xác định virus hại cây họ bầu bí tại tỉnh hòa bình, thử nghiệm phòng chống bệnh bằng một số thuốc hóa học

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng một số cây trồng họ bầu bí tại tỉnh Hòa 1.2 Kết quả thí

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Trang 2

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

Trang 3

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hướng dẫn tận tình, với tinh thần trách nhiệm cao của Tiến sĩ Hà Viết Cường, Phó trưởng khoa Nông Học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Trân trọng cảm ơn các Giảng viên bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam; các cán bộ, học viên Trung tâm bệnh cây nhiệt đới đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Trân trọng cảm ơn Lãnh đạo và cán bộ Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Hòa Bình đã tạo điều kiện giúp đỡ về thời gian, điều kiện thí nghiệm

Trân trọng cảm ơn cán bộ, nhân viên Trạm Bảo vệ thực vật các huyện, thành phố của tỉnh Hòa Bình đã hỗ trợ điều tra đồng ruộng, phối hợp đánh giá thực trạng trong quá trình thực hiện đề tài

Tác giả luận văn

Vũ Thị Anh Đào

Trang 4

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

1.3.3 ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) 14

1.3.4 SLCCNV (Squash leaf curl china virus) 15

Trang 5

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

1.6.2 Đặc điểm và cơ chế tác động của ribavirin tới virus thực vật 22

1.7 Nhóm chất kích kháng chống virus dựa trên cơ chế SAR (systemic

acquired resistance – tính kháng tập nhiễm hệ thống) 22

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2 Địa điểm, thời gian và vật liệu nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp điều tra ngoài đồng 26

2.3.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR 28 2.3.4 Phương pháp lây nhiễm PRSV bằng tiếp xúc cơ học 30

Trang 6

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

2.3.5 Thử nghiệm phòng trừ bệnh PRSV trên cây bầu bí bằng

một số chế phẩm hóa học (thí nghiệm được thực hiện trong nhà

2.3.6 Phương pháp tính và xử lý số liệu 32

3.1 Điều tra, xác định thành phần virus trên bầu bí tại tỉnh Hòa Bình 33

3.1.1 Bệnh virus trên cây họ bầu bí tại Hòa Bình năm 2014 33 3.1.2 PCR phát hiện begomovirrus trên cây bầu bí tại Hòa Bình 51

3.2.1 Kết quả lây nhiễm PRSV từ đu đủ sang đu đủ, bí ngô, bí

3.3.1 Đánh giá hiệu lực ức chế virus PRSV của thuốc kích kháng

3.3.2 Đánh giá hiệu lực ức chế của thuốc RIBAVIRIN trừ virus

Trang 7

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

DANH MỤC BẢNG

1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng một số cây trồng họ bầu bí tại tỉnh Hòa

1.2 Kết quả thí nghiệm ELISA xác định virus hại cây họ bầu bí 11

3.1 Kết quả điều tra bệnh virus gây hại trên bí xanh tại Hòa Bình năm 2014 37 3.2 Kết quả kiểm tra virus bằng ELISA trên cây bí xanh tại Hòa Bình 38 3.3 Kết quả điều tra bệnh virus gây hại trên bí ngô tại Hòa Bình năm 2014 43 3.4 Kết quả kiểm tra virus bằng ELISA trên cây bí ngô 44 3.5 Kết quả điều tra bệnh virus gây hại trên dưa chuột tại Hòa Bình năm 2014 47 3.6 Kết quả kiểm tra virus bằng ELISA cây dưa chuột 48 3.7 Kết quả điều tra bệnh virus trên dưa bở tại Hòa Bình vụ xuân 2015 49 3.8 Kết quả kiểm tra virus bằng ELISA trên cây dưa bở 50 3.9 Phát hiện begomovirus bằng PCR trên cây bầu bí tại Hòa Bình 51 3.10 Kết quả lây nhiễm nhân tạo PRSV từ đu đủ sang bí ngô, bí xanh, dưa bở

3.13 Một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây bí xanh sau thử nghiệm phòng chống

bằng kích kháng Bion, Dufulin sau 28 ngày lây nhiễm 65 3.14 Kết quả thử nghiệm phòng chống bệnh virus trên bí xanh bằng thuốc trừ

3.15 Một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây bí xanh sau thử nghiệm phòng chống

bằng thuốc Ribavirin sau 28 ngày lây nhiễm 68 3.16 Kết quả phòng trừ bệnh virus bằng thuốc Ribavirin 70

Trang 8

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

DANH MỤC HÌNH

1.1 Triệu chứng bệnh (CMV) trên lá và quả Zitter and Murphy (2009) 12 1.2 Triệu chứng bệnh (PRSV) trên bí ngô (ảnh trái) và bí xanh (ảnh phải) 14 1.3 Triệu chứng bệnh (ZYMV) trên lá và trên quả dưa chuột 15 3.1 Triệu chứng khảm trên cây bí xanh tại Hòa Bình năm 2014 34 3.2 Triệu chứng khảm biến dạng trên cây bí xanh tại Hòa Bình năm 2014 35 3.3 Triệu chứng khảm nhăn trên cây bí xanh tại Hòa Bình năm 2014 35 3.4 Triệu chứng khảm vàng trên cây bí xanh tại Hòa Bình năm 2014 36

3.6 Kết quả kiểm tra ELISA virus PRSV trên các mẫu bầu bí 39 3.7 Triệu chứng khảm, khảm cuốn lá trên bí ngô tại Hòa Bình năm 2014 40 3.8 Triệu chứng khảm nhăn (ảnh trái) và khảm vàng (ảnh phải) trên bí ngô

3.9 Triệu chứng bệnh virus trên Dưa chuột tại Hòa Bình năm 2014 46 3.10 Triệu chứng bệnh virus trên cây dưa bở tại Hòa Bình vụ xuân năm 2015 49

3.20 Thí nghiệm đánh giá tính kháng của Bion ở nồng độ 0,1g/lít 64 3.21 Thí nghiệm đánh giá khả năng phòng chống PRSV trên bí xanh của

Trang 9

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

3.22 Kết quả thí nghiệm phòng chống bằng thuốc Ribavirrin ở nồng độ 0,25

g/lít, 0,5g/lít, 0,75g/lít, đối chứng (-), đối chứng (+) 66

Trang 10

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix

DANH MỤC VIẾT TẮT

BVTV : Bảo vệ thực vật

CGMMV : Cucumber green mild motle virus

CMV : Cucuber mosaic virus

CNSH : Công nghệ sinh học

ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

PCR : Polymerase Chain Reaction

PRSV : Papaya ringspot virus

PRSV-p : Papaya ringspot virus type p

PRSV-w : Papaya ringspot virus type w

PTNT : Phát triển nông thôn

RT-PCR : Reverse transcription – PCR

SLCCNV : Squash leaf curl china virus

SLCV : Squash leaf curl virus

SqMV : Squash mosaic virus

TRSV : Tobacco ringspot virus

WMV : Watermelon mosaic virus

WMV-1 : Water melon mosaic virus – 1

WMV-2 : Water melon mosaic virus – 2

ZYMV : Zucchini yellow mosaic virus

Trang 11

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

E, PP v.v… có tác dụng quan trọng trong quá trình phát triển cơ thể, thiếu vitamin sẽ gây ra nhiều bệnh tật Chất khoáng trong rau chủ yếu là Ca, P, Fe v.v…là những chất cần thiết cho máu và xương Các chất khoáng có tác dụng điều hoà và cân bằng kiềm toan trong máu, làm tăng khả năng đồng hoá protein Trong rau có khối lượng chất xơ lớn tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng do

có thể tích lớn, xốp do đó chất xơ có tác dụng nhuận tràng và tăng khả năng tiêu hoá, Tạ Thu Cúc (2005, 2007)

