so sánh phương pháp điều chế và ảnh hưởng của keratin thủy phân lên các dạng tóc hư tổn

Đề tài ” So sánh phương pháp điều chế và ảnh hưởng của keratin thủy phân lên các dạng tóc hư tổn” được nghiên cứu để so sánh khả năng phân hủy bột lông tạo ra keratin thủy phân giữa vi k

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN

SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA KERATIN THỦY PHÂN LÊN CÁC DẠNG TÓC HƯ TỔN

MSSV: 2102406 LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN

SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA KERATIN THỦY PHÂN LÊN CÁC DẠNG TÓC HƯ TỔN

MSSV: 2102406 LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

Bùi Thị Minh Diệu Trần Minh Trang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng, nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ và động viên từ nhiều phía Tôi xin gửi những lời cám ơn chân thành nhất của mình đến:

Ban Lãnh đạo, quý Thầy, Cô – Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học đã tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức, hỗ trợ về cơ sở vật chất, trang thiết bị

và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cô Huỳnh Hương Liên, Thầy Trần Sỹ Nam, đặc biệt là TS Bùi Thị Minh Diệu

- giáo viên hướng dẫn và cô Trần Thị Xuân Mai - cố vấn học tập khóa 36 đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Các bạn cùng khóa, các anh chị và các bạn làm việc trong phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, phòng thí nghiệm Protein & enzyme đã tạo điều kiện về các trang thiết bị và chia sẻ kinh nghiệm cho tôi

Cô Thảo – chủ tiệm tóc, các bạn: Nguyệt, Như, Thuyền đã hỗ trợ tôi trong việc tìm và xử lý mẫu tóc

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn sự giúp đỡ, động viên của gia đình về tinh thần

và vật chất để tôi hoàn thành khóa học, cũng như đề tài luận văn tốt nghiệp

Kính chúc quý Thầy Cô, các Anh Chị và các bạn được dồi dào sức khỏe và thành công trong cuộc sống

Xin trân trọng cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

TÓM LƢỢC

Một lượng lớn chất thải lông từ ngành công nghiệp chế biến thịt gia súc, gia cầm

đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường Vì vậy, việc xử lý và tái sử dụng chất thải từ lông một cách hiệu quả đang là vấn đề cấp bách cần được giải quyết Đã có nhiều nghiên cứu về việc thủy phân lông tạo thành keratin thủy phân, một trong những protein hòa tan quan trọng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Bên cạnh đó, ứng dụng keratin thủy phân vào các sản phẩm chăm sóc da, tóc cũng đang được quan tâm nghiên cứu Đề tài ” So sánh phương pháp điều chế và ảnh hưởng của keratin thủy phân lên các dạng tóc hư tổn” được nghiên cứu để so sánh khả năng phân hủy bột lông tạo ra keratin thủy phân giữa vi khuẩn (2 dòng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2, Bacillus cereus K13) và enzyme bromelain; đồng thời so sánh ảnh hưởng của keratin thủy phân lên sự hồi phục của các dạng tóc hư tổn (tóc duỗi, tóc nhuộm, tóc uốn, tóc cháy)

Kết quả của đề tài cho thấy khả năng phân hủy và hàm lượng keratin thủy phân tạo ra từ sự phân hủy của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 trong 7 ngày đạt cao nhất (71,85%; 112,404 mg) và khác biệt so với enzyme bromelain (46,76%; 71,485 mg)

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của keratin thủy phân lên các dạng tóc hư tổn cho thấy tóc duỗi, tóc nhuộm và tóc cháy có sự phục hồi rõ rệt khi ngâm trong keratin thủy phân bởi vi khuẩn so với đối chứng (-); và không khác biệt nhiều so với đối chứng (+) Khi ngâm các mẫu tóc trên với keratin thủy phân bởi enzyme bromelain thì tóc hầu như không có sự phục hồi Tuy nhiên, với mẫu tóc bình thường và mẫu tóc uốn thì không có sự khác biệt nhiều so với đối chứng (-) Như vậy, keratin thủy phân được tạo

ra từ chất thải lông bị phân hủy bởi vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong các sản phẩm chăm sóc tóc hư tổn

Từ khóa: enzyme, keratin thủy phân, tóc hư tổn, vi khuẩn

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về chất thải chứa keratin 2

2.2 Tổng quan về keratin 3

2.3 Vi sinh vật phân hủy keratin 5

2.4 Cấu trúc của tóc 8

2.5 Sơ lược về keratin thủy phân dưỡng tóc 9

2.6 Một số nghiên cứu về keratin thủy phân 9

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Phương tiện 13

3.1.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm……….13

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm……… 13

3.1.3 Hóa chất………14

3.1.4 Địa điểm thí nghiệm……….15

3.1.5 Thời gian thực hiện……… 15

3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

3.2.1 Thu mẫu và chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống………15

3.2.2 Chuẩn bị cơ chất……… ….16

3.2.3 Điều chế keratin thủy phân từ vi khuẩn phân giải keratin………16

3.2.4 Điều chế keratin thủy phân bằng phương pháp sinh hóa……… 18

3.2.5 Khảo sát khả năng hồi phục của tóc hư tổn khi bổ sung keratin thủy phân.18 3.2.6 Chỉ tiêu theo dõi……….20

2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu………23

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Điều chế keratin thủy phân từ vi khuẩn phân giải keratin 24

4.1.1 Khảo sát khả năng phân hủy cơ chất của vi khuẩn và hàm lượng protein hòa tan sinh ra………24

4.1.2 Định tính các acid amin chứa lưu huỳnh trong keratin thủy phân thô từ vi khuẩn phân giải keratin……… 28

4.2 Điều chế keratin thủy phân bằng phương pháp sinh hóa 29

4.2.1 Khả năng phân hủy cơ chất của enzyme và hàm lượng protein hòa tan sinh ra……….29

4.2.2 Định tính các acid amin chứa lưu huỳnh trong keratin thủy phân thô từ enzyme………30

4.3 Khảo sát khả năng hồi phục của tóc hư tổn khi bổ sung keratin thủy phân 30

4.3.1 Đánh giá cảm quan……… 31

4.3.2 Độ ẩm của tóc……… 35

4.3.3 Cấu trúc của tóc………38

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Nguồn gốc của một số chủng vi khuẩn phân hủy lông 6

Bảng 2 Thành phần hóa chất trong môi trường đặc 14

Bảng 3 Thành phần hóa chất trong môi trường lỏng 14

Bảng 4 Thành phần hóa chất trong môi trường tăng sinh khối 15

Bảng 5 Xây dựng đường chuẩn bradford 21

Bảng 6 Khả năng phân hủy các loại cơ chất của 2 dòng vi khuẩn và hàm lượng protein hòa tan sinh ra sau 7 ngày nuôi cấy 24

