- Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh virus bầu bí ở ruộng sản xuất:
Áp dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại theo “Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật tập I, III” của Viện Bảo vệ thực vật (1997, 2000).
Điều tra bệnh virus trên một số huyện, thành phố trồng cây bầu bí trong tỉnh Hòa Bình năm 2014.
- Chỉ tiêu đánh giá: Mức độ triệu chứng bệnh.
Tỉ lệ bệnh: Số cây có triệu chứng/số cây quan sát. Điều tra theo phương pháp 5 điểm trên đường chéo góc (cách bờ 2 mét), tại mỗi huyện lựa chọn một khu ruộng có diện tích từ 1-3ha để điều tra, điều tra theo giai đoạn sinh trưởng của cây (giai đoạn cây con, giai đoạn phát triển thân lá, giai đoạn ra hoa-đậu quả, giai đoạn bắt đầu thu hoạch, giai đoạn thu hoạch rộ). Mỗi điểm điều tra ít nhất 100 cây ngẫu nhiên trên 5 điểm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27 - Phương pháp thu thập mẫu lá bệnh:
Mẫu thu đựng riêng trong từng túi có ghi đầy đủ các thông tin sau: + Tên mẫu; + Địa điểm ruộng; + Thời gian lấy mẫu; + Đặc điểm triệu chứng bệnh; + Tỷ lệ nhiễm bệnh chung cả ruộng. - Phương pháp bảo quản mẫu bệnh :
Có hai phương pháp bảo quản mẫu: bảo quản khô và bảo quản tươi. + Bảo quản khô:
Mẫu thu về được để trong túi chứa hạt Silicagel. Thay hạt Silicagel đến khi mẫu khô.
+ Bảo quản tươi:
Mẫu thu về được để nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -20oC ở Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới.
Được tiến hành theo giai đoạn sinh trưởng, chọn những lá có triệu chứng
điển hình đem về bảo quản khô bằng hạt Silicagel.
2.3.2. Phương pháp ELISA
Virus kiểm tra bằng ELISA được thực hiện theo phương pháp dùng kỹ
thuật bẫy kháng nguyên trước (Plate trapped antigen – ELISA, PTA-ELISA), Mowat and Dawson, (1987). Cụ thể các bước như sau:
Bước 1: Nghiền mẫu
- Tiến hành nghiền mẫu trong dung dịch đệm Carbonate pH 9,6 với tỷ lệ
0,5g lá/1ml dung dịch đệm. (Pha đệm carbonate (pH 9.6) (1L): 1.59 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3, 0.02 g NaN3. Hòa các chất trong 900 ml H2O, chỉnh pH = 9.6 với HCl và lên thể tích 1L).
- Nghiền mẫu đối chứng dương
- Nhỏ vào mỗi giếng ELISA 100 µl/giếng. Sau đó để bản ELISA vào hộp
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 Rửa bản ELISA: Sau khi ủ, đem bản ELISA đi rửa (trước khi rửa vảy mạnh
để loại hết nước ở trong bản ELISA) 3 lần bằng đệm PBS – T, mỗi lần cách nhau 3 – 4 phút. Mỗi lần rửa bản ELISA đều vảy mạnh để loại hết đệm PBS – T ra khỏi các giếng, sau đó mới tiến hành nhỏđệm PBS – T mới vào để rửa tiếp.
Bước 2: Cốđịnh kháng thể đặc hiệu virus
Cho kháng huyết thanh vào đệm P S-T PO tỷ lệ 1/1000, trộn đều, nhỏ vào mỗi giếng 100 µl đệm chứa kháng huyết thanh ở trên. Sau đó để bản ELISA trong hộp ẩm và để trong điều kiện nhiệt độ 37oC trong thời gian 2 – 4 giờ.
Rửa bản ELISA (nhưở bước 1)
Bước 3: Cốđịnh kháng thể chuột liên kết AP (Alkaline phosphatase) đặc hiệu Pha kháng thể chuột liên kết AP đặc hiệu kháng thể thỏ trong đệm kháng huyết thanh theo tỉ lệ 1/5000.
Nhỏ vào mỗi giếng 100 µl dịch kháng thể chuột ở trên.
Để bản ELISA trong hộp ẩm và ủở 37oC trong 2-4 giờ. Rửa bản ELISA (nhưở bước 1)
Bước 4: Cốđịnh chất nền (nitrophenyl photphat)
Pha chất nền trong đệm cơ chất với lượng 1 mg/mL Nhỏ 100 µl dịch chất nền vào mỗi giếng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để bản ELISA ở nhiệt độ phòng, trong tối, trong 30-60 phút
Đánh giá kết quả bằng mắt và đo mật độ quang OD (optical density) bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm.
Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu bị nhiễm bệnh. Những giếng không màu: giếng chứa mẫu không bị nhiễm bệnh.