Các loại cây trong họ bầu bí thường được sử dụng để nấu canh, luộc, xào (bầu, bí, mướp, khổ qua ), muối mặn hay muối chua (dưa leo), ăn tráng miệng (dưa dấu, dưa thơm tây), làm bánh mứt (bí đao, hột dưa hấu), đóng hộp (dưa leo), phơi khô (bầu) Một số loại có khả năng cất giữ lâu như bí đỏ, bí đao có thể góp phần giải quyết tình trạng giáp vụ rau Rau trong họ bầu bí có hàm lượng nước rất cao (92-96%), chất đường bột khá cao (5-7%), Vitamin C khá (5-22 mg), protein rất thấp (1%), Tạ Thu Cúc (2005, 2007)

Trong những năm trở lại đây diện tích, sản lượng cây rau họ bầu bí trên thế giới cũng như ở Việt Nam có xu hướng tăng mạnh do nhu cầu sử dụng, cũng như xuất khẩu, có thể nói các sản phẩm của cây rau họ bầu bí được coi là một sản phẩm an toàn trong tương lai Song những nghiên cứu về nó còn rất hạn chế, đặc biệt trên các đối tượng sâu bệnh hại trên rau trong đó phải kể đến nhóm bệnh virus hại bầu bí

Trang 12

Hiện nay sâu bệnh hại trên cây họ bầu bí rất phong phú và đa dạng Một trong các dịch hại quan trọng và phổ biến trên cây họ bầu bí là các bệnh virus Theo Trung tâm nghiên cứu phát triển rau châu Á các virus gây hại trên cây

họ bầu bí ở châu Á gồm: virus khảm lá dưa chuột (Cucuber mosaic virus, CMV), virus đốm hình nhẫn đu đủ (Papaya ringspot virus, PRSV), virus khảm lá dưa hấu (Water melon mosaic virus – 2, WMV-2, virus khảm vàng bí ngồi (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV), virus cuốn lá dưa (Squash leaf curl virus, SLCV), virus khảm lá dưa (Squash leaf curl virus, SqMV), virus đốm vòng thuốc lá (Tobacco ringspot virus, TRSV) và virus khảm đốm xanh dưa chuột (Cucumber green mild motle virus, CGMMV)

Việc chẩn đoán, nhận biết bệnh virus nói chung, virus gây hại trên cây bầu

bí nói riêng của cán bộ cơ sở và người sản xuất còn rất hiện hạn chế, hơn nữa các thuốc trên thị trường hiện nay hầu hết chưa có khả năng phòng ngừa bệnh virus gây hại

Xuất phát từ yêu cầu của thực tế, với mong muốn áp dụng những kiến thức đã được học vào phục vụ sản xuất, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Xác định virus hại cây họ bầu bí tại tỉnh Hòa Bình, thử nghiệm phòng chống bệnh bằng một số loại thuốc hóa học”

2 Mục đích, yêu cầu

2.1 Mục đích

- Xác định được thành phần bệnh virus, tỷ lệ các loại bệnh virus hại cây

họ bầu bí tại tỉnh Hòa Bình năm 2014, bằng ELISA, PCR

- Xác định được hiệu quả phòng chống bệnh virus chính hại cây họ bầu bí bằng chất kích kháng và thuốc trừ virus

2.2 Yêu cầu

- Đánh giá tình hình bệnh virus hại cây họ bầu bí tại Hòa Bình

- Xác định thành phần bệnh virus bằng phương pháp PCR, ELISA

- Xác định tính gây bệnh của virus PRSV bằng lây bệnh nhân tạo

Trang 13

- Đánh giá hiệu quả phòng chống virus chính hại bầu bí bằng một số thuốc kích kháng và thuốc trừ virus

Trang 14

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây họ bầu bí Cucurbitaceae

Phần lớn các cây trong họ bầu bí có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới khô hạn Châu Phi, Châu Mỹ, nam Châu Á Họ bầu bí gồm 120 chi với khoảng 1.000 loài,

ở Việt Nam có 23 chi với 53 loài, Nguyễn Hải Yến (2011) Họ Bầu bí là một họ thực vật bao gồm các loài dưa hấu, dưa chuột, bí đao, bầu, bí ngô, mướp, mướp đắng Chúng là một trong những họ quan trọng nhất trong việc cung cấp thực phẩm trên thế giới Các cây trong họ thuộc loại cây một năm có tua cuốn, đều là cây dây leo hoặc mọc bò trên mặt đất, có hoa đơn tính (hoa đực và hoa cái riêng) Các cây rau trong họ bầu bí có hàm lượng nước rất cao (92-96%), hàm lượng chất bột đường khá cao (5-7%), hàm lượng vitamin C khá (5-22mg/100g), Nguyễn Hải Yến (2011)

1.1.1 Cây dưa hấu

Tên tiếng Anh: Watermelon

Tên khoa học: Citrullus lanatus (Thumb.) Mansf

Dưa hấu có thời gian sinh trưởng ngắn, từ khi trồng đến khi thu hoạch là 2,5 tháng, năng suất cao (20-25tấn/ha), giữ được lâu ngày ở dạng tươi và thuận tiện chuyên chở đi xa nhờ vỏ ngoài cứng Dưa hấu có giá trị dinh dưỡng khá nhờ hàm lượng đường trong trái cao (5-10%) và chứa nhiều vitamin A và C Dưa hấu ngoài việc ăn tươi, làm rượu (ở Nga) còn là nguồn nước quan trọng ở vùng sa mạc Ở Việt Nam dưa hấu còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị của nước ta trong nhiều năm qua

và trong tương lai, Tạ Thu Cúc (2005, 2007)

Hiện nay các tỉnh ĐBSCL đều có trồng dưa hấu, nhưng tập trung nhiều các tỉnh, huyện như Sóc Trăng (huyện Phú Tâm, Đại Tâm, Long Phú), Bạc Liêu (Hồng Vân), Tiền Giang (Gò Công Tây, Chợ Gạo), Long An (Tân Trụ), Kiên Giang (Hà Tiên, Hòn Đất), Trà Vinh (Cầu Ngang), Cần Thơ (Ô Môn, Vị Thanh),

Đồng Tháp (Lấp Vò) An Giang (Châu Phú), Cà Mau (Năm Căn),

Trang 15

1.1.2 Cây dưa chuột

Tên tiếng Anh: Cucumber

Tên khoa học: Cucumis sativus L

Dưa chuột có nguồn gốc từ Nam Á , nhưng bây giờ phát triển trên hầu hết các châu lục Theo Tổ chức Liên Hiệp Quốc FAO, Trung Quốc sản xuất dưa chuột năm 2005 chiếm 60% sản lượng toàn cầu, tiếp đó là Thổ Nhĩ Kỳ, Nga, Iran và Hoa Kỳ

