Ứng dụng kỹ thuật sắc ký trong nghiên cứu hóa sinh

Ứng dụng kỹ thuật sắc ký trong nghiên cứu hóa sinh

Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ TRONG NGHIÊN CỨU HÓA SINH HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học MỤC LỤC HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học MỞ ĐẦU Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác nhau. Các hợp chất bao gồm đại phân tử protein, acid nucleic, lipid,… hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ. Những hợp chất diện số lượng nhỏ, dạng vết (enzyme) hay số lượng nhiều (các protein cấu tạo). Người ta muốn biết thành phần hóa học tế bào, nhằm hiểu rõ quy trình biến đổi nó, qua giúp sống ngày thêm tốt đẹp. Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học. Từ đó, kỹ thuật tách riêng hợp chất đời với tên gọi sắc ký (chromatography). Ngày nay, sắc ký sử dụng để tách tất hợp chất dù có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học NỘI DUNG 1. Tổng quan kỹ thuật sắc ký 1.1. Lịch sử sắc ký Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett cho dung dịch sắc tố thực vật ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy sắc tố bị hấp phụ lên đầu cột. Khi cho ete dầu hoả lên cột, sắc tố di chuyển cột từ xuống dưới, sắc tố có tốc độ riêng, tách thành vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành hệ mà Tvest gọi sắc đồ. Ông đặt tên cho phương pháp tách sắc ký (Chromatography). Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa chất màu, graphein có nghĩa viết. Tên gọi ngày sử dụng phương pháp dùng tách chất không màu. Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực. Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách hợp chất mang điện tích theo trọng lượng phân tử chúng. Đến năm 1964, Moor gọi “gel permeation chromatography” hay gọi sắc ký lọc gel. Năm 1906, sắc ký khí biết đến đến 1952, kỹ thuật phát triển mạnh mẽ, thập niên 1960. Năm 1967, Horvath C. tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp. 1.2.Định nghĩa sắc ký HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học Sắc ký nhóm phương pháp hoá lý dừng để tách thành phần hỗn hợp. Sự tách sắc ký dựa phân chia khác chất khác vào hai pha tiếp xúc không hoà lẫn vào nhau: pha tĩnh pha động (Trong thí nghiệm Tvest: pha tĩnh canxi cacbonat, pha động ete dầu hoả). Pha tĩnh trì hoãn di chuyển thành phần mẫu. Khi thành phần di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng tách khỏi theo thời gian. Mỗi thành phần qua hệ thống khoảng thời gian riêng biệt, gọi thời gian lưu. Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp chuyên chở chất lỏng khí thành phần tách phân bố khác pha chất hòa tan chúng chảy qua pha tĩnh rắn lỏng. Nhiều kỹ thuật khác dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa tính khác chất môi trường động khí lỏng môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua giấy, gelatin hay gel magnesium silicate, . Sắc ký phương pháp để phân tách tinh phân tử sinh học. Sắc ký phương pháp nhanh, dễ dàng không ảnh hưởng đến protein, phương pháp đề nghị nghiên cứu định lượng protein hay phân tử. Các giai đoạn trình sắc ký: Quá trình sắc ký gồm giai đoạn chính: a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch sắc tố lên đầu cột canxi cacbonat). Các chất giữ pha tĩnh. b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động kéo theo chất di chuyển pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi có vị trí khác pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram). Giai đoạn gọi khai triển sắc ký. Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua chất bị kéo pha tĩnh (ví dụ: khỏi cột). Đó trình rửa giải HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học dung môi dùng dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng cuối cột gọi dịch rửa giải (eluate). Nếu chất tách pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta lấy phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột cột) đem chiết lấy chất. Nếu chất tách pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta hứng thu lấy phân đoạn dịch rửa giải có chất cần phân tích. c) Phát chất: Các chất màu phát dễ dàng, chất không màu phát đèn tử ngoại hay thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải phát chất chúng khỏi cột cách cho dung dịch rửa giải qua phận phát gọi detector đặt sau cột. 1.3. Phân loại phương pháp sắc ký 1.3.1. Theo chất vật lý pha Pha động chất lỏng hay chất khí Pha tĩnh chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay chất lỏng (được giữ chất mang rắn). Do đó, dựa vào chất pha ta phân biệt phương pháp (trong tên phương pháp, pha động nêu trước pha tĩnh): • • • • Sắc ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC) Sắc ký lỏng - rắn (liquid - song chromatography LSC) Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC) Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC) 1.3.2.Theo tượng sắc ký Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh chất rắn có khả hấp phụ, phương pháp sắc ký lỏng - rắn khí - rắn. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh chất lỏng không hoà lẫn với pha động, chất lỏng bao bề mặt chất rắn gọi giá hay chất mang phải chất trơ, không tham gia vào sắc ký. Sắc ký phân bố bao gồm sắc ký lỏng - lỏng sắc ký khí - lỏng. Sắc ký trao đổi ion (ion - exchange chromatography): pha tĩnh chất nhựa trao đổi ion chớp chất cao phân tử có mang ion có khả trao đổi với ion dấu dung dịch hỗn hợp sắc ký). Sắc ký theo loại cỡ (size - exclusion chromatography): gọi sắc ký gel. Các phân tử cỡ lớn loạt phân tử nhỏ tách theo kích thước phân tử nhỏ di chuyển chậm hơn. 1.3.3.Theo kỹ thuật phương tiện sắc ký Phương pháp giữ pha tĩnh: Sắc ký cột (column chromatography: CC) pha tĩnh chứa cột kim loại hay thuỷ tinh. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh tráng giữ mặt phẳng thuỷ tinh, nhựa hay nhôm. Lớp mỏng pha tĩnh thường là: silicagel, nhôm oxit, cenlulose, chất nhựa trao đổi lớn có chiều dày khoảng 0,25 - 0,5mm. Sắc ký giấy (paper chromatography - PC) pha tĩnh (lỏng) thấm loại giấy lọc đặc biệt gọi giấy sắc ký Theo cách cho pha động chạy: Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép chất chạy tách pha tĩnh (Sắc đồ nằm pha tĩnh). HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy kép chất pha tính (ra khỏi cột, khỏi giấy). Tốc độ di chuyển chất, peak hình dáng peak Tốc độ di chuyển chất Tốc độ di chuyên chất đặc trưng hệ số phân bố hai pha đại lượng lưu giữ chất pha tĩnh (thời gian lưu, thể tích lưu) a. Thời gian lưu thể tích lưu Thời gian lưu thời gian cần để chất di chuyển qua cột sắc ký, khỏi cột nhờ thiết bị detector ghi nhận tín hiệu xuất rực sắc đồ (tính từ lúc bơm mẫu đến xuất peak). Tm thời gian lưu chất không bị lưu giữ, nghĩa tốc độ di chuyển tốc độ di chuyển trung bình dung môi, thời gian gọi thời gian chết. tR lớn, chất bị lưu giữ mạnh tốc độ di chuyển nhỏ. b. Hệ số phân bố Trong đó: Cs Cm nồng độ chất tan pha tĩnh pha động cân thiết lập. Khi nồng độ nhỏ K phụ thuộc vào chất pha, chất tan nhiệt độ K lớn chất phân bố nhiều pha tĩnh di chuyển chậm. Peak hình dáng peak a. Hình dáng peak: Hình dáng lý tưởng tức lực đối xứng, thực tế lúc sắc ký gần đối xứng. Chiều rộng tục đo 1/10 chiều cao peak. b. Sự kéo dài peak: kết di chuyển nhanh chậm khác phân tử chất qua cột sắc khí. Các lực chậm tù hơn. