rắn . - 14 Bảng 2.2 Các dung môi thường dùng trong chiết pha rắn có tính phân
cực tăng dần dựa vào hằng số điện môi -++s+e+e+E+E+E+EzE+exeexererecee 16 Bảng 4.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn của Thiamphenicol 37 Bảng 4.2 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Thiamphenicol
trong huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng — lỏng 5- 5: 38 Bảng 4.3 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Thiamphenicol
trong huyết tương bằng phương pháp chiết SPE -. -+ 55255255252 40
Bảng 4.4 Kết quả xây dựng đường chuẩn của Enrofloxacin 44 Bảng 4.5 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Enrofloxacin
trong huyết tương bằng phương pháp chiết tách lỏng — lỏng 45
Bảng 4.6 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Enrofloxacin
trong huyết tương bằng phương pháp chiết SPE 2-5-2 2 c5c<cs¿ 47 Bảng 4.7 Kết quả phân tích hàm lượng Thiamphenicol trung bình trong
huyết tương với thuốc của Công ty Vemedim - - 2 2 << s2 49 Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lượng Thiamphenicol trung bình trong
huyết tương với thuốc của Cơng ty khác + 2-2 ©s+E+kecxckercerkd 50
Bang 4.9 Kết quả phân tích hàm lượng Enrofloxacin trung bình trong
huyết tương Với thuốc của Công ty Vemedim .-. 2-2-2 <e se £ececxd 52 Bang 4.10 Kết quá phân tích hàm lượng Enrofloxacin trung bình trong
huyết tương với thuốc của Công ty khác -. + - 7< s+s+zzrrrerreerees 53
Trang 11Ky hiéu Tén Nghia
HPLC hortogah iiquid Sac ky long hiéu nang cao
MIC_ | Minimum Inhibitory Concentration | Nông độ tối thiểu kiềm khuẩn
SPE | Solid phase extractlon Kỹ thuật chiết pha rắn
SPME | Solid phase micro extraction Kỹ thuật vi ly trích trên pha rắn GC Gas Chromatography Kỹ thuật sắc ký khí
LC Liquid chromatography Kỹ thuật sắc ký lỏng
TUC | Think Layer Chromatography Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng
ACN | Acetonitrile MeOH | Methanol
EDTA | Etilendiamin tetraaxetic axit
SD _| Standard Deviation Độ lệch chuẩn
RSD | Relactive Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối LOD | Limit of detection Gidi han phat hiện LOQ | Limit of quantitation Gidi han dinh lượng MRL | Maximum Residue Limits Giới hạn dư lượng tối đa MẫuT | Mẫu trắng
Mẫu PT | Mẫu phân tích
ppm_ | parts per million Phan triéu, mg/L
Trang 12
LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, thuốc kháng sinh được sử dụng ngày càng nhiều vào các mục đích khác
nhau: phòng, điều trị bệnh và kích thích tăng trọng cho vật nuôi Tuy nhiên, do thiếu hiểu biết, người chăn nuôi đã sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị chưa
đúng nguyên tắc, không có cơ sở khoa học dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng như:
Giảm hiệu lực của thuốc, tạo sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, gây khó khăn cho công tác phòng và điều trị
Ngoài việc có thể gây độc hại cho gia súc, thuốc kháng sinh còn tồn lưu trong thịt, trứng, sữa ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm chăn nuôi và gây hại cho sức khoẻ người tiêu dùng
Trong số rất nhiều các loại kháng sinh đang lưu hành trên thị trường, Enrofloxacin là loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolon và Thiamphenicol là loại thuốc
kháng sinh thuộc nhóm Phenicol có hoạt phố kháng khuẩn rộng đang được sử đụng
rộng rãi trong việc phòng trị bệnh cho vật nuôi, đặc biệt ở heo
Van dé đặt ra là tồn dư của loại kháng sinh trong heo ánh hướng xấu đến sức khoẻ cộng đồng và môi trường, là một trong những nguyên nhân gây bệnh cho con người và làm tăng nguy cơ xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các chủng vi sinh vật, đặc biệt vi sinh vật gây bệnh Xuất phát từ nhu cầu trên của thực tiễn, em tiến hành
nghiên cứu để tải “Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của Enrofloxacin và
Trang 13PHAN 1
Trang 14CHUONG I
SƠ LƯỢC THIAMPHENICOL VÀ ENROEFLOXACIN
1 Sơ lược về Thiamphenicol 5”! 1.1 Cau tao
Cong thirc phan ttr: C;2H;5Cl,NO;S
Khối lượng phân tử : 356.23
Công thức cấu tạo:
Cl
Cl
Hình 1.1 Céng thire cau tao Thiamphenicol
Tên hóa học: 2,2 — dichloro — N — [(1R,2R) — 2 — hydroxy — 1 — (hydroxymethyl) — 2 —[4- (methylsulphonyl)phenyl]ethyl]acetamide
Tén théng dung: Dextrosulphenidol, Thiophenicol, Win 5063-2, CV8053, Thiamphenicol
1.2 Tính chất
Thiamphenicol là dẫn xuất tông hợp, câu trúc khác chloramphenicol do nhóm nitro thom trong phan tir chloramphenicol duoc thay bằng nhóm methyl sulfon Thiamphenicol khac voi Chloramphenicol 14 déc tinh rất thấp
Là chất bột tinh thể hay dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt
Nhiệt độ nóng chảy : 165.3”C