Do có chứa lượng dinh dưỡng và năng lượng thấp nhưng có hàm lượng vitamin và chất khoáng cao nên dưa leo rất được ưa chuộng ở các nước có khẩu phần ăn giàu năng lượng Ở nước ta dưa leo đã được trồng từ lâu, riêng ở thành phố Hồ Chí Minh hàng năm có diện tích gieo trồng dưa lên đến hàng trăm hecta ở hai huyện Củ Chi và Hóc Môn Riêng ở Đồng Bằng Sông Cửu Long dưa leo được trồng rất phổ biến, đặc biệt là vùng rau Sóc Trăng (huyện Mỹ Xuyên tập trong mùa mưa), An Giang (huyện Chợ Mới trồng quanh năm)

Dưa leo cung cấp nhiều vitamin và khoáng chất cho bữa ăn của con người nhưng nó chứa lượng dinh dưỡng và năng lượng rất thấp Theo Gillivray 1953 trong trái dưa leo chứa 96% nước và trong 100g dưa leo tươi chứa 14 calories; 0.7 mg protein; 24 mg calcium; vitamin 20IU; acid ascorbic 12 mg; thiamin 0.024 mg; riboflavin 0.075 mg và niacin 0.3 mg, Tạ Thu Cúc (2007)

1.1.3 Cây bầu

Tên tiếng Anh: Bottle gourd

Tên khoa học: Lagernaria siceraria (Molina) Standl Quả non là bộ phận

sử dụng để luộc, nấu canh hay xào khi ăn hoặc thái nhỏ, phơi khô để ăn dần Quả non chứa 90,7% nước, 0,7% đạm, 0,2% chất béo, 6,3% chất bột đường, 1,5% chất

xơ và 0,6% chất khoáng Tỉ lệ chất dinh dưỡng ở bầu kém hơn các cây khác trong

họ nhưng thịt quả non ngọt, có tác dụng giải nhiệt, trừ độc, có thể chữa bịnh đái tháo và mụn lở Hoa và hạt bầu cũng được sử dụng làm thuốc trong đông y Vỏ quả già rất cứng dùng làm chai, lọ hay chế tạo đồ gia dụng Ngoài ra bầu dễ trồng,

Trang 16

sản lượng cao, thích hợp với điều kiện đất đai và khí hậu rộng rãi nên được ưa

chuộng trong sản xuất

1.1.4 Cây bí ngô

Tên tiếng Anh: Pumpkins

Tên khoa học: Curcurbita pepo L var pepo

Quả có thịt màu vàng, trong 100g thịt bí ngô có 0,9g protein, 5 - 6g gluxit, ngoài ra còn có nhiều vitamin như B1, B2, PP, B6 đặc biệt có 400g vitamin B5

và có cả các axit béo quý như linoleic, linolenic, 28 mg beta - caroten Ngoài ra còn có nhiều nguyên tố vi lượng và các axit amin như: alanine, valin, leucin, cystin, lysin Hạt bí ngô chứa nhiều dầu béo và có tác dụng trừ giun sán rất tốt

Từ lâu người dân đã dùng hạt bí ăn sống hoặc rang chín để trừ giun sán có hiệu quả Trong 100g màng đỏ bao quanh hạt có tới 250 mg beta - caroten và ngay cả trong 100g lá tươi của bí ngô cũng chứa 1 mg beta - caroten

1.1.5 Cây bí xanh (bí đao)

Tên khoa học: Benincasa hispida (Thunb.) Cogn; Benicasa cerifera Savi

Bản địa của bí đao là vùng Đông Nam Á nhưng nay phổ biến trồng khắp

từ Nam Á sang Đông Á Cây bí đao là cây ưa ấm mới phát triển tốt nhưng trái của nó thì chịu được nhiệt độ thấp, có thể để qua mùa đông mà không hư mặc dù dây bí đao chỉ mọc năm một, đến đông thì tàn Lá bí đao xòe, hình bầu có lông giáp, bề ngang 10–20 cm Hoa bí đao có màu vàng, mọc đơn

Khi còn non, quả bí đao màu xanh lục có lông tơ Với thời gian quả ngả màu nhạt dần, lốm đốm "sao" trắng và thêm lớp phấn như sáp Quả bí đao già có thể dài đến 2 m, hình trụ, trong có nhiều hạt dáng dẹp Bí đao thường trồng bằng giàn nhưng cũng có thể để bò trên mặt đất như dưa

Quả được sử dụng làm thực phẩm nấu ăn rất ngon, mát Ngoài ra bí xanh còn là nguyên liệu tốt cho công nghiệp bánh kẹo (làm mứt, nhân bánh ăn rất ngon)

Do có lớp vỏ dày cứng nên bí xanh có thể bảo quản lâu, vận chuyển tốt, là loại rau

dự trữ giáp vụ và rất tiện dùng cho những vùng thiếu rau Hạt bí đao dùng trong y học dân gian làm thuốc lợi tiểu Bí xanh là loại rau cho hiệu quả kinh tế cao

Trang 17

1.1.6 Cây dưa bở

Tên khoa học: Cucumis melo

Dưa bở hay còn gọi là dưa nứt, dưa hồng, là loài cây có thân mọc bò, ra quả Dưa bở cũng là loại cây cung cấp nhiều chất dinh dưỡng cho cơ thể, có nhiều tác dụng trong việc giải khát, trị hiệu quả một số chứng bệnh theo quan điểm của Y học dân gian Dưa bở được trồng tương đối phổ biến ở Việt Nam và được dùng làm nguyên liệu cho một số bài thuốc hoặc thức uống giải khát

Dưa bở là cây có thân mọc bò, phủ lông ngắn, tua cuốn đơn Lá dưa lớn, hình tim ở gốc, gần hình tròn hoặc hình thận, có 3 góc hay 3-7 thuỳ thường nhỏ, tròn, tù, có răng, hai mặt lá có lông mềm, trên mặt dưới cũng có lông, cuống lá

có lông ngắn cứng Hoa của dưa có màu vàng, hoa đực xếp thành bó, hoa cái mọc riêng lẻ Quả đa dạng, hình dáng và màu sắc khác nhau tuỳ theo từng thứ, phần nhiều có vỏ vàng sọc xanh, nhẵn bóng hoặc có lông tơ mềm, thịt dưa màu vàng ngà, gồm chất bột mịn, bở, mềm, mùi thơm, ruột quả có nước dịch màu vàng, vị ngọt mát, màng hạt màu trắng

Dưa bở là một trong những loại quả vừa cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể, vừa có tác dụng giải khát, thanh nhiệt và trị được nhiều bệnh Có thể nói không chỉ là loại quả giải khát trong mùa nóng, mà tất cả các bộ phận của cây dưa bở như dây, lá, cuống, hạt… đều có thể dùng làm thuốc Đặc biệt là bộ phận cuống dưa, thường dùng để gây nôn, giải độc thức ăn