Bảng 7 Khả năng phân hủy và hàm lượng protein hòa tan sinh ra khi cho bromelain phân hủy bột lông gà 29

Bảng 8 Đánh giá cảm quan độ bóng của tóc 31

Bảng 9 Đánh giá cảm quan màu sắc của tóc 32

Bảng 10 Đánh giá cảm quan độ suông và mềm mượt của tóc 34

Bảng 11 Độ ẩm của tóc khi ngâm các mẫu tóc vào keratin thủy phân 36

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Cấu trúc của keratin 3Hình 2 Mô hình của α-keratin, β-keratin và cầu nối disulfide 4Hình 3 Cấu trúc của tóc 8Hình 4 Biểu đồ ảnh hưởng của sự tương tác giữa chủng vi khuẩn và cơ chất đến tỉ lệ phân hủy 26Hình 5 Biểu đồ ảnh hưởng của sự tương tác giữa chủng vi khuẩn và cơ chất đến hàm lượng protein hòa tan sinh ra 27Hình 6 Dung dịch keratin thủy phân từ vi khuẩn trước và sau phản ứng folia 28Hình 7 Dung dịch keratin thủy phân từ enzyme trước và sau phản ứng folia 30Hình 8 Biểu đồ ảnh hưởng của sự tương tác giữa mẫu tóc và keratin thủy phân đến độ

ẩm của tóc 37Hình 9 Cấu trúc của tóc chụp sem 39

TỪ VIẾT TẮT

- SEM: Scanning Electron Microscope

- CV: Coefficient of Variation

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cùng với quá trình đô thị hóa là sự gia tăng nhanh chóng các ngành công nghiệp, trong đó, ngành công nghiệp chế biến thịt gia súc, gia cầm đã tạo ra một lượng lớn chất thải như lông, phân da,… gây ô nhiễm môi trường Bên cạnh sự quan tâm đến bảo

vệ và cải thiện môi trường, nhu cầu tăng lên đối với việc bảo tồn và tái chế năng lượng

đã thúc đẩy mạnh mẽ việc tìm kiếm các lựa chọn cho sự kiểm soát các chất thải chứa keratin Vì vậy, việc xử lý nguồn chất thải này bằng các phương pháp vật lý, hóa học,

vi sinh vật,… đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học Bên cạnh đó, việc này đã thúc đẩy việc nghiên cứu những phương pháp để chuyển đổi chất thải keratin thành các sản phẩm có giá trị như thức ăn chăn nuôi, mỹ phẩm, thuốc,…

Mỹ phẩm chăm sóc da, tóc là một trong những ứng dụng quan trọng của chất thải keratin sau khi đã chuyển đổi thành keratin thủy phân Keratin được thủy phân thành những protein ngắn hoặc các amino acid thiết yếu để bổ sung, chăm sóc và phục hồi tóc hư tổn Hầu hết các keratin dùng trong mỹ phẩm được thông qua quá trình thủy phân hóa học và phương pháp thủy nhiệt Vi sinh vật cũng có thể phân hủy keratin để tạo nguồn protein có giá trị, đồng thời giảm ô nhiễm môi trường và mang lại hiệu quả kinh tế Vì vậy, đề tài “So sánh phương pháp điều chế và ảnh hưởng của keratin thủy phân lên các dạng tóc hư tổn” được thực hiện góp phần làm phong phú và tạo triển vọng cho việc ứng dụng sản phẩm này vào thực tiễn

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện với mục tiêu so sánh phương pháp điều chế và ảnh hưởng của keratin thủy phân lên các dạng tóc hư tổn

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về chất thải chứa keratin

Theo Worldwatch Institute, năm 2007, sản lượng gia cầm trên thế giới đã được

dự kiến đạt 93 triệu tấn, tăng 4% so với năm 2006 Sản lượng thịt lợn năm 2007 dự kiến tăng gần 2%, đạt 101 triệu tấn Theo đó, lông gia cầm, gia súc tích tụ lại thành chất thải gây ô nhiễm môi trường, nhất là trong điều kiện ngành chăn nuôi toàn cầu đang phát triển mạnh mẽ Lông là chất thải giàu keratin phần lớn được thải ra bởi các ngành công nghiệp chế biến thịt gia súc, gia cầm Hằng năm, các nhà máy chế biến trên toàn thế giới thải ra hàng triệu tấn lông, trong đó keratin chiếm gần 90% trọng lượng lông (Brandelli, 2008) Lông gia súc, gia cầm thải ra ngày càng nhiều, đặt ra yêu cầu phải xử lý tốt loại chất thải này Lông được thủy phân bằng cách xử lý cơ học hoặc hóa học Hầu hết chất thải lông được chôn dưới đất hoặc bị đốt cháy rất tốn chi phí và

có thể gây ra ô nhiễm không khí, đất và nước Cách truyền thống để phân hủy lông như thủy phân bằng kiềm và áp suất hơi nước không chỉ phá hủy các amino acid (methionin, lysine, histidine) mà còn tiêu thụ một lượng lớn năng lượng (Cai et al., 2008; Cortezi et al., 2008) Một số vi khuẩn đã được phân lập từ đất và chất thải gia cầm, gia súc cho thấy tiềm năng sử dụng trong các quá trình thủy phân keratin Phương pháp sử dụng vi sinh vật phân hủy keratin trong lông, tóc không tiêu tốn quá nhiều năng lượng và thân thiện với môi trường Đồng thời, phương pháp này còn tiết kiệm được nguồn protein có giá trị dinh dưỡng cao để tạo thành các sản phẩm có ích cho con người

Keratin được phân hủy bởi vi khuẩn có ứng dụng quan trọng trong quá trình công nghệ sinh học liên quan đến xử lý chất thải chứa keratin từ ngành công nghiệp chế biến thịt gia súc, gia cầm Vi sinh vật được chủng vào có thể chuyển đổi chất thải lông thành thức ăn dễ tiêu hóa cho gia cầm, gia súc và cá; hoặc khí metan và nhiên liệu để sưởi ấm (Ichida et al., 2001) Sau khi thủy phân bằng enzyme keratinase thì keratin không hòa tan được chuyển thành thức ăn chăn nuôi, phân bón, keo,… hoặc được sử dụng để sản xuất các amino acid hiếm như serine, cystein và proline (Papadopoulos et al., 1986; Onifade et al., 1998; Gupta và Ramnani, 2006) Ngoài ra, nó còn có thể được

áp dụng cho xử lý chất thải, dệt may, dược phẩm, mỹ phẩm, da,… Như vậy, chất thải giàu keratin khó phân huỷ như lông, tóc, móng, sừng là sản phẩm phụ được đánh giá cao của chế biến nông – công nghiệp Điều này làm cho tái chế lông một chủ đề quan

tâm trong dinh dưỡng động vật, vì tiềm năng của nó như là một loại thức ăn giá rẻ giàu protein dành cho gia súc và gia cầm

