4. Một số ứng dụng cụ thể của phương pháp sắc ký 1.Ứng dụng sắc ký ái lực trong tinh sạch protease
4.1.4.1.Cố định ligand thông qua các tác nhân hoạt hóa cyanogen bromide
Tác nhân phổ biến nhất để liên kết ligand với matrix là cyanogen bromide (CNBr). Nó phản ứng với nhóm hydroxyl của Sepharose ở pH kiềm.
Phản ứng:
Phản ứng của CNBr rất phức tạp. H.nh 4.9 thể hiện cơ chế của việc hoạt hóa Agarose cũng như các matrix chứa hydroxyl khác bằng CNBr. ở pH cao (khoảng 11), CNBr phản ứng với nhóm hydroxyl của matrix để tạo ra thành phần hoạt hóa chính, cyanate ester, và các thành phần phụ khác, imidocarbonate (cyclic hoặc acyclic), carbamate và carbonate. Tuy nhiên, các v.ng imidocarbonate chiếm ưu thế hơn trong việc hoạt hóa các dextran liên kết ngang và cellulose. Trong điều kiện kiềm nhẹ (pH 9-10), cyanate ester và v.ng imidocarbonate phản ứng dễ dàng với các nhóm amine cơ bản của ligand, kết quả tạo ra các dẫn xuất isourease và imidocarbonate thay thế tương ứng (h.nh 2). Các nhóm amino phản ứng như trung tâm của phản ứng này, v. vậy cần thiết phải tiến hành phản ứng ở pH 8 – 10. Ở pH này các nhóm amino vẫn không nhận thêm proton. Phản ứng cặp đôi này không nên tiến hành trong một dung dịch đệm chứa các amine cơ bản, như tris, glycine hoặc ethanol amine. V. những tác nhân này sẽ cạnh tranh với các ligand cố định. Dung dịch đệm được chọn thuồng là sodium carbonate hoặc bicarbonate, và điều kiện cặp đôi tối ưu là ở pH 8.3. Sau khi ligand được liên kết và loại bỏ các ligand thừa, các nhóm hoạt hóa c.n lai trong matrix có thể bị khóa lại bằng cách thêm vào một lượng dư các amine cơ bản nhỏ như tris, glycine, ethanolamine…
Ưu điểm:
Việc hoạt hóa bằng CNBr thì đơn giản và ôn h.a cho việc liên kết các phân tử sinh học nhạy cảm như enzym, lectin và kháng thể. Hoạt hóa CNBr có thể được ứng dụng không chỉ với agarose, dextran hay Sephadex, mà c.n có thể ứng dụng cho các polymer tổng hợp chứa nhóm hydroxyl. Một khi được hoạt hóa các ligand nhỏ cũng như các ligand có khối lượng phân tử lớn chứa các amine cơ bản có thể được liên kết.
Một nhược điểm chính của các matrix ái lực hoạt hóa bằng CNBr là các ligand đ. cố định bị rơi ra liên tục. Liên kết yếu là nguyên nhân chính của sự không ổn định của liên kết isoureas giữa matrix hoạt hóa và ligand. Một nhược điểm khác của matrix này là chúng có thể hoạt động như một chất trao đổi anion yếu, làm thúc đẩy các liên kết không đặc hiệu. Điều này làm cho dẫn xuất isourease tích điện dương ở pH trung h.a.
Hình 2: Cơ chế hoạt hóa agarose (hoặc các polymer có nhóm hydroxyl) bằng CNBr.
Quy trình làm việc: Các tác nhân:
- Cyanogen bromide (Aldrich, Milwaukee, WI) - Sepharose 4B hoặc 6B (Pharmacia)
Sự hoạt hóa:
(Lưu: CNBr có độc tính rất cao, phải tiến hành hoạt hóa CNBr trong thiết bị kín có van thông hơi tốt)
B1. Rửa 100ml Sepharose 4B với 1 lít nước đ. được de-ion hóa trong phễu
thủy tinh và làm khô.
B2. Tạo huyền phù gel trong 100ml sodium carbonate 2M trong becher. B3. H.a tan 10g CNBr trong 5ml acetonitrile và thêm dung dịch CNBr vào
huyền phù gel và khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy overhead paddle. (Chú .: không dùng cánh khuấy từ để tránh làm vỡ hạt gel).
B4. Để phản ứng hoạt hóa tiếp tục trong đúng 2 phút ở nhiệt độ ph.ng. B5. Rửa nhanh các hạt gel đ. được hoạt hóa với 1 lít nước đá lạnh, sau đó
rửa với dung dịch đệm liên kết lạnh (sodium bicarbonate 0.1M, chứa NaCl 0.5M, pH 8.5).
B6. Tiến hành cố định ligand ngay.
Cố định ligand:
B7. Tạo huyền phù gel đ. được hoạt hóa trong dung dịch đệm liên kết (sodium
bicarbonate 0.1M, chứa NaCl 0.5M, pH 8.5) chứa protein (5-10mg/ml gel) Tiếp tục tạo phản ứng liên kết trong 2 giờ ở nhiệt độ ph.ng (hoặc qua đêm ở 4oC), khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy paddle.
B8. Rửa gel đ. liên kết với dung dịch đệm liên kết, để loại bỏ các ligand không liên
kết.
B9. Khóa các nhóm hoạt động c.n lại trong gel bằng cách tạo huyền phù trong 100
ml ethanolaminr 1M hoặc glycerine 0.2M, pH 8.0 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.
B10. Rửa gel với dung dịch đệm liên kết, sau đó rửa với dung dịch đệm acetate
B11.Cuối cùng rửa gel với nước. Rửa tiếp với dung dịch đệm được chọn cho quá
KẾT LUẬN
Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế giới. Việt Nam tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Vì điều kiện cuộc sống ngày càng cao, nên đòi hỏi phải có những công nghệ kỹ thuật hiện đại để đáp ứng nhu cầu. Bên cạnh đó cũng có một số ít người, vì lợi nhuận cá nhân mà bất chấp tất cả. Ngày nay, để kiểm soát kiểm tra tình hình chất lượng hàng hoá để đáp ứng nhu cầu cuộc sống như: thực phẩm, dược phẩm, hoá chất… Vì thế kỹ thuật sắc ký càng có vai trò lớn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng mà kỹ thuật này hoàn toàn đảm đương được nhưng yêu cầu trên. Ví dụ như: kiểm tra dư lượng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) trong thuỷ sản, kiểm tra dư lượng hoocmon (clenbuterol, salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra dư lượng màu đã bị cấm có trong thực phẩm và mỹ phẩm như: Sudan có trong trứng gia cầm và trong son môi, 3 MCPD (3_monoclo_propan_1,2_diol) có trong nước tương, formone có trong bánh phở, xác định một số phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ sự phát triển của các nấm mốc gây độc (có độc tố Aflatoxin) trong các lô hàng nông sản dự trữ và xuất khẩu đặc biệt đậu tương và lạc …Trong công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất chính trong dược phẩm, dư luợng chất có thể gây độc hại… Ngoài ra còn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như quan trắc, môi trường… Vì vậy, với từng mục đích sử dụng mà ta có thể chọn một phương pháp sắc ký phù hợp để phân tích mẫu tương ứng.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});