1.2 Sản xuất cây bầu bí tại Hòa Bình

Trước năm 1992, chưa có sự ghi nhận nào về sản xuất cây bầu bí một cách tập trung ở tỉnh Hòa Bình Kết quả điều tra cho thấy, những hộ gia đình trồng cây bầu bí đầu tiên của tỉnh vào năm 1992-1993 tại huyện Lạc Thủy Nhưng đó lại là những hộ làm thuê trên chính mảnh ruộng của mình, những người từ tỉnh Hải Dương lên Hòa Bình thuê ruộng để trồng dưa và thuê luôn chủ ruộng làm nhân công Những ruộng dưa đầu tiên đã được hình thành như vậy Sau một vài năm, nhờ kinh nghiệm tích lũy được, người dân Lạc Thủy đã tự mua hạt giống và tổ

Trang 18

chức sản xuất Diện tích trồng cây bầu bí từ 1 vài xã ban đầu đã nhanh chóng lan rộng toàn huyện và sang các huyện khác, Nguyễn Hồng Yến (2009)

Cây họ bầu bí trồng tập trung, phổ biến tại tỉnh Hoà Bình từ năm 1994, với diện tích canh tác trong vụ đông xuân từ 1.000-2.000 ha, là một trong những tỉnh có diện tích cây bầu bí lớn của miền Bắc Trong những năm qua, nhờ cây bầu bí, cuộc sống của nhiều hộ nông dân đã được cải thiện đáng kể, nhiều xã đã xác định đây là cây hàng hoá mũi nhọn trong cơ cấu cây trồng hàng năm, Nguyễn Hồng Yến (2009) Đã có 55 ha được cấp chứng nhận vùng đủ điều kiện

An toàn thực phẩm, Sở Nông nghiệp-PTNT (2012-2014)

Từ năm 2009 trở về trước toàn bộ diện tích cây họ bầu bí của tỉnh hàng năm chỉ được trồng duy nhất 01 vụ/năm là vụ đông xuân (từ tháng 1 đến tháng 5 hàng năm) Điều này khác với hầu hết các tỉnh thành trồng dưa khác của nước ta Qua điều tra cho thấy cũng có nhiều hộ gia đình muốn phát triển cây bầu bí trong các mùa vụ khác như vụ hè thu (tháng 5- tháng 8) hay vụ thu đông (tháng 8-11) nhưng lo lắng nhất của họ là thị trường tiêu thụ, vì nếu chỉ trồng nhỏ lẻ sẽ gặp khó khăn trong canh tác, bảo vệ và tiêu thụ sản phẩm, Nguyễn Hồng Yến (2009)

Từ năm 2010 trở lại đây do có kỹ thuật cũng như thị trường tiêu thụ nên cây họ bầu bí được trồng nhiều vụ trong năm (Bảng 1.1)

Phần lớn diện tích trồng cây bầu bí năm sau tăng hay giảm phụ thuộc rất lớn vào giá thành, hiệu quả sản xuất vụ trước, năm trước của nông dân

Trong những năm qua nhờ canh tác các cây trong họ bầu bí (Dưa hấu, dưa chuột, bí xanh), cuộc sống của nhiều hộ dân được cải thiện đáng kể, nhiều địa phương đã xác định đây là cây mũi nhọn trong cơ cấu cây trồng hàng năm, hướng tới phát triển theo hướng hàng hóa Cũng vì lẽ đó đã bộc lộ những thuận lợi và khó khăn đối với sản xuất cây bầu bí ở tỉnh Hòa Bình, Nguyễn Hồng Yến (2009)

1.2.1 Thuận lợi

- Giao thông tương đối tiện lợi (đường Hồ Chí Minh, đường Quốc lộ 6, đường 12B), gần các thị trường tiêu thụ lớn (như Hà Nội, Ninh Bình, Hà Nam,

Trang 19

Nam Định, vv)

- Nông dân có ý thức đầu tư thâm canh

- Các dịch vụ đầu vào (giống, phân bón, thuốc bảo vệ thực vật) ngày càng

đa dạng, thuận lợi, trên địa bàn 11 huyện, thành phố có gần 200 cửa hàng kinh doanh vật tư nông nghiệp

- Quỹ đất cho sản xuất cây màu nói chung, cây bầu bí nói riêng trong vụ xuân tương đối lớn (diện tích đất cho cây trồng cạn vụ xuân trên 63 ngàn ha, trong đó có khoảng 12 ngàn ha thích hợp để trồng cây họ bầu bí), Nguyễn Hồng Yến (2009)

1.2.2 Khó khăn

- Những kiến thức về canh tác và phòng trừ sâu bệnh của nông dân hầu như do họ tự tìm hiểu, học hỏi từ nông dân khác Sự hỗ trợ về chuyên môn kỹ thuật của các cơ quan nhà nước còn rất hạn chế

- Chưa có đánh giá cụ thể nào ở cấp tỉnh về canh tác cây họ bầu bí, thiếu

sự quy hoạch, diện tích gieo trồng hàng năm biến động lớn phụ thuộc vào kết quả gieo trồng của năm trước Hiện tượng “được mùa, mất giá” thường xuyên xảy ra với những năm có diện tích gieo trồng lớn

- Nhiều biện pháp canh tác có hiệu quả tốt chưa được nông dân biết đến

và áp dụng rộng rãi (như việc xử lý hạt giống, xử lý đất, sử dụng màng phủ nông nghiệp, bấm ngọn, tỉa dây vv)

- Do nhiều sâu bệnh, chưa biết xây dựng công thức luân canh hợp lý nên thường nông dân chỉ canh tác 1 vụ dưa, vụ sau phải đổi đi thuê đất khác làm tăng đáng kể chi phí sản xuất

- Nguồn tài liệu đề cập đến kỹ thuật canh tác và phòng trừ dịch bệnh (đặc biệt bệnh virus gây hại) trên cây bầu bí rất hạn chế so với các cây trồng khác, gây nhiều khó khăn cho công tác chỉ đạo sản xuất, Nguyễn Hồng Yến (2009)

Trang 20

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng một số cây trồng họ bầu bí tại tỉnh Hòa Bình năm 2010-2014

TT Cây trồng

Năm 2010 Năm 2011 Năm 2012 Năm 2013 Năm 2014 Diện

tích (ha)

Sản lượng (Tấn)

Diện tích (ha)

1 Dưa hấu (Citrullus lanatus) 1.231 21.885 695 12.721 338 5.992 557 9.385 257 4.580

Trang 21

1.3 Một số bệnh virus trên cây họ bầu bí

Ở Việt Nam, cây bầu bí bị rất nhiều loại virus tấn công với nhiều triệu chứng khác nhau do vậy khó có thể phân biệt được virus gây bệnh nếu chỉ dựa vào triệu chứng Theo kết quả nghiên cứu của Vũ Triệu Mân (1995) có nhiều loài virus cùng gây hại trên bầu bí, trong đó điển hình là những loài sau (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Kết quả thí nghiệm ELISA xác định virus hại cây họ bầu bí

Bí ngô (bí đỏ) 1,516 0,803 1,654 0,774 0,705

Bí đao (bí xanh) 0,004 0,507 0,953 0,702 0,522

Virus là một trong nhiều nguyên nhân gây bệnh phổ biến nhất ảnh hưởng đến cây họ bầu bí ở New York Các bệnh này gây thiệt hại thông qua giảm sinh trưởng , năng suất và gây hiện tượng biến dạng , vết lốm đốm trái cây, làm cho sản phẩm khó tiêu thụ Một phức hệ của virus có thể lây nhiễm sang cây họ bầu bí (một nhóm thực vật bao gồm dưa chuột, dưa, bí, bí ngô và dưa hấu) Các virus quan trọng nhất là khảm dưa chuột (CMV), bí khảm (SqMV), Khảm dưa hấu 1 (WMV-1), khảm dưa hấu 2 (WMV-2), và khảm vàng (ZYMV) Ngoại trừ SqMV, được truyền qua hạt giống trong dưa và lây truyền qua bọ cánh cứng, phần lớn các virus khác được truyền đi bởi một số loài rệp một cách không bền vững