2.2 Tổng quan về keratin

Keratin là một loại protein dạng sợi và được biết đến với sự ổn định cao trong môi trường (Bradbury, 1973) Đây là vật liệu cấu trúc quan trọng, thành phần chính tạo nên lớp biểu bì bên ngoài như da, tóc, lông, móng,… Các monome keratin lắp ráp thành bó để tạo thành sợi trung gian Các sợi này bền, dai, không hòa tan và tạo thành các mô không bị khoáng hóa Thành phần và cấu hình phân tử của các amino acid trong keratin đảm bảo cấu trúc cứng cáp của nó Ít nhất 30 polypeptide keratin khác nhau được biết đến, thuộc 2 họ tiến hóa được chỉ định loại I và loại II (Brandelli, 2008) Chuỗi keratin được đóng gói chặt chẽ trong các xoắn α (α-keratin) hoặc tấm β (β-keratin) thành một chuỗi polypeptide siêu xoắn (Parry và North, 1998; Kreplak et al., 2004), dẫn đến sự ổn định cơ học cao và sức đề kháng chống lại các enzyme phân giải protein phổ biến như pepsin, trypsin và papain (Hoq et al., 2005; Gradišar et al., 2005) Đây là một trong những đặc điểm chính của keratin phụ thuộc vào liên kết disulfide và liên kết hydro giữa các polypeptide và sự tương tác kỵ nước (Brandelli, 2008) và ổn định của các siêu cuộn, liên kết muối và các liên kết khác (Bockle và Muller, 1997; Lin et al., 1999; Gessesse et al., 2003) Ngoài ra, keratin được phân loại thành keratin "cứng" hay "mềm" dựa theo hàm lượng lưu huỳnh cao hay thấp Keratin cứng như tóc, sừng, móng tay,… ít mềm dẻo hơn so với keratin mềm như da người và

mô sẹo, bởi vì liên kết disulfide chống biến dạng (Gupta và Ramnani, 2006)

Hình 1 Cấu trúc của keratin

(Nguồn: http://itech.dickinson.edu/chemistry , 30/5/2014)

- Các α-keratin có trong tóc, lông, sừng, móng tay, móng vuốt và móng của động vật có vú Tóc và các α-keratin bao gồm các sợi đơn α-helically protein liên kết với nhau bằng liên kết hydro (Voet và Voet, 1995)

- Các β-keratin cứng hơn được tìm thấy trong móng tay và móng vuốt, vảy của loài bò sát, loài có mai hoặc vỏ (rùa, đồi mồi), và trong lông, mỏ, móng vuốt của chim và lông của nhím (keratin được hình thành chủ yếu trong các tấm beta Tuy nhiên, các tấm beta cũng được tìm thấy trong α-keratin) (Kreplak et al., 2004) Các beta keratin là sự sắp xếp phản song song và song song của các chuỗi liên kết thông qua liên kết hydro Các β-keratin của loài bò sát và các loài chim có tấm β nếp gấp xoắn lại với nhau, sau đó ổn định và làm cứng bằng cầu disulfide

Hình 2 Mô hình của α-keratin, β-keratin và cầu nối disulfide

(Nguồn: http://www.cliffsnotes.com/sciences/biology/biochemistry/protein-structure/secondary-structure ,

30/5/2014)

Ngoài việc liên kết hydro trong nội bộ và giữa các phân tử, keratin có số lượng lớn amino acid cysteine chứa lưu huỳnh cần thiết cho các cầu nối disulfide Các cầu nối này làm tăng thêm sức mạnh và độ cứng lâu dài, ổn định của keratin Mùi hăng khi đốt tóc là do các hợp chất lưu huỳnh được hình thành Các liên kết disulfide góp phần làm cho keratin không tan, ngoại trừ trong sự phân ly hoặc có tác dụng của chất khử Các keratin trong tóc có tính linh hoạt và đàn hồi hơn là do có ít cầu nối disulfide hơn

so với keratin trong móng tay của động vật có vú, móng guốc và móng vuốt (tương đồng cấu trúc) Ngoài ra, liên kết chéo của các chuỗi protein bởi cầu nối cysteine làm cho ổn định cơ học cao và khả năng chống sự phân giải keratin (Brandelli, 2008) Các sợi keratin có nhiều trong các tế bào sừng được tìm thấy trong cấu trúc của các dạng biểu bì như lông, móng, tóc, mô và sừng của động vật có vú, động vật lưỡng cư, bò sát

và các loài chim Chất thuộc sinh học khác được biết đến có độ bền xấp xỉ của mô keratinized là chitin (Vincenta et al., 2004; Tombolato et al., 2010)

2.3 Vi sinh vật phân hủy keratin

Keratin không tích lũy trong tự nhiên và có thể được thủy phân của một số vi sinh vật Keratinase là enzyme thủy phân keratin được sản xuất từ nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn được phân lập từ đất có chứa keratin (Kaul và Sumbali, 1997; Riffel và

Brandelli, 2006) Trong số các loại nấm sản xuất keratinase, dermathophytes được đặc

biệt mô tả và được phân lập từ vết thương của con người và động vật Keratinase sản

xuất từ Microsporum, Trychophyton và Doratomyces microsporum được mô tả bởi (Kushwaha, 1983; Grzywnowicz et al., 1989; Gradisar et al., 2000) Chủng Aspergillus fumigatus và Aspergillus flavus sản xuất keratinase được mô tả bởi (Santos et al.,

1996) Trong số các loài vi khuẩn, hoạt động thủy phân keratin đã được ghi nhận rộng

rãi cho các chủng từ chi Bacillus và Streptomyces (Lin et al., 1999; Kim et al., 2001; Bressolier et al., 1999) Một số Streptomyces sản xuất keratinase được phân lập từ đất

là vi sinh vật ưa nhiệt Chúng có thể phát triển và phân hủy keratin ở nhiệt độ cao hơn