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học c. Hiệu lực cột: Hiệu lực cột thường đo hai thông số: số đĩa lý thuyết N chiều cao đĩa lý thuyết H. Ta coi cột sắc khí chia thành N lớp hay N tầng mỏng, lớp phân bố chất tan vào hai pha đạt trạng thái cân bằng. Những tầng mỏng giả định gọi địa lý thuyết. Nếu cột sắc khí có chiều dài L thì: H = N/L. Cột có N lớn cột có hiệu lực cao. d. Độ phân giải: Độ phân giải Rs tỉ số khoảng cách hai peak độ rộng trung bình peak. Rs = 0,75 hai pic tách không tốt, xen phủ nhiều; Rs = 1,0 hai pic tách tốt, xen phủ 4%; Rs = l,5 hai pic tách hoàn toàn (chi xen phủ 0,3%). 2. Các kỹ thuật sắc ký 2.1.Sắc ký giấy Sắc ký giấy phương pháp phân tách dễ dàng thành phần hỗn hợp (acid amin). Trong sắc ký giấy, pha tĩnh tờ giấy cellulose ( thí dụ tờ giấy thấm, giấy lọc phòng thí nghiệm). Các lọai giấy có tính nước nên thực tế, pha tĩnh lớp nước (H2O) thật mỏng che phủ lên bề mặt tờ giấy, sắc ký giấy lọai sắc ký phân chia. Pha động chất lỏng( chất lỏng hay hỗn hợp dung môi). Phương pháp thường sử dụng để tách chất ưa nước amino acid, đường, Trong giấy, cellulose có dạng sợi, sợi nằm cạnh tạo thành mạng lưới với lỗ rỗng to. Khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bề mặt sợi lỗ rỗng phủ đầy dung môi. Như thế, chất tan bị phân tán nhiều lỗ rỗng khiến vết sắc ký to hơn. Bột giấy hấp thu nước, nước bị giữ HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học lại cấu trúc glucopyranose cầu nối hydrogen, trình sắc ký xảy theo chế phân chia. Hình: Sắc ký giấy, chất màu di chuyển theo dung môi lên giấy với điểm khác nhau. (a) Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt góc mảnh giấy lọc, cạnh giấy nằm dung môi. (b) Dung môi di chuyển lên giấy lực hút mao mạch, chất phân bố theo tỷ lệ khác Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích thước phân tử hòa tan dung môi. (c) Những chất khác trải điểm khác biệt bảng , tạo thành sắc ký đồ. Hiện nay, sắc ký giấy dần thay sắc ký lớp mỏng. Do phần lớn chất hữu màu, nên sắc ký giấy không cho thấy vị trí mẫu chất trình dung môi di chuyển lên giấy. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học Receptors for epidermal growth factor Porcine enteropeptidase Rat brain glycopeptides Thyrotropin Ricinus communis Wheat germ agglutin α- Fetoprotein Erythropoietin Glycophorin A Receptors for insulin Receptors for somatomed 3.2.2.1. Tinh protein Wickerhauser cộng ông (70) sử dụng heparin – Sepharose để tiến hành tinh antithrombin III từ huyết người. Chuỗi trình tinh thể hình sau: (5.36) Plasma Cohn Fraction IV - Cryosupernatant +20% polyethylen glycol (final concentration) +20% polyethylen glycol Batch adsorption with (final concentration) heparin-Sepharose (5-8 g Fraction IV-1 to ml gel) Batch adsorption with heparin-Sepharose (45 ml plasma to ml gel) HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học Wash with 12.5 liters of 0.15 and 0.5 M NaCl Elute with 12.5 liters of M NaCl Concentrate on Pellicon cassette system to 500 ml Pasteurize with addition of citrate to 0.5 M pH 7.55, 10 h 60oC Desalt on Sephadex G-50 2.5 liter column 750ml solution Sterile filter Lyophilize Fisher Newsholme (72) phát triển quy trình kết hợp rửa tách enzyme adenosine kinase từ hệ thống sắc ký lọc gel vào hấp phụ enzyme lên 5’ – AMP – Sepharose 4B cột sắc ký lực. Dung dịch đệm sử dụng suốt trình tinh bao gồm 4mM Na2H2PO4, 2mM EDTA 5% glycerol pH 7.0 nhiệt độ oC. Enzyme adenosine kinase rửa tách khỏi cột sắc ký thu dung dịch đệm chứa 0.6mM enzyme. Quá trình sắc ký lực calmodulin cố định xem phương pháp tinh nhanh seminalplasmin bò đến độ tinh 99%. Quá trình rửa giải seminalplasmin khỏi calmodulin cố định đòi hỏi cần phải có mặt EDTA 4M urea dung dịch đệm. Hai loại enzyme malate dehydrogenase 3-hydroxybutyrate dehydrogenase thu từ chất chiết Rhodopseudomonas spheroides tinh cột sắc ký lực phối tử màu liên tiếp. Enzyme 3-hydroxybutyrate dehydrogenase rửa tách dung dịch KCl 1M enzyme malate dehydrogenase tách sau dung dịch đệm có chứa thêm 2mM NADH. Với kỹ thuật sắc ký lực thu 3-hydroxybutyrate dehydrogenase với hiệu suất 80% dùng phương pháp khác trình tinh phải trải qua giai đoạn riêng biệt hiệu suất đạt 9%. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học 3.2.2.2.Tinh interferon Knight Fahey (75) sử dụng Blue Sepharose Cl-4B trình tinh lực interferon từ nguyên bào sợi người. Interferon hấp phụ lên vật liệu lực dung dịch NaCl 2M protein tạp khác không. Interferon tinh khiết sau rửa tách khỏi Blue Sepharose dung dịch ethylen glycol 50%. Dung dịch khỏi cột sắc ký thu nhận vào dung dịch đệm cho tạo dung dịch có chứa 37% ethylen glycol interferon bền dung dịch ethylen glycol 37%. Thêm cột sắc ký sử dụng nhằm thu dung dịch có nồng độ interferon cao hơn. Sản phẩm thu có hoạt tính 5x108 đơn vị/mg. Bảng 3: Purification of Human Fibroblast Interferon (75) 3.2.2.3.Tinh kháng thể Sắc ký lực sử dụng cho việc tinh kháng thể với kháng nguyên chất mang. Những kháng thể cố định sử dụng tinh protein enzyme. Trong điều kiện lý tưởng, cột sắc ký lực giúp phân tách kháng thể khỏi hỗn hợp thô qua bước thực hiện. Proteins Purified on Immuno Affinity Columns (38) HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học 4. Một số ứng dụng cụ thể phương pháp sắc ký 4.1.Ứng dụng sắc ký lực tinh protease 4.1.1.Nguyên lý Đầu tiên ligand liên kết đồng hóa trị với matrix không hòa tan, hạt agarose, sau matrix cho vào cột sắc k…Hỗn hợp dung dịch chứa protein cần tinh cho vào cột xảy tương tác protein với ligand cố định matrix, protein bị giữ lại matrix, chất không tương tác với matrix chảy qua cột. Sự tương có tính đặc HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học thù thuận nghịch. Protein tách khỏi matrix cách làm yếu liên kết chúng phương pháp giửa giải khác nhau. Sự tương tác sinh học ligand phân tử tinh kết liên kết tĩnh điện tương tác kỵ nước, lực van der Waals liên kết hydro. Để rửa giải sử dụng ligand cạnh tranh đặc trưng, không cạnh tranh cách thay đổi pH, nồng độ ion phân cực để phá vỡ liên kết.  Qui trình thực Hình 1: Các bước sắc ký lực Bước 1: Chọn môi trường lực Chọn môi trường có sẵn (ligand liên kết sẵn với matrix). Nếu phải chọn ligand thích hợp để tạo môi trường lực đặc hiệu. Ổn định môi truờng lực dung dịch đệm liên kết (binding buffer). Bước 2: Chuẩn bị môi trường dung dịch đệm HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học Việc tái sử dụng môi trường lực cần phải phụ thuộc vào chất mẫu. Lưu tránh chất béo. Bước 3: Chuẩn bị mẫu chạy mẫu Chuẩn bị mẫu: Mẫu cần làm trước chạy sắc k Nếu nên kiểm tra lực ligand với protease cần tách. Sau đó, hiệu chỉnh pH mẫu loại bỏ thành phần gây gián đoạn liên kết. Chạy mẫu: Chạy mẫu dưói điều kiện tối ưu cho tr.nh liên kết phân tử cần tách với ligand. Cần phải kiểm soát tốc độ d.ng chảy, thể tích mẫu không ảnh hưởng đến hiệu liên kết. Bước 4: Rửa giải Thu hồi protease mục tiêu cách thay đổi điều kiện thích hợp cho trình rửa giải. Có nhiều phương pháp rửa giải, phương pháp chung định. Có thể tiến hành tr.nh rửa giải đặc hiệu cách sử dụng ligand cạnh tranh tr.nh rửa giải không đặc hiệu cách thay đổi pH, lực ion độ phân cực. Kết thu protease dạng tinh cô đặc.  Phương pháp 1: Thay đổi dung dịch đệm  Phương pháp 2: Thay đổi pH nồng độ tác nhân cần cho trình rửa giải. Phương pháp gây hại cho ligand.  