Thiamphenicol co kha năng hòa tan tốt trong đimethyl acetamide tỉ lệ (1:1), tan trong dimethyl formamide và acetonitrile theo tỉ lệ (1:10), trong methanol với tỉ lê (1:20), tan it trong nudc, ethanol 95% va acetone
Dược động học:
Trang 15Phân bố: thuốc phân bố rộng rãi vào các mô và địch cơ thể, qua nhau thai, sữa mẹ và dịch não tuỷ
Chuyến hoá: thuốc ít chuyển hoá qua gan
Thái trừ: chủ yếu thận đưới dạng không đổi
Tác dụng:
Thiamphenicol là kháng sinh phô rộng, có tác dụng lên nhiều vi khuẩn gram đương
và âm Thuốc có tác dụng tốt với Salmonella, Salmonella typhi, Shigella, Vibrio
cholerae va cac vi khuan ki khi gram 4m nhu bacteroides fragilis, nhung khéng cé tac dung trén P.aeruginosa
Thuốc thâm nhiêu vào phê quản nên hay dùng điều trị các nhiễm khuẩn 6 phéi, khi phê quản, nhật là vi khuân đã kháng các kháng sinh khác
Thuốc ít chuyển hoá qua gan nên ít gây hội chứng xanh xám ở trẻ sơ sinh
Thuốc thải trừ chủ yếu qua thận dưới dạng còn hoạt tính nên còn được dùng điều trị
nhiễm khuẩn tiết niệu, sinh dục
Độc tính: có thể gây suy tủy xương, suy thận 1.3 Ứng dụng
Thiamphenicol dùng điều trị nhiễm trùng hô hấp, tiêu hóa, niệu dục, thương hàn,
viêm màng não do Hoemophilus, Gonococcus gầy ra Liều dùng 30 — 100mg/kg thể trọng/ngày
2 Sơ lược về Enrofloxacin 1"
2.1 Cau tao
Cong thirc phan tir: Cj9H2203FN3
Khối lượng phân tử : 359.39
Trang 16Tên hóa học:
1 — Cyclopropyl — 7 — (4 — ethyl — 1 — piperazinyl) — 6 — fluoro — 1,4 — dihydro — 4 — oxo — 3 — quinolinecarboxylic acid
Tén thong dung: Baytril, Enrofloxacin, Quinoex (Sanofi)
2.2 Tinh chat
Tinh thể màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 220°C
Tan Ít trong nước ở pH 7 Dược động học:
Sự hấp thu: Enrofloxacin được hấp thu tốt cả trong và ngoài đường tiêu hóa Nếu uống hay tiêm vào bắp với liều 25mg/kg thể trọng, sau lgiờ sẽ đạt nồng độ cao
trong huyết tương, uống có nồng độ 0.9mg/ mL còn tiêm đạt nồng độ 1mg/ mL
Thuốc duy trì được nồng độ hữu hiệu trong máu khoảng 1 — 6 giờ tùy theo trạng
thái bệnh lý
Phân bố: Thuốc được phân bố điều và rộng khắp các tổ chức Nồng độ thuốc trong các tô chức gan, tim phổi thận đều cao hơn trong huyết thanh Thuốc được chuyển hóa chủ yếu ở tế bào gan Thời gian bán thải t„ khoảng 3 giờ nếu tiêm tĩnh mạch, hay 6 giờ nếu tiêm bắp hoặc uống
Thái trừ: Thuốc thải trừ qua thận và phân, nhưng nếu công năng của gan, thận kém sẽ tăng thời gian t;„; lên cao Tị„; với chó khoảng 2 — 3 giờ bằng đường uống, 3 — 5 ø1ờ tiêm, mèo 3 — 4 gid, cừu 5 — 6 gio
Tác dụng :
Enrofloxacin là loại thuốc được tổng hợp đầu tiên vào năm 1983 Thuốc được dùng rộng rãi trong thú y
Thuốc có phổ tác dụng rộng và mạnh Với các vi khuẩn Gram âm như E.coli, Salmonella, Klebssiella, Pseudomonas, aeruginossa, Mycoplasma.spp c6 MIC
(Minimum Inhibitory Concentration hay néng d6 téi thiêu kiềm khuẩn) bằng 0.01 —
1.25 mg/ mL Với các vi khuẩn nhu Bacteroides.spp, Bordetelle bronchiseptica, Pasteurella.spp, Treponema hyodysenteriae (vi khuan gay bệnh hồng ly tiêu chải trên heo choai) có MIC bằng 0.05 — 2.0 mg/ mL
Các vi khuan gram duong nhu Staphyloccocus aureus, steptoccocus agalactiae, steptoccocus dysgalactiae, Corynebacterium pyogenes, Clostridium spp voi MIC
bang 0.16 — 1 mg/ mL
Trang 17
Thuốc dùng ưu tiên trị các bệnh do vi khudn Staphyloccocus, steptoccocus véi MIC bang 0.15mg/ mL, Mycoplasma cé MIC bang 0.5 mg/ mL Kém tac dụng với Corynebacterium pyogenes, cac vi khuan ky khi cé MIC bang 1 mg/ mL
Doc tinh
Thuốc có khả năng gây ra những ảnh hưởng từ nhẹ đến nặng như buôn nôn, nơn, tiêu chảy, dỊ ứng ngồi da, tăng áp lực nội sọ (chóng mặt, nhức đầu, lú lẫn, co giật, ảo giác) Trên trẻ nhỏ, có thể gây đau và sưng khớp, đau cơ
Thực nghiệm trên súc vật còn non thay mô sụn bị huỷ hoại 2.3 Ứng dụng
Dùng trị các bệnh do Mycoplasma gây viêm phỗi của trâu, bò, heo Bệnh viêm phổi do Pneumoniae, các bệnh viêm phối, viêm đường hô hấp của động vật nuôi do E.coli va Salmonella typhimurium
Liéu ding 2.5 mg/kg cho uống hay tiêm Thuốc hay có tác dụng phụ trên chó, mèo và ngựa Trong điều trị không dùng cho ngựa
Trang 18
CHUONG II
PHUONG PHAP CHIET TACH
1 Phương pháp chuẩn bị mau "”!
Chuân bị mâu là công việc đâu tiên và cân thiệt cho các quá trình phân tích nhăm mục đích tách các chât cân xác định ra khỏi nên mâu Đây là quá trình rât quan trọng, có thê mât chât hay nhiễm thêm chât vào làm sai két quả phân tích
Yêu cầu chung của quá trình chuẩn bị mẫu :
Lẫy hết các chất cần xác định ra khỏi mẫu phân tích
Không làm nhiễm bân thêm chất vào mẫu
Không đưa thêm chất khác vào gây ảnh hưởng cho quá trình phân tích Dung dịch mẫu thu được phải phù hợp cho quá trình phân tích