50°C (Chitte et al., 1999; Mohamedin, 1999) Tuy nhiên, chủng mesophilic cũng được

mô tả như chất thoái hóa keratin, như S pactum DSM 40530 (Böckle et al, 1995) và S albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999) Ngoài ra, S pactum có thể làm giảm các

liên kết disulfide trong khi đang tăng trưởng trên lông vũ (Böckle và Müller, 1997), cho thấy vi sinh vật này có thể sản xuất enzyme phân hủy cầu nối disulfide để tạo điều

kiện thủy phân keratin Keratinase cũng được sản xuất từ các vi khuẩn Bacillus spp Một số chủng B licheniformis và B subtilis được mô tả bởi (Lin et al., 1999; Suh và Lee, 2001) và các loài khác như B pumilus và B cereus cũng sản xuất keratinase (Kim

et al., 2001; Werlang và Brandelli, 2005) Chủng B licheniformis thường có khả năng

phân hủy hoàn toàn lông (Lin et al., 1992; Cheng et al., 1995) Ba loài vi khuẩn

Bacillus được phân lập từ lưu vực sông Amazon đã được mô tả gần đây trong phòng thí nghiệm (Giongo et al., 2007) Những vi khuẩn này (B subtilis, B amyloliquefaciens và B Velesensis) có sự tương đồng cao và tạo ra một sự tổ hợp các

hoạt động phân giải keratin đáng chú ý như cạo lông trên tấm da bò Một số chủng vi

khuẩn Bacillus ưa nhiệt và kiềm tính cũng đã được mô tả cho thấy hoạt động làm suy giảm keratin, chẳng hạn như vi khuẩn Bacillus sp P-001A (Atalo và Gashe., 1993), B halodurans AH-101 (Takami et al., 1992a, 1999), B pseudofirmus AL-89 (Gessesse et

al., 2003), và B pseudofirmus FA30-01 (Kojima et al., 2006) Keratinase được mô tả cho dòng Fervidobacterium pennavorans ưa nhiệt (Friedrich và Antranikian, 1996), Thermoanaerobacter keratinophilus (Riessen và Antranikian, 2001),

Fervidobacterium islandicum (Nam et al., 2002), và các chủng kiềm tính Nesternkonia

sp AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp TOA-1 (Mitsuiki et al., 2004)

Vi khuẩn ưa nhiệt được hứa hẹn cho quá trình thủy phân protein cứng, không hòa tan

như keratin (Suzuki et al., 2006) Hai chủng inomycete là Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A, được phân lập từ đất ở Nam Cực đã sản xuất

enzyme keratinase trong khi đang phát triển trên chất thải từ lông cừu (Gushterova et al., 2005) Một số vi khuẩn phân hủy lông đã được phân lập từ đất và chất thải gia cầm (Bảng 1)

Bảng 1 Nguồn gốc của một số chủng vi khuẩn phân hủy lông (Brandelli, 2008)

Gram dương

Bacillus licheniformis PWD-1 Chất thải gia cầm Williams et al., 1990

Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis

và Bacillus cereus

Chất thải gia cầm Kim et al., 2001

Bacillus macroides và Bacillus cereus Đất đồng cỏ khô Lucas et al., 2003

Streptomyces pactum DSM 40530 Môi trường sưu tập Böckle et al., 1995

Streptomyces albidoflavus K1-02 Đất ở chuồng gà Bressolier et al., 1999

Terrabacter terrae Đất Montero-Barrientos et

2002

Chryseobacterium sp kr6 Lông gia cầm phân hủy Riffel et al., 2003a

Alcaligenes faecalis, Janthinobacterium

maltophilia

Đất đồng cỏ khô Lucas et al., 2003

Mặc dù các phân lập chủ yếu giới hạn trong các chi Streptomyces và Bacillus,

một số nghiên cứu cho thấy sự đa dạng của vi khuẩn phân hủy lông lớn hơn đáng kể

(Lucas et al., 2003) Trong số các vi khuẩn Gram dương, chủng phân hủy lông đã được

phân lập và xác định như Arthrobacter sp (Lucas et al., 2003), Microbacterium sp

(Thys et al., 2004), và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006a) Hầu hết các chủng vi

khuẩn phân hủy keratin của lông trong vòng 48 giờ, điển hình như Microbacterium sp

kr10 Hoạt động của keratinase gần đây có liên quan đến vi khuẩn Gram âm (Bảng 1)

Chủng phân hủy lông của vi khuẩn Vibrio sp (Sangali và Brandelli, 2000),

Xantho-monas maltophilia (De Toni et al., 2002), StenotrophoXantho-monas sp (Yamamura et al.,

2002), và Chryseobacterium sp (Riffel và Brandelli, 2002) đã được phân lập từ lông

gà phân hủy Cuộc điều tra về sự đa dạng của vi khuẩn sản xuất keratinase khi phân

lập từ môi trường đất dưới khí hậu nhiệt độ cho thấy chủng Proteobacteria và nhóm

Cytophaga-Flavobacterium đang chiếm ưu thế (Lucas et al., 2003) Điều này phù hợp

với một nghiên cứu khác, nơi vi khuẩn phân hủy lông chủ yếu là vi khuẩn Gram âm

(Riffel và Brandelli, 2006) Vi khuẩn S fradiae làm suy giảm đáng kể cấu trúc hình

thái phức tạp của tóc và lông, dẫn đến giải phóng protein hòa tan trong quá trình lên

men (Hood và Healy, 1994) Shama và Berwick (1991) mô tả lông cừu đã gần như

hoàn toàn hòa tan bởi S fradiae

Bacillus cereus là trực khuẩn, Gram dương, có khả năng tạo nội bào tử Đây là

vi khuẩn hiếu khí và kị khí không bắt buộc Bacillus cereus K13 được phân lập từ

nguồn chất thải lông gia súc (Đinh Thị Bé Hiền, 2011) có hình dạng tế bào là dạng que ngắn, màu trắng đục Đặc điểm của khuẩn lạc có hình dạng không đều, bìa răng cưa,

độ lài, kích thước 2µm, Gram dương Kết quả nghiên cứu của Dương Trọng Tín

(2013) cho thấy, dòng vi khuẩn Bacillus cereus K13 có thời gian nuôi cấy tối ưu là 3

ngày Ở nhiệt độ 37oC và pH = 7,5 vi khuẩn có mật số và khả năng phân hủy bột lông gia cầm cao nhất so với các nghiệm thức còn lại

Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương, có bào tử Đây là vi khuẩn hiếu khí và kị khí không bắt buộc Bacillus megaterium VL2 được phân lập từ nguồn chất

thải lông gia cầm, có hình dạng tế bào là que dài, kích thước khuẩn lạc là dài 3,99 µm

và rộng 0,71 µm, Gram dương Kết quả nghiên cứu của Trần Hồng Thảo (2014) cho

thấy, dòng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 có thời gian nuôi cấy tối ưu là 3 ngày

Ở nhiệt độ 50oC và pH = 9 vi khuẩn có mật số và khả năng phân hủy bột lông gia cầm cao nhất so với các nghiệm thức còn lại

Hình 3 Cấu trúc của tóc (Villa et al., 2013)

Lớp ngoài cùng là biểu bì, chiếm 10% tổng trọng lượng của sợi tóc (Villa et al., 2013) Biểu bì gồm sáu đến tám lớp tế bào dẹt, mỏng, không màu, chồng chéo nhau từ gốc đến ngọn Mỗi lớp là loại β keratin dày khoảng 0,2 – 0,5 µm (Rodney Dawber,