1.3.1 CMV (Cucumber mosaic virus)

Cucumber mosaic virus là một virus phân bố rộng rãi trên thế giới gây hại

hầu hết những cây trồng họ bầu bí nhưng hiếm khi gây hại trên dưa hấu làm giảm

Trang 22

năng suất và chất lượng nông sản Bệnh còn gây hại trên nhiều họ khác như họ Cà,

họ Đậu, cây dược liệu, cây ăn quả và nhiều loại hoa và cây cảnh

Virus thuộc nhóm Cucumovirus, là loại virus hình cầu, đường kính 28nm,

có cấu trúc phân tử là ARN, trọng lượng phân tử là 5.0 – 6.7x106 Virus không bền vững trong dịch cây bệnh sau một vài ngày ở nhiệt độ phòng, virus chống chịu được nhiệt độ 70oC trong 10 phút Virus truyền qua tiếp xúc cơ học và dễ dàng lan truyền bởi hàng loạt các loại rệp muội theo kiểu không bền vững, có

khoảng 60 loài rệp truyền virus CMV Một số loài rệp chính là rệp bông Aphis gossypii, rệp đào Myzus persicae Soulz, rệp ngô Rhopalosiphum maydis thuộc họ Aphididae Trong số đó rệp bông là vecto quan trọng nhất Virus có thể truyền qua hạt của một số loài cỏ và tơ hồng Cuscuta sp Virus có phạm vi ký chủ rộng, gây

hại trên 800 loài thuộc 85 họ thực vật Sự biểu hiện các triệu chứng phụ thuộc vào các chủng virus và cây ký chủ (hình 1.1) CMV có rất nhiều chủng đã được xác định qua ký chủ, triệu chứng, qua mối quan hệ huyết thanh và kỹ thuật lai AND, bao gồm các chủng Y, M, S, Q: Zitter and Murphy (2009)

Hình 1.1: Triệu chứng bệnh (CMV) trên lá và quả

Zitter and Murphy (2009)

1.3.2 PRSV (Papaya ring spot virus)

Papaya ringspot virus (PRSV) thuộc nhóm potyvirus gây bệnh cho đu đủ

và các loài họ bầu bí Potyvirus gây thiệt hại lớn về kinh tế cho cây trồng Rệp

Trang 23

muội truyền PRSV bằng chích hút cây bị bệnh và sau đó lây sang cây khỏe Virus không truyền qua hạt của cây bệnh Có nhiều loài PRSV cùng họ nhưng khác nhau về chuỗi gen và tính độc

Vi rút gây bệnh đốm vòng đu đủ được chia thành hai loại, PRSV-p và PRSV-w PRVS-p lây nhiễm cả đu đủ và cây họ bầu bí trong khi PRSV-w chỉ nhiễm trên bầu bí nhưng không nhiễm trên đu đủ Trong thực tế, nguyên nhân PRSV-w thiệt hại lớn cho cây họ bầu bí (trước đây được gọi là virus khảm dưa hấu I) ảnh hưởng tới các loài cây trồng nông nghiệp quan trọng của họ bầu bí và lợi ích kinh tế bởi sức phá hoại của chúng, Gonsalves et al (2010)

Cây bị bệnh PRSV có triệu chứng đốm hình nhẫn trên quả, khảm vàng và đổi màu lá, có đường sọc trên cuống lá và thân cây, làm biến dạng lá non Cây phát triển kém và còi cọc, không đậu quả hoặc quả năng suất thấp và chất lượng kém Cây bị nhiễm bệnh ở giai đoạn cây con không cho trái, nhưng hiếm khi chết vì căn bệnh này Tuy nhiên, một số phân lập ở Đài Loan gây héo và đôi khi làm chết cây con

PRSV-w trước đây được xem là Watermelon mosaic virus (WMV-1)

nhưng Hội nghị quốc tế về phân loại virus thực vật (1995) lại coi WMV-1 là một type của PRSV tức là PRSV-w

Tuy nhiên từ những kết quả nghiên cứu mới nhất dựa trên phân tích cấu trúc

bộ gen virus vẫn cho rằng PRSV-p và PRSV-w là 2 virus riêng biệt; ngoài ra việc phân tích các gen tạo vỏ protein của các isolate PRSV từ Úc, Thái Lan, Mỹ cũng cho thấy ở mỗi nước các isolate của PRSV-p là độc lập với các isolate của PRSV-w tại nước đó, Brunt et al (1996); Dale et al (1997)

Papaya ringspot virus type w (PRSV-w) làm cho cây trồng còi cọc, phiến

lá nhỏ và không đều, lá khảm chỗ tối chỗ xanh chỗ phồng lên Quả biến dạng, nổi u và mất màu (hình 1.2)

Trang 24

Hình 1.2: Triệu chứng bệnh (PRSV) trên bí ngô (ảnh trái)

và bí xanh (ảnh phải)

(nguồn Gonsalves et al., 2010)

PRSV-w là một potyvirus, với sợi dài 760-800 x 12 nm và có lõi là RNA Phổ ký chủ của PRSV-w là họ bầu bí PRSV-p có huyết thanh giống hệt PRSV-

w nhưng có khả năng làm độc bầu bí PRSV-p có ảnh hưởng kinh tế ít hơn tới sản xuất bầu bí PRSV-w có vector truyền bệnh là các loài rệp muội, Gonsalves

et al (2010)

1.3.3 ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus)

Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) là một virus hại bầu bí quan trọng

trên thế giới gây mất mùa màng Bệnh phát hiện đầu tiên tại miền Bắc Italy và miền Nam nước Pháp những năm cuối 1970s tới 1980s Virus ZYMV lần đầu tiên được xác định ở châu Âu vào năm 1981, đã được báo cáo từ hầu hết các bang miền Nam và Tây Nam, được tìm thấy ở bang New York vào năm 1983 và tìm thấy ở Anh năm 1987, Provvidentis et al (1984); Provvidenti (1986; 1993) Dưa lê, dưa hấu, bí bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi virus ZYMV Triệu chứng trên lá bao gồm lá bị phồng lên và khảm xanh thẫm, lá biến dạng, có khía, răng cưa, chết hoại và các triệu chứng khác Cây phát triển còi cọc, lóng ngắn Quả biến dạng, nổi u, phồng và nứt (hình 1.3)

Trang 25

Hình 1.3: Triệu chứng bệnh (ZYMV) trên lá và trên quả dưa chuột

(Nguồn: Provvidenti 1986)

ZYMV thuộc nhóm potyvirus với sợi dài 750 x 11 nm và axit nucleic dạng sợi đơn RNA Bao gồm một số chủng khác nhau ZYMV được truyền bởi rệp muội, hạt có vỏ mỏng và qua vết cắt trong quá trình thu hoạch, Provvidenti (1986; 1993)