Làm giàu được các chất cần tách và xác định
2 Phương pháp chiết mẫu
2.1 Kỹ thuật chiết lóng — long (Liquid — liquid extration) '”Ẻ!
Nguyên tắc cơ bản của quá trình chiết lỏng — lỏng là sự phân bố của một chất tan
vào hai pha lỏng, hai pha này không hòa tan vào nhau
Khi thêm một cầu tử thứ ba vào hệ dung dịch có hai cấu tử khơng tan hồn toàn vào nhau hoặc tan có giới hạn thì sự hòa tan của câu tử này vào hai câu tử kia theo một tỉ lệ nhât định ở nhiệt độ nhất định gọi là hăng sô phân bô Nernst K
Hang số phân bố của chất tan được tính theo công thức:
.-€_5
C, S,
Trong do K là hằng số phân bố của chất tan
C, là nồng độ chất tan trong pha a tai thời điểm cân bằng C¿ là nồng độ chất tan trong pha b tại thời điểm cân bằng
S¡, S2: Độ tan hai cầu tử
Hằng số phân bố của một chất cho biết khả năng hòa tan của chất đó đối với hai pha
long tại thời điểm cân bằng, hằng số phân bố của một chất tương đối ít thay đổi theo
Trang 19Chiết lỏng — lỏng là một kỹ thuật tách đơn giản nhất được sử dụng để làm sạch hoặc tách một câu tử riêng hoặc một loại cầu tử khỏi mẫu Mẫu rắn hoặc lỏng được chiết bằng dung môi thích hợp Sự lựa chọn dung môi chiết phụ thuộc vào tính tan của chất phân tích ở trong dung môi đó và phụ thuộc vào sự đễ dàng tách được chất cần tách ra khỏi mẫu
Quá trình chiết lỏng lỏng tiến hành theo ba bước:
Bước 1: Cho dung môi thích hợp tiếp xúc với dung địch chứa chất phân tích Bước 2: Phân tách thành hai pha: địch chiết (E-extract) và dịch bã (R-raffinate)
Bước 3: Tách và thu hồi dung môi chiết từ hai pha địch chiết và dich bi
Sự làm giàu chất và hiệu quả của phương pháp chiết phụ thuộc tỉ số thể tích của mẫu và dung môi chiết, phụ thuộc hệ số phân bố của chất cần phân tích trong dịch
chiết và dịch bã Tý lệ thể tích của mẫu và dung môi không thể lẫy quá rộng vì nó
ảnh hưởng đến độ chính xác khi định lượng Hệ số phân bố có thể cải thiện nhờ
thay đổi pH mẫu, khử muối hoặc sử dụng ion đối Ưu nhược điểm:
Quá trình chiết lỏng — lỏng được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực hóa học, thực phẩm, được phẩm với những ưu điểm: tiện lợi, không đòi hỏi tay nghề cao
Tuy nhiên, mất nhiều thời gian, tốn nhiều dung môi, thường gặp tình trạng tạo nhũ
hoặc chiết không hết chất và cần xử lý tiếp Dịch chiết còn lẫn nhiều tạp chất 2.2 Kỹ thuật chiết lỏng - rắn
Chiết lỏng — răn được áp dụng để tách các chất phân tích ra khỏi mẫu vật rắn như
thực vật, đất, các mẫu sinh học, bằng dung môi thích hợp Các chất phân tích trong mẫu răn thường nằm ở thành nang nhỏ hoặc phân tán trong chất rắn, vì vậy cần nghiền nhỏ để tăng bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất phân tích Tùy vào thuộc tính phân cực của chất cần tách mà lựa chọn dung môi chiết phù hợp, bắt đầu từ những dung môi hidrocarbon nhẹ đối với những chất ít phân cực đến những dung môi phân cực hơn như diethyl ether, acetone, ethanol kế cá nước đối với những chất phân cực
2.2.1 Chiết bằng phương pháp xay trộn với dung môi 2]
Áp dụng đối với mẫu rau cải, thịt cá Dung môi phải đi sâu được vào nền mẫu vì vậy cần xay nhuyễn mẫu để tạo diện tích tiếp xúc lớn giữa mẫu và dung môi Sau
đó, dùng dung môi thích hợp để hòa tan chất phân tích Mục đích của quá trình này
là tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu và hạn chế đến mức tối thiêu chất đồng trích
ly
Trang 20
2.1.2.2 Chiết bằng phương pháp cơ học trộn rung (Vortex) 2]
Áp dụng cho rau cải đã xắt nhuyễn, hạt nhỏ, chất lỏng Mẫu được trộn đều với dung
môi ở tốc độ cao, với tác động mạnh của lực cơ học, dung môi sẽ thấm sâu vào bên trong các cơ thịt, mô tế bào làm phá vỡ cấu trúc của chúng thành những mảnh vụn