1996) Các lớp biểu bì có chức năng bảo vệ phần vỏ của tóc, tránh các tác hại do các yếu tố như nhiệt, hóa chất,… gây ra Vỏ chiếm phần lớn khối lượng của sợi tóc và đóng vai trò quan trọng cho sức bền, sức căng và độ đàn hồi của sợi tóc Nó có đường kính khoảng 3 – 6 µm và dài khoảng 100 µm (Rodney Dawber, 1996) Vỏ được tạo thành từ các tế bào kéo dài, xếp chặt chẽ với nhau và có định hướng dọc theo trục song song với tóc Các tế bào này được gọi là các vi sợi (microfibril) Mỗi vi sợi là một hình trụ vững chắc có đường kính 0,1 – 0,4 µm và chiều dài thay đổi theo từng tế bào (Rodney Dawber, 1996) Các vi sợi chứa các α helix keratin nằm trong chất nền liên vi sợi (intermicrofibrillar matrix) và các hạt melanin Phần lõi của tóc là tủy Tủy bao gồm các tế bào chuyên biệt có chứa các khoang khí Cấu trúc của tóc rất ổn định và khó phân hủy thậm chí đến hàng ngàn năm sau khi chết

2.5 Sơ lƣợc về keratin thủy phân dƣỡng tóc

Keratin thủy phân là protein phục hồi hiệu quả trong quá trình chăm sóc tóc Những phân tử keratin nhỏ (phần đã thủy phân) là các oligopeptide có khối lượng phân tử < 1000 Dalton có thể xâm nhập vào vỏ của tóc Nó thẩm thấu vào trong tủy của tóc và khôi phục cấu trúc sâu bên trong của tóc Các keratin có kích thước lớn hơn bám dính trên bề mặt tóc và đóng vai trò như một chất keo, chất kết dính giúp bổ sung, hàn gắn và nối liền các đoạn tóc khô ráp, đứt gãy Keratin thủy phân là nguồn dinh dưỡng cần thiết để nuôi dưỡng và tạo thành một lớp màn bảo vệ tóc khỏi các tác nhân môi trường bên ngoài như nắng gắt, bụi bẩn,… Bên cạnh đó, nó còn được sử dụng để sửa chữa, điều trị và tái tạo cấu trúc hiệu quả cho những sợi tóc hư tổn, thiếu dinh dưỡng, khô xơ do uốn, nhuộm, duỗi,… nhiều lần

2.6 Một số nghiên cứu về keratin thủy phân

Keratin thủy phân từ lông cừu và lông gia cầm được nghiên cứu để nâng cao giá trị dinh dưỡng của rơm từ lúa mì làm thức ăn cho động vật nhai lại Kết quả của Abouheif et al (1985) cho thấy, keratin thủy phân từ lông cừu có hàm lượng các acid amin như glutamic acid, methionine, tyrosine, histidine và lysine cao gấp 1,5 – 4 lần

so với keratin thủy phân từ lông gia cầm Trong phòng thí nghiệm, khi bổ sung 8,5% keratin thủy phân, hàm lượng vật chất khô trong rơm lúa mì tăng tốt nhất và đạt thêm 21,1 – 23,7% so với rơm lúa mì chưa qua xử lý (44,72%)

Vi khuẩn Vibrio sp kr2 được Grazziotin et al (2007) sử dụng để sản xuất protein thủy phân từ lông gia cầm Sản lượng tối đa của protein hòa tan đạt được ở 30oC trong

5 ngày với pH = 6 – 8 Báo cáo này có ý nghĩa trong việc sử dụng keratin thủy phân như một thành phần trong thức ăn chăn nuôi, làm phân bón hữu cơ,…; do đó làm giảm

sự tác động xấu của chất thải lông từ ngành công nghiệp chế biến thịt gia súc, gia cầm đến môi trường

Hiệu quả mỹ phẩm khi sử dụng các peptide keratin thủy phân và chất béo có nguồn gốc từ lông cừu được Barba et al (2008) báo cáo có sự khác biệt đáng kể giữa các mẫu đối chứng và các mẫu được điều trị Sự gia tăng độ ẩm và độ đàn hồi là kết quả của ứng dụng peptide keratin Nó củng cố lớp bảo vệ bên ngoài và cải thiện khả năng giữ nước của da

Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng enzyme nhằm thu được keratin thủy phân có giá trị sinh học cao đã được thực hiện bởi Eremeev et al (2009) Protease kiềm từ Acremonium chrysogenium đã được chuẩn bị để tạo điều kiện thủy phân tối

ưu cho ra sản phẩm hòa tan có khối lượng dao động từ 3,55 – 3,60 kDa Bên cạnh đó, các sản phẩm thủy phân có khả năng chống oxy hóa cao, 100% hoạt tính sinh học và cân bằng thành phần acid amin

Freis et al (2010) sử dụng kính hiển vi huỳnh quang quét laser đồng tiêu để đánh giá sự xâm nhập của protein thủy phân vào tóc cho thấy số lượng cao protein được tìm thấy trong các lớp biểu bì Ngoài ra số lượng protein vẫn còn đáng kể đã được quan sát trong phần vỏ của tóc và sự thâm nhập này tăng lên khi thời gian ủ lâu hơn

Hoạt động keratinolytic của Bacillus subtilis AMR được Mazotto et al (2010) sử dụng trên tóc của con người cho thấy, B subtilis AMR đã sản xuất keratinase và

gelatinase có khả năng thủy phân tóc người để sản xuất peptidase serine và peptide keratin Đây là báo cáo đầu tiên mô tả việc sản xuất và một phần đặc tính của

keratinase bởi B subtilis phát triển trong một môi trường có chứa sợi tóc người

Những dữ liệu này cho thấy rằng các peptide thu được bởi enzyme thủy phân tóc có thể hữu ích cho các ứng dụng tương lai trên dược phẩm và công thức mỹ phẩm.

Nagal và Jain (2010) sử dụng vi khuẩn Elizabethkingia meningoseptica KB042 (MTCC 8360) trong quá trình lên men chìm để thủy phân lông gia cầm Sau 6 ngày nuôi cấy và ủ ở 37oC, pH = 10,02±0,1, 150 (vòng/phút), nồng độ acid amin được tìm thấy trong sản phẩm thủy phân là tối đa gồm các acid amin thiết yếu như valine, cysteine, leucine, tryptophan, threonine, và một lượng nhỏ methionine và arginine

Lông cừu được Mokrejs et al (2011) sử dụng để sản xuất keratin thủy phân thông qua hai giai đoạn Giai đoạn đầu, lông cừu được xử lý trong môi trường kiềm và sau đó, ở giai đoạn hai, lông cừu được thủy phân thông qua các hoạt động của enzyme thủy phân protein Các yếu tố được nghiên cứu là ảnh hưởng của thời gian giai đoạn thủy phân đầu tiên (6 – 24 giờ), thời gian thủy phân giai đoạn thứ hai (6 – 24 giờ) và

số lượng thêm vào enzyme phân giải protein (1 – 5%) trên số lượng của lông cừu bị phân hủy Hiệu suất keratin thủy phân đạt cao nhất khi thủy phân lông cừu trong 24 giờ ở cả hai giai đoạn và enzyme phân giải protein được thêm vào là 5%