ZYMV có thể được truyền cả chiều ngang và chiều dọc của rệp vừng bằng hạt, mặc dù phương pháp chủ yếu là do rệp một cách không liên tục Một số lượng lớn các loài rệp (26 loài) đã được chứng minh là có khả năng truyền virus,

mặc dù hai loài, Myzus persicae và Aphis gossypii, có hiệu quả truyền được báo

cáo cao nhất (tương ứng 41% và 35%), Provvidenti (1986; 1993)

Phòng trừ bệnh bằng biện pháp sử dụng chất tạo SAR như Salicylic acid

Sử dụng hạt giống đã được kiểm tra là sạch bệnh, Provvidenti (1986; 1993)

1.3.4 SLCCNV (Squash leaf curl china virus)

Virus Squash leaf curl china virus được tìm thấy trên bí xanh (bí đao) đã trở

thành một vấn đề nghiêm trọng ở Bang Tamil Nadu, đó là một trong những khu vực trồng chủ yếu cây bí xanh (bí đao) tại Ấn Độ Tỷ lệ mắc bệnh nghiêm trong được tìm thấy tại Perambaluk, bang Tamil Nadu lên đến 100%, mất mùa được ghi nhận trong khoảng thời gian từ tháng 12 năm 2012 đến tháng 5 năm 2013 Cây bị nhiễm virus lá thể hiện các triệu chứng đặc trưng sau: Quăn keo, nhăn nheo, có vết gấp, màu vàng, nhỏ không phát triển, Mohammed et al (2013)

Trang 26

1.3.5 SLCV (Squash leaf curl virus)

SLCV gây ra hệ thống cây còi cọc, lá quăn nghiêm trọng trong hầu hết các cây họ bầu bí Trong bí ngô, bí, dưa hấu, một, khảm lá nặng hoặc đốm kèm quăn lá

SLCV là một geminivirus, có sợi dài 20 x 30 nm và axit nucleic dạng sợi đơn DNA Vector truyền bệnh là bọ phấn và được phát hiện đầu tiên trên họ bầu bí, Cabi (2015)

1.3.6 SqMV (Squash mosaic virus)

Squash mosaic virus (SqMV) được biết từ những năm 1970s Ở nhiều nước trên thế giới, sản xuất bầu bí bị giảm sút bởi sử dụng hạt bị virus và không

có kinh nghiệm quản lý với virus này

Squash mosaic virus (SqMV) có triệu chứng rất đặc trưng, lá khảm đậm

nhạt, gân lá xanh thẫm, đốm hình nhẫn và giống với một số virus khác Lá mầm cũng có triệu chứng Cây còi cọc và quả xấu xí, mất màu

SqMV thuộc nhóm comovirus, kích thước sợi virus 28-30nm Axit nucleic

có 2 sợi đơn RNAs Các chủng khác nhau gây ra các triệu chứng khác nhau trên các loài bầu bí khác nhau, Nelson (1973); Nolan and Campbell (1984)

Vector của virus này là bọ cánh cứng có sọc và có đốm (Acalymma trivittatum), (Diabrotica undecimpunctata) Virus này bền vững và có thể lây

truyền trong suốt quá trình sản xuất và thu hoạch Ký chủ của virus này là các loài thuộc họ bầu bí và họ rau muối, Nelson and Knuhtsen (1973); Nolan and Campbell (1984)

Trang 27

PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20 trong sinh học phân tử PCR là một kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu CNSH Có vô số tài liệu tiếng Việt và tiếng Anh về kỹ thuật PCR Dưới đây là tóm tắt kỹ thuật, Michael (2006)

Tùy thuộc khuôn là DNA hay RNA mà có tên phản ứng là PCR hay PCR: Khuôn là DNA => PCR (polymerase chain reaction)

RT-Khuôn là RNA => RT-PCR (Reverse transcription – PCR)

1.4.1 Nguyên lý

Nguyên lý của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:

+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzim helicase

+ Kết hợp với enzim DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp

+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt, chủ động

Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng) Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt

độ thấp Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không

Trang 28

có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100oC Ở nhiệt độ này DNA sẽ bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng) Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài

- Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử

- Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm

- Chọn giống vật nuôi, cây trồng

- Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn

- Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phưng pháp di truyền phân

tử Y học – Khoa học hình sự

- Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus

- Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền

- Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm

- Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR…

1.5 Phương pháp ELISA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa

để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản

phẩm sinh học

1.5.1 Nguyên lý

Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên -

kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:

Trang 29

(1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt; (2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó Kháng thể này được gắn kết với enzyme;

(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được

Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa

KN-KT Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra

Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu

Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc hiệu cho KN chưa biết Thông thường KN được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate)

- Phương thức cố đinh không đặc hiệu: Kháng nguyễn gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa

- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): Kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra

Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp Kháng Kháng nguyên có thể xảy ra

thể-Nếu Kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện Kháng nguyên cần kiểm tra Trong trường hợp sử dụng Kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), Kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua Kháng thể thứ cấp này

Giữa các bước của ELISA, các protein và các Kháng thể không đặc hiệu, Kháng thể không gắn với Kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa" Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn Kháng thể liên kết với Kháng nguyên được giữ lại Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với Kháng thể trong phức hợp Kháng thể-Kháng nguyên Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ xảy ra

Trang 30

Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA

1.5.2 Ứng dụng

Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học như:

Phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh

Phát hiện yếu tố gây dị ứng thực phẩm như sữa, đậu phộng, quả óc chó, hạnh nhân và trứng

Phát hiện độc tố trong tảo

Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, sán lá

gan… trong thực phẩm

Ứng dụng phương pháp elisa xét nghiệm HIV

Chuẩn đoán và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C, bệnh ung thư

Ứng dụng để phát hiện bệnh A cantonensis (bệnh viêm màng não) do loại

giun kí sinh ở phổi chuột gây ra

Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Trung-Tây Nguyên

Chuẩn đoán bệnh Tristeza (tác nhân gây bệnh héo rũ) trên cây cam quýt Giám định sự hiện diện của BBTV (Banana Bunchy Top Virus) gây bệnh

chùn đọt chuối

Phát hiện kháng thể chống Mycoplasma hyopnewmonia (MH) ở heo

Giám định bệnh lùn xoắn lá trên lúa bằng phương pháp DAS ELISA cải tiến

Trang 31

- Nhóm gián tiếp (indirect ELISA): kháng thể liên kết enzyme không phải

1.6 Ribavirin và ứng dụng

1.6.1 Thuốc ribavirin

Công thức hóa học của ribavirin là C8H12N4O5 Ribavirin chứa trên 98.9%

và không quá 101.5% C8H12N4O5 trong tổng vật chất khô

Loại thuốc: Thuốc kháng virus

Dạng thuốc và hàm lượng: Viên nén 500 mg

Ribavirin được biết đến từ khoảng 40 năm trước đây, Sidwell (1972), ribavirin (1 - [3-o-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide) đã chứng tỏ là một trong những thuốc kháng virus nổi bật nhất Tác dung của Ribavirin tới ức chế sự sao chép của một số lượng lớn các RNA và DNA virus đã được công bố trong nhiều báo cáo, Huffman (1973); Schuster (1976); Cassels (1982); Dawson (1984); Lozoya (1984); Shepard (1977); Simpkins (1981), tuy nhiên các công bố