Do đó chất phân tích dễ đàng phân bố vào pha hữu cơ hơn Dịch chiết thu được sau
quá trình này cần phải xử lý tiếp dé loại tạp chất
2.2.3 Chiết bằng phương pháp chiết Soxhlet mẫu rắn ™!
Nguyên tắc: chưng cất hôi lưu liên tục mẫu với dung môi hữu cơ, làm chât phân tích
trong mẫu tan vào dung môi hữu cơ
Chất phân tích phải tan tốt vào trong dung môi hữu cơ, pha chiết phải tỉnh khiết, bền, không làm hỏng chất phân tích, nhiệt độ thích hợp
Thích hợp cho các mẫu răn như lá cây, rau quả, đất hước ra Tước vào Binh chiva dung mé1 Bép dun
Hinh 2.1 So dé chiét Soxhlet
Bếp đun: cung cấp nhiệt độ cho dung môi bay hơi và hòa tan chất phân tích vào
dung môi
Dung môi: hòa tan chất phân tích, tách chất cần phân tích ra khỏi mẫu ban đầu
Trang 21Tiết kiệm dung môi, không phái tốn công lọc và bố sung thêm dung môi mới
như các kỹ thuật chiết khác Tương đối trích được hết chất
Ly trích tự động liên tục Nhược điểm:
Không chiết được lượng lớn mẫu
Không chiết được các chất kém bên nhiệt do địch lượng mẫu chiết phụ thuộc vào kích thước của máy Soxhlet chiết liên tục bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi
Giá thành thiết bị khá cao, dễ hư hỏng, dễ vỡ và khó thay thế
2.2.4 Chiết bằng chất lỏng siêu tới han (supercritical fluid method) lãi
Tuy đã được biết đến cách đây rất lâu (1879) nhưng mãi đến thập niên 1980,
phương pháp này mới được áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật chiết các hợp chất thiên
nhiên ra khỏi thục vật như tinh dầu cà phê, trà, gia vị
Một hợp chất sẽ hiện điện ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn tương ứng của nó
Ưu điểm
Chat long siêu tới hạn có khả năng khuêch tán thầm vào bên trong mẫu chiệt nhiều so với sự chiết băng dung môi theo các phương pháp khác Chất lỏng siêu tới hạn có độ nhớt thấp, có áp suất hơi cao
Có sự chọn lọc cao đối với chất cần chiết tách
Phủ hợp với loại hợp chất nhạy với nhiệt độ
Phương pháp thân thiện với môi trường
Nhược điểm
Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền
Sự hiện diên của nước trong mẫu chiết thường gây khó khăn cho quá trình
chiệt Phương pháp này không thích hợp đôi với mâu chiệt ở dạng lỏng
Phương pháp này thường sử dụng dung môi là CO; lỏng nên không phù hợp đê chiêt các hợp chât có tính phân cực
Trang 22
2.2.5 Ky thudt chiét pha ran (Solid phase extraction, SPE) 5]
Ngày nay hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký đều sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn Ứng dụng cho nhiều loại nền mẫu khác nhau như: các
loại mẫu môi trường, mẫu được phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu thực phẩm
Kỹ thuật chiết pha rắn là sự tương tác giữa các chất tan (solutes) trong một dung dịch lên trên chất hấp thu (adsorbent)
Kỹ thuật chiết pha rắn thường được áp dụng nhằm các mục đích sau: Xác định mức độ phân cực của một hợp chất chưa biết
Làm giàu mẫu nhăm làm tăng độ nhạy cho quá trình phân tích mâu, loại bỏ các tạo chât gây nhiêu nên không mong muôn, thay đôi nên mâu của chât phân tích
Phân chia hỗn hợp ban đầu chứa các hợp chất từ không phân cực đến phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau
Các cầu tử cần phân tích và các chất cản trở nằm trong pha lỏng Khi cho chất lỏng chay qua cét nhéi chat hap thu (conditioning of the absorbent), qua trình chiết tach xảy ra theo các trường hợp sau:
Các cầu tử cần phân tích được lưu giữ lại trên chất hấp thu, còn các chất cản trở không bị lưu giữ được thải ra khỏi cột theo dòng chảy, sau đó chất cần phân tích được rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp
Ngược lại, các chất cản trở bị lưu g1ữ lại trên chất hấp thu, con cau tử cần
phân tích không bị lưu giữ chảy ra khỏi cột theo dòng chảy
Trong đa số trường hợp, các câu tử cần phân tích và các chất cản trở cùng bị giữ lại
trên cột chất hấp thu Khi đó cần rửa chọn lọc bằng những dung môi đủ mạnh để
loại bỏ các chất cản trở, nhưng lại đủ yếu để các cầu tử cần phân tích nằm lại sau, hoặc rửa giải chọn lọc các cầu tử cần phân tích trong dung môi và để lại các chất can trở bị lưu giữ mạnh trên cột chất hấp thu
Trang 23
Cấu tạo của cột SPE: Cột gồm hai bộ phận chính:
Thân cột: có dạng giống vỏ bơm tiêm, thể tích từ 1 mL — vài chục mL„ vỏ bên ngoài được chế tạo bằng chất dẻo chịu dung môi, có ghi ký hiệu, chủng loại và tính chất
của cột
Lòng cột: từ 0.5 - vài cm chứa luợng pha rắn có khối lượng thường từ 100 — 500 mg, kích thước hạt thường Sum
Hình 2.2 Hình dạng cột SPE
Thân cột: chứa dung môi và các dung dịch cho qua cột (2) Chat hap thu: lưu giữ các chất phân tích lại trên cột @) Đuôi cột: gan kết cột vời bộ chiết
Trang 24
Hình 2.3 Cấu tạo bộ chiết SPE
Bộ chiết SPE gồm có:
(1) Binh chiet lam bang thuy tinh, co nap day kin, trên nắp có các vị trí găn cột
SPE vào, phía dưới có đầu găn nôi với máy bơm
(2) Van điều chỉnh tốc độ dòng chảy của dung môi và các dung dịch di qua cột @) Đầu gắn máy bơm: máy bơm dùng để hút dung địch thải ra khỏi bình chiết,
tạo vùng chân không trong bình để làm khô cột trong quá trình chiết
(4) Van điều chỉnh áp suất: dùng để điều chỉnh độ chân không trong bình chiết 6) Đồng hồ chỉ thị độ chân không trong bình chiết
Trang 25
Bang 2.1 Cac chat hap phu ding trong kỹ thuật chiết pha rắn ]
Loai Cau tric Tinh chat
Cig — octadecyl Không phân cực
Chất
Cs — octyl Không phân cực vừa phải
hâp
thu C2 - etyl Không phân cực yếu
không | CH_ cyclohexyl Không phân cực yếu
phan ` `
PH — phenyl Không phân cực vừa phải Cực
CN - cuối dây có cyanopropyl | Không phân cực vừa phải/phân cực
Chất CN — cyanopropyl Khong phan cuc vua phai/phan cực
hap |2OH-diol Phân cực
thu
Si — silica Phan cực
phan
cực NH; — aminopropyl Phân cực
Chất SCH- acid benzensulfonic Cation mạnh