Mokrejs et al (2011) đã nghiên cứu khả năng sản xuất keratin thủy phân từ lông gia cầm thông qua sự thủy phân của kiềm và enzyme ở hai giai đoạn Trong giai đoạn đầu, lông gia cầm được pha trộn với dung dịch KOH 0,1 – 0,3% theo tỉ lệ 1:50 và được ủ ở 70oC trong 24 giờ Ở giai đoạn hai, hỗn hợp được điều chỉnh pH = 9 và bổ sung enzyme phân giải protein từ 1 – 5% trong 4 – 8 giờ ở nhiệt độ 50 – 70oC Kết quả

là khi cho bột lông gia cầm pha trộn với KOH 0,3% ở giai đoạn đầu; và thủy phân trong 8 giờ ở 70oC với 5% enzyme (dựa theo khối lượng lông gia cầm) trong giai đoạn hai – thì hiệu suất phân hủy lông gia cầm đạt xấp xỉ 91%; đạt cao nhất so với các nghiệm thức còn lại

Sionkowska et al (2011) đã thực hiện một nghiên cứu về ảnh hưởng của tia UV lên keratin thủy phân Kết quả cho thấy rằng bức xạ tia cực tím có thể được sử dụng để phân hủy keratin tạo keratin thủy phân cho các ứng dụng mỹ phẩm.

Nghiên cứu của Fakhfakh et al (2013) báo cáo khả năng sản xuất và tối ưu hóa điều kiện sản xuất protein thủy phân từ lông cừu thông qua sự thủy phân của dòng vi

khuẩn Bacillus pumilus A1 Ở điều kiện pH = 10, nhiệt độ 45oC, lượng protein thủy phân đạt cao nhất trong ống nghiệm là 97% sau 2 ngày phân hủy Bên cạnh đó, khả năng chống oxy hóa của protein thủy phân từ lông cừu cũng được đánh giá bằng cách

sử dụng chất chống oxy hóa trong phòng thí nghiệm như picrylhydrazyl (DPPH), ion Fe(2+),… Kết quả cho thấy protein thủy phân từ lông cừu

1,1-diphenyl-2-sẽ là một nguồn protein và chất chống oxy hóa hữu ích trong khẩu phần ăn của động vật

Các hoạt động chống oxy hóa và chống tăng huyết áp của lông gia cầm thủy phân thu được từ dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp Kr6 đã được Fontoura et al (2014) tiến hành nghiên cứu Lượng protease tối đa thu được sau 48 giờ phân hủy với

những tác động không đáng kể của nồng độ lông gia cầm và các giá trị pH Các hoạt động chống oxy hóa và chống tăng huyết áp tối ưu đã được quan sát trong môi trường chứa 50g/l lông gia cầm với pH = 8 ở 30oC sau 48 giờ phân hủy Ngoài ra, lông gia cầm thủy phân còn được chứng minh có khả năng ngăn chặn 65% enzyme chuyển hóa angiotensin I và 44% dipeptidyl peptidase IV Lông gia cầm thủy phân có thể được ứng dụng như chất bổ sung trong thức ăn gia súc; và là một nguồn tiềm năng của các phân tử hoạt tính sinh học trong thức ăn chăn nuôi, thực phẩm và dược phẩm

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện

3.1.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Sử dụng các phương tiện nghiên cứu (các thiết bị, dụng cụ) có tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

- Tủ cấy vi sinh vật TELSTAR – Nhật Bản

- Tủ ủ vi sinh vật BINDER – Hoa Kỳ

- Nồi khử trùng nhiệt ướt PBI INTERNATIONAL – Ý

- Tủ sấy BINDER – Hoa Kỳ

- Máy khuấy từ IKA C-MAG HS7 – Đức

- Máy đo OD U-I500 – Nhật

- Máy chụp SEM JEOL – Nhật

- Một số dụng cụ khác như đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống đong, đèn cồn, kẹp ống nghiệm, que cấy, đầu cone (vàng, xanh, trắng), găng tay, khẩu trang y tế,

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm

Mẫu tóc: tóc được thu tại một số tiệm cắt tóc ở thành phố Cần Thơ

Mẫu keratin: các mẫu lông gia cầm, lông heo được thu tại một số cơ sở giết mổ

3.1.3 Hóa chất

* Môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân hủy keratin

a Môi trường đặc (Bo Xu et al., 2009): nuôi dưỡng và đánh giá sự phát triển của vi sinh vật phân hủy keratin

Bảng 2 Thành phần hóa chất trong môi trường đặc

c Môi trường tăng sinh khối (Sangali và Brandelli, 2000)

Bảng 4 Thành phần hóa chất trong môi trường tăng sinh khối

- NaCl, K2HPO4, KH2PO4, MgCl2.6H2O, NH4Cl, Agar, Yeast extract,…

- Dung dịch đệm 0,05 M Potassium Phosphate pH 7,5 (K2HPO4.2H2O, KH2PO4.H2O)

3.1.4 Địa điểm thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.5 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2014 đến hết tháng 11/2014

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thu mẫu và chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống

Mẫu tóc: thu 300 g mẫu tóc, cắt khoảng > 5cm, rửa sạch rồi để khô tự nhiên Bảo quản tóc ở nơi khô thoáng, tránh ánh nắng trực tiếp từ mặt trời và tránh những nơi ẩm ướt

Mẫu vi khuẩn: 2 chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 và Bacillus cereus

K13 được cấy chuyển sang môi trường đặc (môi trường agar) để sinh trưởng và phát triển (thành phần: NaCl 0,5 g/L, K2HPO4 0,3 g/L, KH2PO4 0,4 g/L, MgCl2.6H2O 0,1 g/L, bột lông gia cầm 10 g/L, NH4Cl 0,5 g/L, agar 15 g/L, pH 7,5) (Bo Xu et al., 2009)

3.2.2 Chuẩn bị cơ chất

Bột lông gia cầm thô (tỷ lệ lông gà – lông vịt là 1:1) được thu tại một số cơ sở giết mổ gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long, cắt bỏ phần da, thịt, rửa sạch, cắt các mẫu lông thành những mảnh nhỏ và sấy khô ở 80oC trong 48 giờ trong tủ sấy Sau đó, nghiền thành bột bằng máy nghiền lông

Bột lông heo: lông heo được thu tại một số cơ sở giết mổ heo tại tỉnh Vĩnh Long, cắt bỏ phần da, thịt, rửa sạch, sấy khô ở 80oC trong 48 giờ trong tủ sấy, sau đó cắt nhuyễn khoảng 1,5mm