ở trên đều được tiến hành ở trên mô phân sinh đỉnh đã nhiễm virus, chưa có

Trang 32

nghiên cứu hiệu quả của thuốc trên cây ngoài đồng ruộng Vì vậy, chúng tôi thực hiện thí nghiệm này nhằm xác định hiệu quả ức chế của ribavirin đối với virus trực tiếp trên cây-thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm

1.6.2 Đặc điểm và cơ chế tác động của ribavirin tới virus thực vật

Ribavirin có cấu trúc tương tự như nucleosid guanosin, một trong bốn thành phần cơ bản của ARN ARN là thiết yếu trong việc tổng hợp protein, như thể truyền tin với mã di truyền của các virus ARN và ADN Ribavirin ức chế thể truyền tin ARN, ngăn cản sự phiên mã của virus và chặn đứng bệnh nhiễm Ribavirin ngăn chặn sự sao chép virus mà không tác động đến chức năng của tế bào bình thường Tác dụng kháng virus của thuốc chủ yếu ở trong tế bào nhiễm virus nhạy cảm Ribavirin được vận chuyển nhanh vào trong tế bào và nhanh chóng bị enzym tế bào chuyển đổi thành ribavirin khử ribose (deribosylated ribavirin) và phosphoryl hoá thành ribavirin-5'-monophosphat, -diphosphat và -triphosphat Phosphoryl hóa chủ yếu xảy ra ở trong tế bào nhiễm virus, nhưng cũng có ở tế bào không nhiễm Ribavirin triphosphat (RTP) là chất ức chế cạnh tranh mạnh của inosin monophosphat (IMP) dehydrogenase, ARN polymerase của virus influenza, và mARN guanylyl transferase và methyltransferase (các enzym sau cần thiết cho sự gắn thêm guanosin triphosphat vào 5' cuối (terminus) chóp (cap) của mARN của virus) Tất cả các tác dụng khác nhau đó đã làm giảm nhiều dự trữ guanosin triphosphat nội bào và làm ức chế tổng hợp protein và ARN của virus Cuối cùng, sao chép virus và lan truyền virus tới các tế bào khác

bị ngăn chặn hoặc ức chế mạnh Một đặc tính hết sức quan trọng của ribavirin (có thể là kết quả của một loạt cơ chế về hoạt tính kháng virus) là việc virus không thể sinh ra các thể đột biến đề kháng với thuốc, Dale et al (1997)

1.7 Nhóm chất kích kháng chống virus dựa trên cơ chế SAR (systemic acquired resistance – tính kháng tập nhiễm hệ thống)

Trong những năm 1960 - 1970 nhiều quan sát đã cho thấy một cây bị nhiễm trước một tác nhân gây bệnh có thể tạo tính kháng chống lại sự xâm nhiễm tiếp theo của chính tác nhân đó hoặc tác nhân khác Tính kháng tập nhiễm

Trang 33

hệ thống SAR là loại tính kháng tạo được có tính lưu dẫn (hệ thống), phổ rộng (chống lại nhiều tác nhân gây bệnh và thậm chí các ức chế vô sinh), thường dẫn tới biểu hiện protein PR và thông qua đường hướng dẫn truyền tín hiệu SA -salycilic acid

Ở cây trồng, trong tế bào cây có các gen giúp tế bào cây tiết ra các chất có khả năng kháng lại với một loại bệnh nào đó Trong điều kiện bình thường, các gen này luôn bị một gen ức chế nằm bên cạnh ức chế Khi ta tác động các tác nhân gây kích kháng bằng cách ngâm hạt, rễ, hay phun lên lá, tác nhân này tác động lên bề mặt lá, kích thích các thụ thể này tạo ra tín hiệu là những dòng ion hay tín hiệu điện tử trong cây sau đó, chuyển tín hiệu này vào nhân của tế bào và tác động vào gen ức chế, làm cho gen ức chế không còn ức chế các gen giúp tế bào cây tiết ra các chất kháng bệnh Nhờ các chất kháng bệnh này mà cây trồng

từ nhiễm bệnh trở thành kháng bệnh

1.7.1 Chất kích kháng Dufulin

Dufulin [O, O’-diethyl-α-(4-methyl fluorophenyl) phosphonate] là một α-aminophosphat mới có khả năng kháng virus thực vật được phát triển ở Trung Quốc, Chen (2012) Dufulin thể hiện hoạt tính kháng virus cao trong khi ít gây độc cho người và gia súc Các xét nghiệm hóa sinh và nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng dufulin làm tăng khả năng kích kháng

benzothiazole-2-ylamino)-(2-của cây, ức chế sự phát triển tobacco mosaic virus (TMV), Cucumber mosaic virus, và potato virus Y, Song BA (2009) Dufulin có liên quan đến tín hiệu dẫn

truyền và protein thụ thể HrBP1 trên cây thuốc lá có thể là mục tiêu ban đầu của

nó do vai trò của protein này trong quá trình truyền tín hiệu Gần đây, Trung Quốc đã đăng ký sử dụng dufulin trên các cánh đồng thuốc lá với nồng độ 100-500g ai/hm2, Chen (2012)

1.7.2 Chất kích kháng Bion

BTH (benzo(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothiolic acid (BTH,

acibenzolar-S-methyl) BTH là sản phẩm của hãng Novartis (bán tại Việt Nam với tên thương mại là BION) BTH có thể cảm ứng SAR ở liều lượng thấp, do vậy tránh được

Trang 34

hiệu ứng gây độc cho cây BTH có cơ chế tạo SAR giống như SA và có thể chống được nhiều nhóm tác nhân gây hại kể cả virus BTH có hiệu quả chống

nấm Cercospora nicotianae, Peronospora tabacina, Phytophthora parasitica, nhiều nấm phấn trắng, gỉ sắt và sương mai khác, vi khuẩn Pseudomonas syringae, virus TMV, CMV và TSWV

Bion 50WP là sản phẩm của hãng Syngenta do công ty thuốc BVTV An Giang cung cấp Bion 50WP có hoạt chất là acybenzolar-S-methyl (BTH), một chất kích kháng tạo tính kháng tập nhiễm hệ thống thực sự, Sygenta (2000)

Trang 35

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

- Xác định bệnh virus hại cây họ bầu bí tại tỉnh Hòa Bình

- Xác định tỷ lệ bệnh virus hại cây họ bầu bí trên địa bàn tỉnh Hòa Bình năm 2014

- Chẩn đoán bệnh bằng phương pháp PCR, ELISA

- Lây bệnh nhân tạo bệnh đốm hình nhẫn do virus PRSV trên cây bí ngô,

bí xanh, dưa bở, đu đủ

- Thử nghiệm phòng chống bằng kích kháng Bion, Dufulin và thuốc trừ virus Ribavirin

2.2 Địa điểm, thời gian và vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Tại 06 huyện, TP: Huyện Yên Thủy, huyện Kim Bôi, huyện Lạc Sơn, huyện Lạc Thủy, huyện Kỳ Sơn và TP Hòa Bình

- Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Hòa Bình

- Trung tâm bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 4 năm 2014 đến tháng 4 năm 2015

2.2.3 Vật liệu nghiên cứu

- Vật liệu điều tra, thu mẫu: Máy ảnh, Thước; Kính lúp cầm tay x10; Sổ, bút ghi chép, túi đựng mẫu vật các cỡ vv