Phương pháp 3: Thêm chất cạnh tranh liên kết. Phương pháp cải thiện tính đặc hiệu môi trường mà sử dụng nhóm ligand đặc hiệu. Các phương pháp rửa giải có tính chọn lọc ứng dụng kết hợp với - nhóm ligand đặc hiệu. Rửa giải pH Sự thay đổi pH có ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cac nhóm ligand protease liên kết. Sự thay đổi tác động trực tiếp đến vị trí liên kết, tác động gián tiếp đến thay đổi lực thay đổi cấu h.nh. Giảm pH phương pháp thường sử dụng để rửa giải. Tuy nhiên việc thu phân đoạn phải tiến hành điều kiện pH trung tính (ví dụ Tris-HCl 1M, pH 9). - Rửa giải lực ion HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học Thường sử dụng NaCl (dung dịch đệm) để làm tăng lực ion. Các enzym thường rửa giải với nồng độ thấp 1M NaCl. - Rửa giải cạnh tranh Thường sử dụng để tách chất liên kết môi trường đặc hiệu nhóm lực liên kết protein mục tiêu với ligand tương đối cao. Chất rửa giải cạnh tranh liên kết với protein mục tiêu ligand. Có thể sử dụng chất với nồng độ tăng theo gradient dạng xung. Thường sử dụng nồng độ xấp xỉ với nồng độ ligand. Nếu chất liên kết yếu phải sử dụng với nồng độ cao hơn. - Rửa giải với chất rửa giải có độ phân cực thấp: Thường sử dụng dioxane (≤10%) ethylen glycol (≤50%). - Rửa giải chaotroptic: Chỉ sử dụng không dùng phương pháp khác. Phương pháp làm thay đổi cấu trúc protein rửa giải. Các tác nhân thường dùng guanidin hydrocloride, ure. Bước 5: Ổn định lại môi trường lực binding buffer 4.1.2. Các matrix thường dùng Matrix lực thường chuẩn bị liên kết đồng hóa trị ligand với chất rắn hỗ trợ. Agarose hay Sepharose, Sephadex tinh bột chất rắn hỗ trợ tốt v. chúng dễ tạo dẫn xuất với ligand khác nhau. Tuy nhiên gel agarose sử dụng nhiều v. có độ bền cao cho phép đại phân tử xâm nhập dễ dàng. Để chuẩn bị cột lực, matrix phải hoạt hóa để gắn ligand liên kết đồng hóa trị. Trong số trường hợp, spacer arm dùng tr.nh hoạt hóa, sau ligand liên kết đồng hóa trị. Liên kết thực nhiều phương pháp. Bảng 4.10 đưa tác nhân thường dùng để hoạt hóa matrix cố định ligand. Tuy nhiên, matrix hoạt hóa HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học đ. thương mại hóa sử dụng tiện lợi phù hợp với ligand chọn. Sản phẩm thương mại thường gặp là: • • • Sepharose 4B, 6B: agarose liên kết ngang 4%, 6% tương ứng. AH Sepharose: Sepharose có nhóm amine tự do. CH Sepharose: Sepharose có nhóm carboxyl tự do. CNBr-activated Sepharose: Sephaose hoạt hoá CNBr… Bảng 2: Một số tác nhân hoạt hóa matrix cố định ligand phổ biến 4.2.3. Ligand sử dụng để tinh protease sắc ký lực Với protease khác có ligand tương ứng. Trong sắc k. lực để tinh sạch, phân tách protease từ nguồn khác nhau, ligand thường sử dụng polypeptide antibiotics gramicidin S bacitracin. Ngoài người ta nghiên cứu tổng hợp ligand lực đặc hiệu từ dẫn xuất polypeptide. Các peptide có cấu trúc giống cấu trúc chất enzym, đồng thời chứa liên kết kháng lại thuỷ phân protein. Bảng 3: Một số ligand thường sử dụng sắc k. lực HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học Một số chất tổng hợp tương ứng với protease khác nhau: • • • • • • • • • Subtilisin thermitase: Z-Ala-AIa-Leu-pNA (p-nitroanilide). Subtilisin-like serine protease: Ala-Ala-Leu-pNA Enzyme từ rễ bồ công anh kininase X: Glp-Ala-Ala-Leu-pNA. α-Chymotrypsin: Suc-Phe-pNA. Kallikrein: Z-D-Ala-Leu-Arg-pNA. Leu-aminopeptidase: Leu-pNA. Trypsin b. cua: Bz-D,L-Arg-pNA. Protease PC papain: Glp-Phe-Ala-pNA. Carboxypeptidase PC: DNP-Ala-Ala-Leu. Tổng hợp số ligand: * Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O HOBt (1-hydroxybenzotriasol) (0.69 g, 5.16 mmol) hoà tan 5ml hỗn hợp THF (tetrahydrofuran)-DMF (1:10) (1) Boc-Leu-OH (1 g, 4.3 mmol) hoà tan 5ml THF (2) Hoà trộn (1) với (2). Hỗn hợp thu đem làm lạnh đến oC. Sau thêm DCC hoà tan 3ml THF vào. Cuối thêm mopholine (473 μL, 5.4 mmol) vào khuấy 15 phút 20oC. Dicyclohexylurea kết tủa lọc ra, tách lấy dung môi. Phần cặn dầu c.n lại hoà tan 120ml ethylacetate. Dung dịch sau rửa nước, b.o hoà NaHCO3 nước, làm khô với MgSO4. Cuối bốc dung môi, thu 0.91g Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O, hiệu suất 81%. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học * H-Leu-N(CH2CH2)2O *HCl Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O (0.91 g, mmol) hoà tan 15ml HCl 3.4M dioxane. Hỗn hợp khuấy 20oC. Sau đó, dung môi HCl bốc áp suất thấp. HCl tách cách rửa lại bốc với methanol. Phần c.n lại đem sấy khô chân không, thu 0.642g H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl, hiệu suất 90%. * Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O 0.425g (3.15mmol) HBOt hoà tan trước 5ml hỗn hợp THF-DMF (5:1), thêm vào (ở 0oC) 0.926g (3.15 mmol) Z-Ala-Ala-OH 20ml THF khô. Tiếp tục cho vào hỗn hợp 0.779 g (3.78 mmol) DCC (đ. hoà tan 20ml THF), 0.749 g (3.15 mmol) H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl với 484 μL (3.46 mmol) triethylamine. Khuấy hỗn hợp 20oC 15 giờ, sau lọc dicyclohexylurea ra. Dịch lọc bốc áp suất thấp, hoà tan phần cặn dầu c.n lại 130ml ethyl acetate. Dung dịch rửa với nước, b.o hoà với NaHCO3 làm khô với MgSO4. Cuối bốc áp suất thấp, thu 0.83g Z-Ala-Ala-LeuN(CH2CH2) 2O, hiệu suất 56%. * Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O 508g Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O hoà tan 7ml methanol, sau khí với ảgon thêm 50mg ch. vào. Dẫn H2 qua dung dịch 48 20oC. Rồi thêm HCOOH để hạ pH xuống c.n 2-3. Lọc hỗn hợp bốc dung môi dưói áp suất thấp, thu 0.33g Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O, hiệu suất 95%. 4.1.4. Một số phương pháp cố định ligand matrix 4.1.4.1. Cố định ligand thông qua tác nhân hoạt hóa cyanogen bromide HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học Tác nhân phổ biến để liên kết ligand với matrix cyanogen bromide (CNBr). Nó phản ứng với nhóm hydroxyl Sepharose pH kiềm. Phản ứng: Phản ứng CNBr phức tạp. H.nh 4.9 thể chế việc hoạt hóa Agarose matrix chứa hydroxyl khác CNBr. pH cao (khoảng 11), CNBr phản ứng với nhóm hydroxyl matrix để tạo thành phần hoạt hóa chính, cyanate ester, thành phần phụ khác, imidocarbonate (cyclic acyclic), carbamate carbonate. Tuy nhiên, v.ng imidocarbonate chiếm ưu việc hoạt hóa dextran liên kết ngang cellulose. Trong điều kiện kiềm nhẹ (pH 9-10), cyanate ester v.ng imidocarbonate phản ứng dễ dàng với nhóm amine ligand, kết tạo dẫn xuất isourease imidocarbonate thay tương ứng (h.nh 2). Các nhóm amino phản ứng trung tâm phản ứng này, v. cần thiết phải tiến hành phản ứng pH – 10. Ở pH nhóm amino không nhận thêm proton. Phản ứng cặp đôi không nên tiến hành dung dịch đệm chứa amine bản, tris, glycine ethanol amine. V. tác nhân cạnh tranh với ligand cố định. Dung dịch đệm chọn thuồng sodium carbonate bicarbonate, điều kiện cặp đôi tối ưu pH 8.3. Sau ligand liên kết loại bỏ ligand thừa, nhóm hoạt hóa c.n lai matrix bị khóa lại cách thêm vào lượng dư amine nhỏ tris, glycine, ethanolamine… Ưu điểm: Việc hoạt hóa CNBr đơn giản ôn h.a cho việc liên kết phân tử sinh học nhạy cảm enzym, lectin kháng thể. Hoạt hóa CNBr ứng dụng không với agarose, dextran hay Sephadex, mà c.n ứng dụng cho polymer tổng hợp chứa nhóm hydroxyl. Một hoạt hóa ligand nhỏ ligand có khối lượng phân tử lớn chứa amine liên kết. Nhược điểm: HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học Một nhược điểm matrix lực hoạt hóa CNBr ligand đ. cố định bị rơi liên tục. Liên kết yếu nguyên nhân không ổn định liên kết isoureas matrix hoạt hóa ligand. Một nhược điểm khác matrix chúng hoạt động chất trao đổi anion yếu, làm thúc đẩy liên kết không đặc hiệu. Điều làm cho dẫn xuất isourease tích điện dương pH trung h.a. Hình 2: Cơ chế hoạt hóa agarose (hoặc polymer có nhóm hydroxyl) CNBr. Quy trình làm việc: Các tác nhân: HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học - Cyanogen bromide (Aldrich, Milwaukee, WI) - Sepharose 4B 6B (Pharmacia) Sự hoạt hóa: (Lưu: CNBr có độc tính cao, phải tiến hành hoạt hóa CNBr thiết bị kín có van thông tốt) B1. Rửa 100ml Sepharose 4B với lít nước đ. de-ion hóa phễu thủy tinh