Bột tóc: tóc được thu tại một số tiệm cắt tóc ở thành phố Cần Thơ, rửa sạch, sấy khô ở 80oC trong 48 giờ trong tủ sấy, sau đó cắt nhuyễn khoảng 1,5 mm

Các mẫu cơ chất được lưu trữ ở 4oC cho đến khi sử dụng

3.2.3 Điều chế keratin thủy phân từ vi khuẩn phân giải keratin

Mục đích

Khảo sát và sản xuất keratin thủy phân

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 2 nhân tố: 2 chủng vi

khuẩn (Bacillus megaterium VL2 và Bacillus cereus K13) với 3 loại cơ chất (bột lông

gia súc, bột lông gia cầm và bột tóc)

Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại

Tổng số nghiệm thức là 2 x 3 = 6 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 18 đơn vị thí nghiệm

Cách tiến hành

Tăng sinh khối: vi khuẩn được nuôi tăng sinh khối trong môi trường lỏng (thành phần: NaCl 0,5 g/L, K2HPO4 0,3 g/L, KH2PO4 0,4 g/L, MgCl2.6H2O 0,24 g/L, bột lông gia cầm 10 g/L, NH4Cl 0,5 g/L, pH 7,5) (Sangali và Brandelli, 2000) được ủ ở 30oC trên máy lắc (120 rpm) trong vòng 48 giờ

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: cho vào bình tam giác 50 mL môi trường lỏng (Bo Xu et al., 2009) (thành phần: NaCl 0,5 g/L, K2HPO4 0,3 g/L, KH2PO4 0,4 g/L, MgCl2.6H2O 0,1 g/L, bột (lông gia cầm hoặc lông heo hoặc tóc) 10 g/L, NH4Cl 0,5

g/L, pH=7,5 đối với K13 hoặc pH=9,0 đối với VL2), khử trùng ở 121oC, 20 phút, để nguội

* Đếm mật số vi khuẩn: vi khuẩn được đếm bằng phương pháp đếm sống (Hoben và

Somasegaran, 1982)

Phương pháp đếm sống:

- Mẫu được pha loãng ở độ pha loãng 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 lần

- Mỗi đĩa môi trường được phân làm 4 phần cho 4 mức độ pha loãng khác nhau)

- Mỗi độ pha loãng sẽ hút 3 giọt (mỗi giọt là 5 µL) nhỏ lên môi trường thạch

ở 3 điểm riêng biệt trên 1 phần đĩa Petri

- Ủ ở nhiệt độ 30oC, sau 24 giờ tiến hành đếm khuẩn lạc, tính mật số

Chọn mức pha loãng có khuẩn lạc rời tốt để đếm số khuẩn lạc, mỗi một khuẩn lạc này được hình thành từ một tế bào vi khuẩn, thông qua đếm số khuẩn lạc sẽ xác định được mật số vi khuẩn tương ứng với độ pha loãng, từ đó tính được mật số vi khuẩn trong mẫu ban đầu

Thu dịch lọc đem khử trùng ở 121oC để loại bỏ vi khuẩn trong dung dịch và bất hoạt lượng enzyme keratinase thô

Chỉ tiêu theo dõi: lượng cơ chất bị phân hủy bằng phương pháp tỷ lệ phần trăm,

hàm lượng protein thủy phân bằng phương pháp Bradford, định tính các acid amin chứa lưu huỳnh bằng phản ứng Folia

3.2.4 Điều chế keratin thủy phân bằng phương pháp sinh hóa

121oC để bất hoạt lượng enzyme proteinase bằng nhiệt

Chỉ tiêu theo dõi: lượng cơ chất bị phân hủy bằng phương pháp tỷ lệ phần trăm,

hàm lượng protein thủy phân bằng phương pháp Bradford, định tính các acid amin chứa lưu huỳnh bằng phản ứng Folia

3.2.5 Khảo sát khả năng hồi phục của tóc hư tổn khi bổ sung keratin thủy phân Mục đích

Khảo sát và so sánh khả năng hồi phục của các mẫu tóc sau khi được bổ sung keratin thủy phân

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 2 nhân tố: 5 loại tóc (tóc duỗi bị hư tổn, tóc nhuộm bị hư tổn, tóc uốn bị hư tổn, tóc bị cháy nắng và tóc bình thường) và 3 loại sản phẩm (keratin thủy phân thô thu được bằng phương pháp sinh hóa, keratin thủy phân thô thu được từ vi khuẩn phân giải keratin và keratin thủy phân thương mại)

Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại

Tổng số nghiệm thức là 5 x 3 = 15 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 45 đơn vị thí nghiệm

Cách tiến hành

* Xử lý tóc

Mẫu tóc thu về là loại tóc bình thường được chia thành năm phần bằng nhau và được xử lý thành năm mẫu tóc gồm tóc duỗi bị hư tổn, tóc nhuộm bị hư tổn, tóc uốn bị

hư tổn, tóc bị hư tổn do cháy nắng và tóc bình thường

- Tóc duỗi bị hư tổn: sử dụng thuốc duỗi Lavox 3 trong 1 để duỗi tóc Mẫu được duỗi 3 lần/tháng đến khi đạt đến mức độ hư tổn nhất định (tóc bị khô,

dễ gãy rụng, mất độ bóng, dễ bị rối và khó chải tóc, tóc bị đổi màu từ màu đen sang màu vàng cháy)

- Tóc nhuộm bị hư tổn: sử dụng thuốc nhuộm Berina A2 để nhuộm tóc màu đen Mẫu được nhuộm 5 – 6 lần/tháng đến khi đạt đến mức độ hư tổn nhất định (tóc bị khô, mất độ bóng, dễ bị rối và khó chải tóc, tóc không bị đổi màu vì thuốc nhuộm có màu đen)

- Tóc uốn bị hư tổn: sử dụng thuốc uốn Koriko để uốn tóc Mẫu được uốn 3 lần/tháng đến khi đạt đến mức độ hư tổn nhất định (tóc bị khô, chẻ ngọn, mất độ bóng, dễ bị rối và khó chải tóc, tóc bị đổi màu từ màu đen sang màu vàng cháy)

- Tóc bị hư tổn do cháy nắng: Mẫu được làm ướt rồi phơi nắng đến khi đạt đến mức độ hư tổn nhất định (tóc bị khô, chẻ ngọn, mất độ bóng, dễ bị rối

và khó chải tóc, tóc bị đổi màu từ màu đen sang màu vàng cháy)

* Bổ sung các sản phẩm cho tóc

Mỗi mẫu tóc chia thành ba mẫu nhỏ: 1 mẫu bổ sung keratin thủy phân thô thu được bằng phương pháp sinh hóa, 1 mẫu bổ sung keratin thủy phân thô thu được từ vi khuẩn phân giải keratin và 1 mẫu bổ sung keratin thủy phân thương mại