trao PRS — acid propylsulfonic Cation manh đỗi CAB - acd carboxylic Cation yêu cation SAX - amin thứ cấp Anion manh Chat
trao PSA — amin nhất và nhị cấp Anion yếu/phân cực
Trang 26Các bước tiễn hành trong quá trình chiết pha rắn
Cho mau Rửa cột
Hoạt hóa cột qua cot (Loại tạp chat) Rua B141 | |e | Dich thai Dich chiét (chứa chất phân tích)
Hình 2.4 Các bước tiễn hành kỹ thuât chiết SPE
Bước I: Lựa chọn cột SPE thích hợp dựa vào thể tích mẫu chiết, mức độ tạp chất, tích phức tạp của mẫu, lượng các chất quan tâm, loại dung môi
Bước 2: Hoạt hóa cột
Mục đích làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp phụ chất phân
tích Việc hoạt hóa pha rắn không phân cực được thực hiện qua hai g1a1 đoạn:
Giai đoạn l: Hoạt hóa với dung môi tan tốt trong nước như methanol,
isopropanol Thé tích dung môi sử dụng bằng 4 - 8 lần tổng thể tích của các
khe hở giữa các hạt trong cột cộng với thê tích xốp của chất hấp thu (bed volume) hoặc 2 - 3 lần thể tích cột Nếu sử đụng ít hơn thể tích qui định sẽ
làm cho pha rắn không được solvate hóa hoàn toản dẫn đến kết quả độ thu
hồi thấp
Giai đoạn 2: Hoạt hóa với dung môi hòa tan mẫu, thể tích dung môi sử dụng tương tự gia1 đoạn Ì
Đối với pha rắn phân cực hoạt hóa với dung môi không phân cực Sau bước này cột SPE không được làm khô vì nếu cột bị khô quá trình solvate hóa sẽ bị phá hủy Bước 3: Mẫu chứa chất phân tích được chảy qua cột
Mẫu được cho qua cột SPE với tốc độ đòng chảy của mẫu khoảng 1 mL/ phút Có
thể nạp một lượng mẫu khoảng 5% lượng pha tĩnh, mẫu phải được hòa tan trong dung môi thích hợp
Trang 27
Bước 4: Rửa cột đề loại bỏ các chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột để giữ lại chất phân tích Trong suốt quá trình thực hiện từ bước 1 đến bước 4 không để cột bị khô Sau khi quá trình rửa cột kết thúc mới tiến hành làm khô cột
Bước 5: Rửa giải chất cần phân tích ra khỏi chất hấp thu bằng dung môi thích hợp,
dung môi được chọn này phải đặc trưng để phá vỡ tương tác giữa chất phân tích và chất hấp thu với mục đích rửa giải được chất phân tích
Tốc độ rửa giải vừa phải, khoảng 1 mL/phút không được chảy quá nhanh
Bảng 2.2 Các dung môi thường dùng trong chiết pha rắn có tính phân cực tăng dần dựa vào hằng số điện môi P)
Độ phân cực Dung môi Hằng số điện Khả năng tan môi ở 25C trong nước
Không phân | Hexan 1.9 Khong
cực Cyclohexan 2.0 Không
Carbon tetrahydrochloride 2.2 Không
Diethyl ether 4.2 Không Chloroform 4.7 Không Ethyl acetate 6.0 it Acid acetic 6.2 Có Tetrahydrofuran 7.4 Có Dichlorometan 8.9 Khong Aceton 20.7 Có Methanol 32.6 Có Ỷ Acetonitrile 37.5 Có Phân cực | Nước 78.5 Có
Những tương tác của phân tử ở cột SPE:
Tương tắc không phân cực (nonpolar 1nteractions)
Tương tác không phân cực là tương tác xuất hiện giữa những hydrocarbon của các nhóm chức của chất hấp thu và chất phân tích Hầu hết các hợp chất hữu cơ có cầu trúc không phân cực có thê được hấp thu trên các chất hấp thu không phân cực nhờ lực hút Van — der —waals
Trang 28
Những chất hấp thu không phân cực đặc trưng là các silica được bố sung C18, C18 hydra, C8 Do các nhóm chức của các chất hấp thu này là các nhóm alkyl, các alkyl này có thể tương tác với hầu hết các chất phân tích không phân cực nên tính chọn
lọc của các chất hấp thu loại này kém
Vì vậy các chất hấp thu này có thể được dùng để tách những hợp chất có cấu trúc khác nhau
Tuong tac phan cuc (polar interactions):
Tương tác phân cực bao gồm các liên kết hydrogen, liên kết lưỡng cực và các liên kết x-m Các liên kết này xuất hiện giữa nhiều chất hấp thu khác nhau và các nhóm chức của chất phân tích Các tương tác này có thê là giữa nhóm amino, nhóm hydroxyl với nhóm carbonyl hay giữa các vòng thơm, các liên kết đôi với các nguyên tu nhu Nitrogen, Sulfur, Phospho va Oxy
Những chất hấp thu đặc trưng cho tương tác phân cực là unmodified silica, va cdc silica được bổ sung các nhóm -CN, -NH; và diol
Thông thường, những hợp chất phân cực được hấp thu một cách đễ dàng lên các chất hấp thu phân cực từ môi trường không phân cực và được rửa giải với đung môi phân cực Ngược lại, những hợp chất không phân cực được hấp thu từ môi trường phân cực lên các bề mặt phân cực Quá trình rửa giải được tiễn hành với những dung môi ít phân cực hơn
Tương tác ion (Ionic interactions):
Tương tác ion là tương tác giữa các chất phân tích mang điện tích với những nhóm
chức mang điện tích ngược lại Các nhóm catlon tồn tại ở dạng amin bac 1, 2, 3 và
4 Cac cation v6 co nhu 1a magie, canxi nhom cac anion 1a cacboxilic, sulfonic acid, phosphate và những nhóm tương tự
Ưu điểm của phương pháp SPE
Khả năng tự động hóa và làm hàng loạt cao
Tính đặc hiệu và chọn lọc đối với hất phân tích cao, có khả năng tương thích với phân tích sắc ký
Tiết kiệm dung môi tiêu thụ
Trang 29Ngoài ra, còn nhiều kỹ thuật chiết tách khác như ly trích bằng siêu âm, ly trích bằng
vi sóng, kỹ thuật vi ly trích trên pha rắn SPME (Solid Phase Micro Extraction), kỹ thuật phân tán trên pha rắn, cũng được áp dụng với các mục đích như làm giàu mẫu và phân lập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu khác nhau
Trang 30
CHƯƠNG II
PHUONG PHAP PHAN TÍCH
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, kỹ thuật phân tích trong
hóa học cũng đã phát triển rất mạnh mẽ với nhiều phương pháp tích khác nhau như
phương pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp hóa lý Trong phương
pháp vật lý thì kỹ thuật sắc ký nói chung và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
nói riêng đã được ứng dụng rất rộng rãi để tiến hành định tính và định lượng trong
hóa học Trong điều kiện thực hiện đề tài này, chỉ giới thiệu phương pháp định
lượng Thiamphenicol và Enrofloxacin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và định tính chúng với phương pháp sắc ký lớp mỏng
