Phương pháp ELISA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa

để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học.

1.5.1. Nguyên lý

Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19 (1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt; (2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme;

(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.

Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN- KT. Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra.

Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu.

Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Thông thường KN được cốđịnh tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate).

- Phương thức cốđinh không đặc hiệu: Kháng nguyễn gắn trực tiếp vào bề

mặt của đĩa.

- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): Kháng nguyên được gắn với một kháng thểđặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra

Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp Kháng thể- Kháng nguyên có thể xảy ra.

Nếu Kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện Kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng Kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), Kháng nguyên cần xác định sẽđược nhận biết qua Kháng thể thứ cấp này.

Giữa các bước của ELISA, các protein và các Kháng thể không đặc hiệu, Kháng thể không gắn với Kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn Kháng thể liên kết với Kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với Kháng thể trong phức hợp Kháng thể-Kháng nguyên. Phản

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ

chính xác của ELISA.

1.5.2. Ứng dụng

Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học như:

Phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ

sau khi tăng sinh.

Phát hiện yếu tố gây dị ứng thực phẩm như sữa, đậu phộng, quả óc chó, hạnh nhân và trứng.

Phát hiện độc tố trong tảo.

Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, sán lá

gan… trong thực phẩm.

Ứng dụng phương pháp elisa xét nghiệm HIV

Chuẩn đoán và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C, bệnh ung thư.

Ứng dụng để phát hiện bệnh A. cantonensis (bệnh viêm màng não) do loại giun kí sinh ở phổi chuột gây ra.

Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Trung-Tây Nguyên. Chuẩn đoán bệnh Tristeza (tác nhân gây bệnh héo rũ) trên cây cam quýt. Giám định sự hiện diện của BBTV (Banana Bunchy Top Virus) gây bệnh chùn đọt chuối.

Phát hiện kháng thể chống Mycoplasma hyopnewmonia (MH) ở heo. Giám định bệnh lùn xoắn lá trên lúa bằng phương pháp DAS ELISA cải tiến.