làm khô. B2. Tạo huyền phù gel 100ml sodium carbonate 2M becher. B3. H.a tan 10g CNBr 5ml acetonitrile thêm dung dịch CNBr vào huyền phù gel khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy overhead paddle. (Chú .: không dùng cánh khuấy từ để tránh làm vỡ hạt gel). B4. Để phản ứng hoạt hóa tiếp tục phút nhiệt độ ph.ng. B5. Rửa nhanh hạt gel đ. hoạt hóa với lít nước đá lạnh, sau rửa với dung dịch đệm liên kết lạnh (sodium bicarbonate 0.1M, chứa NaCl 0.5M, pH 8.5). B6. Tiến hành cố định ligand ngay. Cố định ligand: B7. Tạo huyền phù gel đ. hoạt hóa dung dịch đệm liên kết (sodium bicarbonate 0.1M, chứa NaCl 0.5M, pH 8.5) chứa protein (5-10mg/ml gel) Tiếp tục tạo phản ứng liên kết nhiệt độ ph.ng (hoặc qua đêm 4oC), khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy paddle. B8. Rửa gel đ. liên kết với dung dịch đệm liên kết, để loại bỏ ligand không liên kết. B9. Khóa nhóm hoạt động c.n lại gel cách tạo huyền phù 100 ml ethanolaminr 1M glycerine 0.2M, pH 8.0 nhiệt độ phòng. B10. Rửa gel với dung dịch đệm liên kết, sau rửa với dung dịch đệm acetate 0.1M (pH 4.0) chứa NaCl 0.5M. Và rửa lại với dung dịch đệm liên kết. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học B11.Cuối rửa gel với nước. Rửa tiếp với dung dịch đệm chọn cho trình sắc ký lực lectron, bỏ qua N-hydroxy-succinimide. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học KẾT LUẬN Sắc ký kỹ thuật ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực giới. Việt Nam tiếp cận kỹ thuật vào năm thập niên 80. Vì điều kiện sống ngày cao, nên đòi hỏi phải có công nghệ kỹ thuật đáp ứng nhu cầu. Bên cạnh có số người, lợi nhuận cá nhân mà bất chấp tất cả. Ngày nay, để kiểm soát kiểm tra tình hình chất lượng hàng hoá để đáp ứng nhu cầu sống như: thực phẩm, dược phẩm, hoá chất… Vì kỹ thuật sắc ký có vai trò lớn công tác kiểm tra, giám sát chất lượng mà kỹ thuật hoàn toàn đảm đương yêu cầu trên. Ví dụ như: kiểm tra dư lượng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) thuỷ sản, kiểm tra dư lượng hoocmon (clenbuterol, salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra dư lượng màu bị cấm có thực phẩm mỹ phẩm như: Sudan có trứng gia cầm son môi, MCPD (3_monoclo_propan_1,2_diol) có nước tương, formone có bánh phở, xác định số phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ phát triển nấm mốc gây độc (có độc tố Aflatoxin) lô hàng nông sản dự trữ xuất đặc biệt đậu tương lạc …Trong công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất dược phẩm, dư luợng chất gây độc hại… Ngoài ứng dụng nhiều lĩnh vực khác quan trắc, môi trường… Vì vậy, với mục đích sử dụng mà ta chọn phương pháp sắc ký phù hợp để phân tích mẫu tương ứng. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng nghiên cứu hóa sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Separation and Purification technique in Biotechnology, Frederick Dechow, 1989 [2] Doury-Berthod, M., Poitrenaud, C., Tremillon, B., J Chromatography, 179:37 (1979) [3] Dutcher, J.D., Hosansky, N., Donin, M.H., et al., J Am Chem Sot, 73:1384 (1951) [4] Ghim, Y.S., Chang, H.N., Ind Eng Chem Fundam, 21:369 (1982) [5] Pietrzyk, D.J., Cahill, W.J., Jr., Stodola, J.D., J Liquid Chromatography, 5(3):443 (1982) HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang [...]... Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học Một trong những ứng dụng quan trọng của kỹ thuật sắc ký cột là vào khâu tinh sạch trong công nghiệp sản xuất kháng sinh Một trong số đó như phân tách kháng sinh neomycin B ra khỏi neomycin C bằng nhôm ô-xít (72) Các loại nhựa được sử dụng trong tinh sạch kháng sinh bằng sắc ký cột như: Nhựa anion háo nước –... amin 3 Ứng dụng 3.1 Ứng dụng trong phân tích HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học 3.1.1 Ứng dụng sắc ký ái lực trong phân tích thực phẩm  Phân tích độc tố Sắc ký lớp mỏng: (Thin Layer Chromatography – TCL) Phương pháp này dựa trên sự hấp phụ khác nhau của các ochratoxin trên lớp silicagel (pha tĩnh) và khả năng hòa tan của chúng trong. .. mật Một trong những nghiên cứu gần đây nhất về ứng dụng của kỹ thuật sắc ký trong công nghiệp xử lý mật rỉ là của Neuzil và Fergin (162), họ đã áp dụng kỹ thuật sắc ký liên tục UOP để thu hồi sucrose từ mật rỉ Trong phương pháp này, họ đã sử dụng chất hấp phụ không hoạt động chức năng và dung môi rửa tách là alcohol Từ dung dịch rỉ có tỉ lệ 30% sucrose, 10% KCl và 10% betaine, khi áp dụng kỹ thuật này... đến 99% 3.3.2 Ứng dụng sắc ký ái lực Ban đầu, kỹ thuật sắc ký ái lực được phát minh nhằm mục đích tách chiết và tinh sạch protein Và đã được ứng dụng khá thành công trong lĩnh vực này (Bảng 1) Tuy nhiên, ứng dụng của kỹ thuật sắc ký này không bị giới hạn chỉ trong lĩnh vực tinh sạch protein, mà nó còn mang lại hiệu quả tốt trong quá trình tinh sạch carbohydrate và glycoprotein với sự sử dụng lectin cố... được thu nhận trong nồng độ muối thấp Nhược điểm: một số protein có thể bị tủa ở nồng độ muối cao, khó nâng cấp quy mô lớn 2.8 Sắc ký khí HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học Sắc ký khí là phương pháp được dùng để tách các chất ở thể khí bay hơi, với pha động là chất khí, gọi là khí mang (carrier gas) Sắc ký khí còn áp dụng cho các... Một ứng dụng quan trọng khác khác của kỹ thuật sắc ký cột trong công nghiệp kháng sinh là tách chiết các loại kháng sinh chống viêm saikosaponin a, c, và d ra khỏi hỗn hợp thô với phương pháp này thì từ 10 g saponin thô có thể thu được 403 mg saikosaponin c, 1210 mg saikosaponin a và 1604 mg saikosaponin d HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa. .. Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học 2.9.2 Sắc ký hấp phụ hiệu nâng cao (sắc ký lỏng - rắn LSC) Pha tĩnh là chất rắn mà trên bề mặt có chứa các nhóm hiđroxil phân cực, pha động là một dung môi không phân cực 2.9.3 .Sắc ký trao đối ion hiệu nâng cao (IEC) Pha tĩnh rắn chứa các nhựa trao đổi lớn dưới dạng bột mịn, pha động thường là dung dịch nước 2.9.4 Sắc ký lỏng hiệu... tan của mẫu chất trong dung môi Ưu điểm: -Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích -Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích -Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng Các bước thực hiện sắc ký lớp mỏng: HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học -Chuẩn... (trong) của cột Cơ chế tách Thực hiện ở cả 2 pha Chỉ có pha động là mang động và tĩnh Detecter – Đầu dò mẫu Thông dụng nhất là UV- Thông dụng là FID, dùng VIS cho phân tích các chất hữu cơ Kỹ thuật sắc ký cột đã được sử dụng ở quy mô thương mại cho việc tinh sạch các sản phẩm lên men, nguyên liệu sinh học và hóa học hữu cơ Một vài trong số những ứng dụng của kỹ thuật sắc ký cột đã và đang được áp dụng. .. fructose Kết quả nghiên cứu thu được là trình tự thu nhận sản phẩm ở cuối cột sắc ký là khác nhau khi sử dụng các loại pha tĩnh khác nhau, cụ thể là sẽ thu được fructose trước rồi sau đó tới glucose khi sử dụng nhựa trao đổi ion âm và ngược lại HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học Điều đó cũng cho thấy là thực tế trong việc phân tách . Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ TRONG NGHIÊN CỨU HÓA SINH HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong. Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học NỘI DUNG 1. Tổng quan về kỹ thuật sắc ký 1.1. Lịch sử sắc ký Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc. Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Kỹ thuật sắc ký Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học 2.3 .Sắc ký cột: Sắc ký cột được tiến hành ở