1 Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
1.1 Lịch sứ phát triển của HPLC ©“!
Việc cần thiết phân tích các hợp chất là nhu cầu bức thiết trong cuộc sống, kỹ thuật
sắc ký khí GC chỉ có thê phân tích được một hỗn hợp khi mỗi cấu tử của hỗn hợp
phải có áp suất hơi phù hợp với nhiệt độ làm việc của cột sắc ký và mẫu khảo sát phải có tính bay hơi, chỉ có khoảng 20% các hợp chất là phù hợp cho việc phân tích bằng sắc ký khí Để có thể đáp ứng được yêu cầu nói trên, kỹ thuật sắc ký lỏng (liquid chromatography, LC) được phất triển, hoàn thiện để có được kỹ thuật sắc ký
lỏng hiệu năng cao (hiph performance liquid chromatography, HPLC)
Năm 1967, Horvath C là tác giả đầu tiên đã tạo ra máy HPLC để nghiên cứu về nucleotid Ngày nay, với các ưu điểm như áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc
ký nhanh HPLC được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa đạng như phân tích được phẩm, các dung dịch sinh lý, polymer thiên nhiên hoặc tổng hợp, các
loại dư lượng trong môi trường, nhiều loại hợp chất vô cơ, các loại nguyên tố hiện diện trong mẫu phân tích ở dạng vết, Hơn nữa, các loại đầu đò ding cho HPLC không làm hư hại mẫu phân tích, có thể thu hồi mẫu để thực hiện các nghiên cứu khác như phân tích phổ, thử nghiệm hoạt tính sinh học
Trong sắc ký cột (có dạng rắn - lỏng hay lỏng - lỏng ), kỹ thuật sắc ký lỏng áp suất thường đã ra đời và được ứng dụng từ lâu (trên 60 năm) Nhưng hiệu suất tách không cao, độ nhạy thấp và tốn nhiều thời gian cũng như dung môi để chạy sắc ký Ngược lại kỹ thuật HPLC tuy mới ra đời và phát triển khoảng trên chục năm lại đây,
nhưng hiện nay đang được phát triển rất nhanh và đã ứng dụng rất rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nhau của nghiên cứu khoa học và công nghệ Vì kỹ thuật tách sắc ký này có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao, tốn ít thời ø1an cũng như tốn ít mẫu
Trang 31
Nam1906 Tswett (Nga) cho dung dich sac tố thực vật lên cột nhồi bằng CaCOa, các sắc tố đi chuyển xuống với tốc độ riêng, tách thành những vùng màu Ông gọi phương pháp này là sắc ký
Năm 1938 lzmailov và Schaiber xây dựng sắc ký lớp mỏng Năm 1958 Stahl hoàn thiện sắc ký lớp mỏng
Năm 1941 Martin và Synge đặt nền tảng cho sắc ký phân bó
Năm 1952 Martin và Tames công bố sắc ký khí Năm 1960 phương pháp này phát triển mạnh
Từ năm 1960-1970 HPLC được xây dựng và phát triển
1.2 Khái niệm và nguyên tắc hoạt động của HPLC [2]
1.2.1 Khai niém
Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa
theo những tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất trong những điều kiện nhất định Các tính chất đó có thể là tính chất hấp phụ của chất rắn, tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion, su ray phân tử theo kích thước của chúng, sự tạo phức và sự
liên hợp phân tử, sự phân bố của các chất giữa hai pha không tan vào nhau
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đôi
bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ
chế hấp phụ, phân bó, trao đôi ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) Pha tĩnh (stationnary phase) có tác đụng giữ hóa chất
Pha động (mobile phase) trong đó hóa chất hòa tan Nguyên tắc:
Hợp chất có ái lực ít với pha tĩnh thì có xu hướng ra khỏi cột trước
Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh bị giữ lại lâu hơn trong cột và ra sau 1.2.2 Nguyên tắc hoạt động
Hệ thống đung môi đóng vai trò là pha động được máy bơm cao áp hút qua bộ khử khí (Degasse) nhằm loại bỏ hết bọt khí còn sót lại trong dung môi trước khi qua máy bơm, sau đó đung môi được trộn với nhau theo tỷ lệ đã chọn (điều khiển bằng máy tính) và được bơm liên tục qua cột tách
Trang 32
Mẫu phân tích được đưa vào cột tách băng bộ phận tiêm mẫu sau đó được pha động đây qua cột tách, quá trính tách chất phân tích xảy ra ở đây
Các chất sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào đầu dò (detector) thích hợp và được chuyển thành tín hiệu, được khuếch đại và chuyển đến bộ phận ghi, xử lý kết quả Trong HPLC, pha tĩnh trong cột là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion
Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử
Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha động
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác Chất phân tích A + B + C Fl F2 F3 A Vv Pha tinh Pha động
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên
khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) và ngược lại
Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở day F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột
Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ đi chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi
cột
Trang 33
1.3 Cách phan loai sac ky trong HPLC "7! Trong HPLC được chia thành hai loại chính:
HPLC voi pha thuong (Normal — phase HPLC)
Pha tinh nhu silica ( pH = 2 — 8 ), alumina ( pH = 2 — 12 ), diol, -NH, ghép nhánh,
Pha động: Dung môi ít phân cực hơn như hexan, CHC]a,
HPLC pha thường còn được xem là kỹ thuật sắc ký hấp thu, đây là phương pháp sử dụng một pha động không phân cực kết hợp với một pha tĩnh phân cực
HPLC với pha đảo (Reversed — Phase HPLC)
Pha tĩnh: bề mặt ky nước tạo bởi các dây nhánh C18, C§, C4, Phenyl, Pha động: thông dụng Metanol, Acetonitrile, nước hay hỗn hợp hai hay ba dung môi trên
