4. Một số ứng dụng cụ thể của phương pháp sắc ký 1.Ứng dụng sắc ký ái lực trong tinh sạch protease
4.2.3. Ligand sử dụng để tinh sạch protease trong sắc ký ái lực
Với mỗi protease khác nhau sẽ có một ligand tương ứng. Trong sắc k. ái lực để tinh sạch, phân tách protease từ các nguồn khác nhau, ligand thường sử dụng nhất là các polypeptide antibiotics gramicidin S hoặc các bacitracin. Ngoài ra người ta còn nghiên cứu tổng hợp các ligand ái lực đặc hiệu mới từ các dẫn xuất của polypeptide. Các peptide này có cấu trúc giống cấu trúc các cơ chất của enzym, đồng thời chứa các liên kết kháng lại sự thuỷ phân protein.
Một số cơ chất tổng hợp tương ứng với các protease khác nhau:
• Subtilisin và thermitase: Z-Ala-AIa-Leu-pNA (p-nitroanilide).
• Subtilisin-like serine protease: Ala-Ala-Leu-pNA
• Enzyme từ rễ cây bồ công anh kininase X: Glp-Ala-Ala-Leu-pNA.
• α-Chymotrypsin: Suc-Phe-pNA.
• Kallikrein: Z-D-Ala-Leu-Arg-pNA.
• Leu-aminopeptidase: Leu-pNA.
• Trypsin của b. và cua: Bz-D,L-Arg-pNA.
• Protease PC và papain: Glp-Phe-Ala-pNA.
• Carboxypeptidase PC: DNP-Ala-Ala-Leu.
Tổng hợp một số ligand:
* Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O
HOBt (1-hydroxybenzotriasol) (0.69 g, 5.16 mmol) được hoà tan trong 5ml hỗn hợp THF (tetrahydrofuran)-DMF (1:10) (1) Boc-Leu-OH (1 g, 4.3 mmol) hoà tan trong 5ml THF (2) Hoà trộn (1) với (2). Hỗn hợp thu được đem làm lạnh đến 0oC. Sau đó thêm DCC được hoà tan trong 3ml THF vào. Cuối cùng thêm mopholine (473 μL, 5.4 mmol) vào và khuấy 15 phút ở 20oC. Dicyclohexylurea kết tủa được lọc ra, tách lấy dung môi. Phần cặn dầu c.n lại được hoà tan trong 120ml ethylacetate. Dung dịch này sau đó được rửa bằng nước, b.o hoà NaHCO3 và nước, làm khô với MgSO4. Cuối cùng bốc hơi dung môi, thu được 0.91g Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O, hiệu suất 81%.
* H-Leu-N(CH2CH2)2O *HCl
Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O (0.91 g, 3 mmol) được hoà tan trong 15ml HCl 3.4M trong dioxane. Hỗn hợp được khuấy 3 giờ ở 20oC. Sau đó, dung môi và HCl được bốc hơi ở áp suất thấp. HCl được tách ra bằng cách rửa lại và bốc hơi với methanol. Phần c.n lại đem sấy khô chân không, thu được 0.642g H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl, hiệu suất 90%.
* Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O
0.425g (3.15mmol) HBOt được hoà tan trước trong 5ml hỗn hợp THF-DMF (5:1), rồi được thêm vào (ở 0oC) 0.926g (3.15 mmol) Z-Ala-Ala-OH trong 20ml THF khô. Tiếp tục cho vào hỗn hợp trên lần lượt được 0.779 g (3.78 mmol) DCC (đ. hoà tan trong 20ml THF), 0.749 g (3.15 mmol) H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl với 484 μL (3.46 mmol) triethylamine. Khuấy hỗn hợp trên ở 20oC trong 15 giờ, sau đó lọc dicyclohexylurea ra. Dịch lọc bốc hơi ở áp suất thấp, và hoà tan phần cặn dầu c.n lại trong 130ml ethyl acetate.
Dung dịch được rửa với nước, b.o hoà với NaHCO3 và được làm khô với MgSO4. Cuối cùng bốc hơi ở áp suất thấp, thu được 0.83g Z-Ala-Ala-Leu- N(CH2CH2) 2O, hiệu suất 56%.
* Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O
508g Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O được hoà tan trong 7ml methanol, sau đó được bài khí với ảgon và thêm 50mg ch. vào. Dẫn H2 qua dung dịch trong 48 giờ ở 20oC. Rồi thêm HCOOH để hạ pH xuống c.n 2-3. Lọc hỗn hợp và bốc hơi dung môi dưói áp suất thấp, thu được 0.33g Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O, hiệu suất 95%.