- Vật liệu trong phòng: Máy ảnh, Kính hiển vi, máy vi tính, cồn acetic, cồn lactic, panh vv

- Mẫu cây bệnh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm điều tra, sau đó được bảo quản khô bằng hạt Silicagel để kiểm tra virus

- Các mẫu hạt giống cây họ bầu bí dùng gieo cây thí nghiệm

* Thiết bị nghiên cứu:

Trang 36

Máy đọc bản ELISA, máy PCR, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ định ôn

* Dụng cụ nghiên cứu:

- Pipet tự động 1 đầu côn: 10 - 20 µm, 100 µm, 200 µm, v.v

- Ống đong 10 - 1000 ml

- Bình thuỷ tinh loại 50 - 1000 ml

- Phễu lọc, vải lọc, giấy thấm

- Các chất kích kháng Bion, Duflin, Bravina

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp điều tra ngoài đồng

- Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh virus bầu bí ở ruộng sản xuất:

Áp dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại theo

“Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật tập I, III” của Viện Bảo vệ thực vật

100 cây ngẫu nhiên trên 5 điểm

Trang 37

- Phương pháp thu thập mẫu lá bệnh:

Mẫu thu đựng riêng trong từng túi có ghi đầy đủ các thông tin sau:

+ Tên mẫu;

+ Địa điểm ruộng;

+ Thời gian lấy mẫu;

+ Đặc điểm triệu chứng bệnh;

+ Tỷ lệ nhiễm bệnh chung cả ruộng

- Phương pháp bảo quản mẫu bệnh :

Có hai phương pháp bảo quản mẫu: bảo quản khô và bảo quản tươi

+ Bảo quản khô:

Mẫu thu về được để trong túi chứa hạt Silicagel Thay hạt Silicagel đến khi mẫu khô

+ Bảo quản tươi:

Mẫu thu về được để nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -20oC ở Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới

Được tiến hành theo giai đoạn sinh trưởng, chọn những lá có triệu chứng điển hình đem về bảo quản khô bằng hạt Silicagel

2.3.2 Phương pháp ELISA

Virus kiểm tra bằng ELISA được thực hiện theo phương pháp dùng kỹ thuật bẫy kháng nguyên trước (Plate trapped antigen – ELISA, PTA-ELISA), Mowat and Dawson, (1987) Cụ thể các bước như sau:

Bước 1: Nghiền mẫu

- Tiến hành nghiền mẫu trong dung dịch đệm Carbonate pH 9,6 với tỷ lệ 0,5g lá/1ml dung dịch đệm (Pha đệm carbonate (pH 9.6) (1L): 1.59 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3, 0.02 g NaN3 Hòa các chất trong 900 ml H2O, chỉnh pH = 9.6 với HCl và lên thể tích 1L)

- Nghiền mẫu đối chứng dương

- Nhỏ vào mỗi giếng ELISA 100 µl/giếng Sau đó để bản ELISA vào hộp

ẩm và ủ qua một đêm ở tủ lạnh thường

Trang 38

Rửa bản ELISA: Sau khi ủ, đem bản ELISA đi rửa (trước khi rửa vảy mạnh

để loại hết nước ở trong bản ELISA) 3 lần bằng đệm PBS – T, mỗi lần cách nhau 3 – 4 phút Mỗi lần rửa bản ELISA đều vảy mạnh để loại hết đệm PBS – T ra khỏi các giếng, sau đó mới tiến hành nhỏ đệm PBS – T mới vào để rửa tiếp

Bước 2: Cố định kháng thể đặc hiệu virus

Cho kháng huyết thanh vào đệm P S-T PO tỷ lệ 1/1000, trộn đều, nhỏ vào mỗi giếng 100 µl đệm chứa kháng huyết thanh ở trên Sau đó để bản ELISA trong hộp ẩm và để trong điều kiện nhiệt độ 37oC trong thời gian 2 – 4 giờ Rửa bản ELISA (như ở bước 1)

Bước 3: Cố định kháng thể chuột liên kết AP (Alkaline phosphatase) đặc hiệu Pha kháng thể chuột liên kết AP đặc hiệu kháng thể thỏ trong đệm kháng huyết thanh theo tỉ lệ 1/5000

Nhỏ vào mỗi giếng 100 µl dịch kháng thể chuột ở trên

Để bản ELISA trong hộp ẩm và ủ ở 37oC trong 2-4 giờ

Rửa bản ELISA (như ở bước 1)

Bước 4: Cố định chất nền (nitrophenyl photphat)

Pha chất nền trong đệm cơ chất với lượng 1 mg/mL

Nhỏ 100 µl dịch chất nền vào mỗi giếng

Để bản ELISA ở nhiệt độ phòng, trong tối, trong 30-60 phút

Đánh giá kết quả bằng mắt và đo mật độ quang OD (optical density) bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm

Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu bị nhiễm bệnh

Những giếng không màu: giếng chứa mẫu không bị nhiễm bệnh

2.3.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR

2.3.3.1 Chiết DNA tổng số từ mô lá

+ Phương pháp chiết nhanh bằng NaOH:

Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 µl dung dịch NaOH 0,5 M vào tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng để nghiền nhuyễn mẫu lá Lấy 100 µl dung dịch đệm Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL, sau khi

Trang 39

nghiền mẫu xong lấy 2 µl dịch nghiền cho vào tube 1,5mL chứa dung dịch đệm Tris

0,1M, pH = 8 Dịch hòa loãng này được dùng để chạy PCR

Trang 40

- Chuẩn bị bản gel: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100ml TAE 1x, sau đó lắc nhẹ lọ để hoà tan agarose, sau khi agarose đã tan hoàn toàn đun trong lò vi sóng 3 – 4 phút, bổ sung Ethidium Bromide theo tỷ lệ cứ 100 ml dung dịch gel cho 4µl, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng

- Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 40oC thì đổ vào khuôn có đặt lược tạo lỗ khuôn Để khuôn ở nhiệt độ phòng

- Lấy các tube 0,5mL đã hấp khử trùng, đánh số thứ tự Cho vào mỗi tube 4µl Loading Dye X6, đảo đều và Spin trong 5 giây

- Cắm nguồn điện cho máy điện di, đặt ở hiệu điện thế 100V trong 25 - 30 phút, tắt máy điện di, đặt bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại, quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh

2.3.4 Phương pháp lây nhiễm PRSV bằng tiếp xúc cơ học

* Giá thể gieo cây thí nghiệm:

Đất gieo trồng cây thí nghiệm được ủ trong formol 5 ngày để tiêu diệt các nguồn bệnh có trong đất thí nghiệm, có che phủ nilông, sau đó bỏ nilông ra cho đất thoáng, sau 2 ngày có thể sử dụng Đất sau khi ủ trong formol được bổ sung phân bón vi sinh và vỏ trấu hun trước khi gieo cây thí nghiệm, theo tỷ lệ 1:1:5

* Cây lây (được trồng cách ly trong nhà lưới): Cây bầu bí giai đoạn ra lá

thật (khoảng 7-10 ngày sau gieo), cây đu đủ giai đoạn có 2 -3 lá thật (sau gieo khoảng 20 ngày), cây lây nhiễm còn đủ hai lá mầm

Định dạng
Số trang	91
Dung lượng	4,96 MB