Áp dụng: trên 80% trường hợp sử dụng cột pha đảo trong phân tích HPLC 1a do: Chất phân tích được giữ trên pha tĩnh phân cực nhỏ hơn cho đến khi bị rữa trôi bởi pha động phân cực đủ lớn
Thao tác đơn giản Hiệu quả cao
Cột làm việc én dinh Co thé phan tich cho ca hai loai cầu tử có đặc tính
tương tự hoặc khác xa nhau
Trang 341.4.1 Dung môi
Hệ thống HPLC thường có 4 bình chứa dung môi để rửa giải cột, cho phép sử dụng đến 4 loại dung môi cho việc rửa giải nhờ bộ phận trộn sau máy bơm Tuy nhiên thực tế thường chỉ sử đụng 2 loại dung môi để quá trình pha trộn dung môi được đồng nhất và hệ pha động đơn giản giúp quá trình rửa giải Ơn định
Dung mơi dung cho HPLC co thể là nước, các loại dung dịch đệm, methanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp các loại trên Tất cả dung môi phải có độ tỉnh khiết cao
đạt tiêu chuẩn HPLC, không có lẫn bụi bẫn, bọt khí Trước khi lắp đặt vào hệ thống,
các bình dung môi cần được khử hết bọt khí còn lẫn trong dung môi bằng cách đặt bình dung môi đã mở nắp vào bồn siêu âm và cho máy siêu âm hoạt động trong 5 —
10 phút để loại bọt khí
1.4.2 Bộ khử khí (Degasse)
Trước khi lắp một bình dung môi vào vị trí hoạt động, cần phải loại bỏ phần không khí đã hòa tan vào dung môi trước đó gọi là khử bọt khí (degassing)
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động
Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì có thé gầy ra một số hiện tượng sau đây:
Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lẫy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi và gây ra hiện tượng nhiễu đường nền
Trong trường hợp bọt quá nhiều bộ khử khí không thê loại trừ hết được thì
có thể bơm sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy
sắc ký sẽ ngừng hoạt động
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai 1.4.3 Bom (Pump)
Mục đích là bơm pha động vào cột để thực hiện quá trình sắc ký,bơm của máy HPLC là loại máy bơm cao áp dùng để duy trì một tốc độ chảy của pha động qua cột một cách liên tục, áp suất có thể đạt đến 400 bar, có thê điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0.05-10 mL/phút, bơm có thể dùng để trộn 2 đến 4 lọai dung môi khác nhau
1.4.4 Hé thong tiém mau (injector)
Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích với thể tích từ 1ul - 100u1
Có hai cách đưa mẫu vảo cột là tiêm mẫu bằng phương pháp thủ công (bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample)
Trang 35
1.4.5 Cột (Column)
Cột sắc ký chứa pha tĩnh thường làm bằng thép không gi có nhiều kích thước khác
nhau, thông thường từ 10-30cm hạt nhồi cột đường kính của hạt khác nhau (® =3-
10um) tùy thuộc vào mục đích sử dụng Chất nhồi cột thông thường: C18 còn gọi là
octadecyl hoac ODS; C8, con goi 1a octyl; trimethylsilyl, còn gọi là TMS hoặc Methyl; Phenyl Chất nhồi thường có hai dạng là dạng hình cầu va dạng vô định hình, kích thước thường ở 3 cỡ là 3ùm, 5m và 10m Hạt càng nhỏ thì khả năng
tách càng tốt nhưng chậm ra peak và làm tăng áp lực bơm pha động
Voi HPLC thường dùng cột 150 x 4.6mm, Suụm và 250 x 4.6, Sum
1.4.6 Đầu do (Detector) ®!
Đầu do là bộ phận theo dõi và phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột một cách
liên tục
Nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất phân tích dựa theo một tính chất hoá học hay hoá lý hay tính chất vật lý nào đó của chất phân tích Tùy theo tính chất của chất phân tích mà người ta lựa chọn đầu đò thích hợp và phải thỏa mãn điều kiện trong cùng một nồng độ nhất định của chất phân tích
A= k.C
Trong đó: A — Tín hiệu thu được
C_- Nông độ chất phân tích
k — Hãng số thực nghiệm của đầu dò đã chọn Tín hiệu này có thể là
độ hấp thu, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết
suất )
Trên cơ sở đó người ta chế tạo ra các loại đầu dò sau: - Đầu đò quang phổ tử ngoại (UV )
- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS ): đây là loại thông dụng nhất hiện nay dùng để phát hiện các chất hấp thụ quang
- Đầu dò huỳnh quang: để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự
nhiên cũng như các dẫn xuất có huỳnh quang các hydrocacbon thơm đa
vòng (Polyaromatic hydrocarbon), các aminoaclde, các Peptide,
Vitamincatecholamines, Aflatoxine, ngoài ra người ta còn dùng kỹ thuật tạo dẫn xuất đề phát hiện các hợp chất không có khả năng phát huỳnh quang
Trang 36
- Đầu dò Diod Array (PDA/DAD photodiode Array/Diod Array Detector): là loại đầu đò mạnh nhất trong các loại đầu dò để đo phố tử ngoại vì các số liệu
quang phố cho mỗi peak sắc ký được ghi nhận và lưu lại ở một dãy phổ Giúp ích cho việc xác định bước sóng tôi ưu của các chât
Ngoài ra, trong HPLUC còn sử dụng một số đầu do khác như đầu đò chỉ số khúc xạ (Refractive index detector, RI đetector), đầu dò đo độ dẫn điện (Conductivity đetector), đầu dò amper kế (Amperometric detector), dau do LC — MS
1.4.7 Hé div ligu (Data system)
Thông thường người ta đùng máy tự ghi (recorder) dé ghi sắc đồ của sự tách, hay có thể dùng máy in (printer), bộ tích phân kế (intergrator), máy vi tính
2 Phân tích định tính °
Có nhiều phương pháp định tính Thiamphenicol và Enrofloxacin như phương pháp
hóa học, phương pháp HPLC (dựa vào thời gian lưu của chúng trong cột sắc ký),
phương pháp sắc ký lớp mỏng (Think Layer Chromatography - TLC) Ở nội đung
đề tài này chỉ giới thiệu phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc một hỗn hợp dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hap thu trơ như silica gel hoặc oxid alumin Pha tĩnh này được trang thành một
lớp mỏng đều, phủ lên một nên phăng như tấp kiếng, tắm nhôm hoặc tắm plastic ( Nắp đậy Pha tĩnh „ (chât hâp thu) «—— Bình sắc ký —— Tầm nên mỏng Mẫu cân phân tích — Pha động (dung môi) Hình 3.2 Bình sắc ký lớp mỏng
Bình sắc ký bằng thủy tinh có nắp đậy
Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0.25mm của một loại chất hấp thu như silica gel,
alumin, được tráng thành một lớp mỏng đều phủ lên một nền phẳng như tấm
Trang 37
kiếng, tắm nhôm hoặc tấm plastic Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci
khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ
Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp nhiều chất có độ phân cực khác nhau, sử dụng vi quản chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng (pha động) đang chứa trong bình sắc ký
Pha động: một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển dọc theo tấm lớp mỏng
và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi đi chuyển nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau
mực của dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện giữa pha tĩnh và các thành phần của mẫu chất (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ tan của mẫu chất trong dung môi
Phương pháp tiễn hành
Dùng ống mao quản chấm lần lượt các điểm của dung dịch chuẩn đối chứng và
dung dịch mẫu cần phân tích lên bản sắc ký Với mỗi điểm, chấm nhiều lần nhưng
giữ cho vết chấm không lan rộng Sau khi chấm hoàn tất, tiến hành làm khô để dung
môi bay đi khỏi vết chấm rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly, đậy nắp bình sắc ký
lại
Khi dung môi di chuyển lên tới mức tiền tuyến thì lấy bản sắc ký ra khỏi bình giải
Trang 38Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng: chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích, có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích
Tất cá các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tắm sắc lớp mỏng
3 Phân tích định lượng 1°?
3.1 Dựng đường chuẩn I
Đường chuẩn thể hiện cho tính tuyến tính của quy trình phân tích Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp đựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng (response) của đại lượng đo được (y) và nồng độ (concentration) là một một đường thăng (x)
y=ax+b
Đại lượng đặc trưng cho tính tuyến tính là hệ số tương quan R (coefficient of
correlation) Thuong chấp nhận sự tuyến tính khi 0.95 < RỶ < 1
3.2 Hiệu suất thu hồi
Hiệu suất thu hồi là % hàm lượng chất phân tích đo được sau một hay nhiều giai đoạn thực hiện của phương pháp phân tích so với hàm lượng chất phân tích thực ban đầu
Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 80 — 100%, quy trình lý tưởng thì hiệu suất đạt
95% Đối với các mẫu phức tạp hiệu suất thu hồi có thể đạt từ 70 — 75%
Cách đo hiệu suất thu hồi băng phương pháp thêm chuẩn:
Mẫu trắng không chứa chất phân tích có nền mẫu giống như mẫu muốn đo
Mẫu phân tích có chứa chất phân tích: tiến hành quy trình phân tích để xác định
lượng chất phân tích ban đầu có trong mẫu ký hiệu Cụ
Thêm vào một lượng chất phân tích có nồng độ xác định (Cc) vào mẫu cần phân tích, thực hiện quy trình phân tích để xác định lượng chất phân tích (Cục) đã thêm
vào mẫu và tính hiệu suất thu hồi theo công thức:
Cục — Cu — Cp
%H = ————— x 100
Co
Trong đó: Cg— nồng độ chất phân tích có trong mẫu trăng (bị nhiễm mẫu)
Cụ — nồng độ chất tích có trong mẫu phân tích Cc— nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích
Cục — nồng độ chất tích có trong mẫu phân tích đã được thêm chuẩn
Trang 39
3.3 Xac dinh RSD, LOD, LOQ ”!
RSD ( Relactive Standard Deviation): Độ lệch chuẩn tương đối (%) là đại lượng đặc trưng cho độ chính xác của phương pháp phân tích, cho biết mức độ phân tán của các phép thử song song khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định
LOD (limit of đetection) là cực tiểu phát hiện được của phương pháp phân tích, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu nhất định mà thiết bị có thể
phát hiện được
LOQ (limit of quantitation) là cực tiểu đo được của phương pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng được với một RSD% quy định
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng được xác định dựa vào đường chuẩn, trong quá trình xây dựng dường chuẩn, ứng với từng nồng độ pha chuẩn C; ta đo được diện tích peak tương ứng S
Xác định hệ số hiệu chỉnh tuyến tính theo công thức: ACS;= C, S 5 _LkL_2+ +—* Xác định hệ số hiệu chỉnh tuyến tính trung bình ACS= 3 (ACS, - ACS ƒ
Xác định độ lệch chuẩn SD theo công thức SD = ¡— 1
Xác định độ lệch chuẩn tương đối RSD theo công thức RSD( % )= — 100
Trong dé: ACS; - là hệ s6 hiéu chinh tuyén tính ở từng nồng độ chuẩn C; - Nồng độ chuẩn pha
Š$, — Diện tích peak tương ứng của từng chuẩn ¡ - Số lần đo
Tiêu chuẩn chấp thuận cho độ chính xác phụ thuộc nhiều vào loại chất phân tích Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác khoảng 15% ở giới hạn nồng độ định lượng Đối với mẫu thực phẩm và mẫu môi trường, độ chính xác tùy thuộc rất nhiều vào mẫu phân tích, nồng độ chất phân tích và kỹ thuật phân tích Trong các
trường hợp này, RSD(%) có thê thay đổi từ 2% đến khoảng 20% (theo hiệp hội hóa
học quốc tế AOAC) hay FDA (Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ - Food and
Drug Administration) phân tích thuốc trong dịch sinh học là 15 — 20%
Trang 40
10* SD 3*b 10* SD b
Xác định giới hạn phát hiện LOD theo công thức LOD=