Cân khoảng 3 g tóc ở mỗi mẫu nhỏ để ngâm trong dung dịch keratin thủy phân Keratin thủy phân được bổ sung cho tóc trong 5 – 6 tuần

Chỉ tiêu theo dõi: độ bóng, màu sắc và độ mềm mượt của tóc bằng phương pháp đánh

giá cảm quan; độ ẩm của tóc bằng phương pháp đo độ ẩm và cấu trúc của tóc bằng phương pháp chụp SEM (Scanning Electron Microscope)

3.2.6 Chỉ tiêu theo dõi

* Xác định lượng cơ chất bị phân hủy bằng phương pháp tỷ lệ phần trăm (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010)

Cách tiến hành

Khả năng phân hủy lông của vi khuẩn được xác định bằng cách cân lượng bột lông khô còn lại trong môi trường sau khi đã lọc và sấy khô ở 80oC đến khối lượng không đổi để tính khối lượng bột lông đã bị tiêu hao trong quá trình nuôi cấy

Tỷ lệ phân hủy bột lông của vi khuẩn được tính theo công thức sau (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010):

A (%) = (mBĐ – mC) x 100 / mBĐTrong đó: A (%) là tỷ lệ bột lông bị phân hủy bởi vi khuẩn

mBĐ là khối lượng bột lông ban đầu

mC là khối lượng bột lông còn lại sau khi bị phân hủy

* Khảo sát hàm lượng protein thủy phân của các sản phẩm bằng phương pháp Bradford

Cách tiến hành

Chuẩn bị dung dịch Bradford:

Hòa tan 100 mg Coomassie Blue G250 trong 50 mL ethanol 95% Sau đó thêm

100 mL acid phosphoric 85%, khuấy đều Bổ sung nước cất cho đến 1 L, lọc qua giấy lọc Whatman no.1 và trữ trong chai tối ở nhiệt độ phòng Dung dịch sau khi pha có thể

sử dụng trong 2 tuần nhưng trong thời gian này chất màu có thể bị tủa nên khi sử dụng cần phải lọc lại

Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn: Cân 3 g BSA, hòa tan trong 1 mL nước cất và giữ ở -20°C Thu được dung dịch gốc BSA có nồng độ 3 mg/mL

Xây dựng đường chuẩn:

Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần 0 µg/mL, 30 µg/mL, 60 µg/mL, 120 µg/mL, 180 µg/mL, 240 µg/mL, 300 µg/mL

Chuẩn bị các ống eppendorf có đánh số thứ tự lần lượt từ 1 – 6 và 1 ống đối chứng, thêm vào các chất theo bảng 5:

Bảng 5 Xây dựng đường chuẩn Bradford

Nước cất (µL) 1000 970 940 880 820 760 700 Lấy 100 µl dung dịch từ các eppendorf trên cho vào các ống nghiệm được đánh

số tương tự Cho vào mỗi ống nghiệm 2 mL thuốc thử Lắc đều bằng máy vortex, tránh tạo bọt Sau 10 phút tiến hành đo OD ở bước sóng 595 nm Thí nghiệm tiến hành được lặp lại 3 lần

Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein với độ hấp thụ tại bước sóng 595 nm Xác định hàm lượng protein trong dung dịch:

Chuẩn bị các ống nghiệm có đánh số thứ tự lần lượt từ 1 – 3 và 1 ống đối chứng, thêm vào các ống các chất như sau:

Ống đối chứng: 100 µL nước cất + 2 mL thuốc thử Bradford

Các ống 1,2,3: 100 µL mẫu protein + 2 mL thuốc thử Bradford

Sau đó đem đo OD ở bước sóng 595 nm

Dựa vào phương trình đường chuẩn, ta suy ra được hàm lượng protein trong 1

mL dung dịch

Hàm lượng protein tổng trong dung dịch enyzme được xác định theo công thức:

P = p x V x k P: protein tổng trong mẫu (mg)

p: hàm lượng protein (mg/mL)

V: thể tích dịch chiết thô thu được

k: hệ số pha loãng (nếu có pha loãng)

* Định tính các acid amin chứa lưu huỳnh bằng phản ứng Folia (Nguyễn Quang Vinh et al., 2007)

Nguyên tắc

Các acid amin chứa lưu huỳnh như cystin, cysteine, methionine dưới tác dụng của kiềm bị phân hủy tạo thành natri sunfur (Na2S)

RSH + 2NaOH -> Na2S +ROH + H2O

Thêm chì acetat vào sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì sunfur (PbS)

Na2S +Pb(CH3COO)2 -> 2CH3COONa + PbS (kết tủa nâu đen)

Cách tiến hành

Cho vào ống nghiệm 1 mL dung dịch mẫu và 1 mL NaOH 10% Đun sôi trong 3 phút, lắc đều Thêm vài giọt Pb(CH3COO)2 1%

* Độ bóng, màu sắc, độ suông và mềm mƣợt của tóc: đánh giá cảm quan

Sử dụng phiếu đánh giá cảm quan, đánh giá bằng mắt và tay, số lượng ≥ 30 người Tiến hành thu phiếu và ghi nhận kết quả

Đánh giá cảm quan thông qua phiếu đánh giá cảm quan như sau:

* Độ ẩm của tóc – độ hydrate hóa:

Sau 5 – 6 tuần, thu số tóc, sử dụng cân sấy ẩm SARTORIUS – Đức để đo độ ẩm của tóc

PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN

Bạn cảm thấy mức độ suông và mềm mượt của mẫu khảo sát như thế nào:

Rất suông và mềm mượt (+) Ít suông và mềm mượt ( ) Khá suông và mềm mượt (-) Không suông và mềm mượt ( -)

Trân trọng cảm ơn!

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Điều chế keratin thủy phân từ vi khuẩn phân giải keratin

4.1.1 Khảo sát khả năng phân hủy cơ chất của vi khuẩn và hàm lượng protein hòa tan sinh ra

Khả năng phân hủy của vi sinh vật và hàm lượng protein hòa tan sinh ra rất quan trọng trong việc sử dụng và ứng dụng của vi sinh vật Mỗi loài vi sinh vật khác nhau

có khả năng phân hủy khác nhau ngay cả trên cùng một cơ chất Bên cạnh đó, mỗi loài

vi sinh vật sẽ phù hợp với một loại cơ chất riêng nên sự khác nhau của loại cơ chất cũng ảnh hưởng đến khả năng phân hủy của vi sinh vật và hàm lượng protein hòa tan sinh ra

Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại cơ chất là bột lông gia cầm, bột lông heo,

bột tóc và 2 dòng vi khuẩn là Bacillus megaterium VL2 và Bacillus cereus K13 trong

vòng 7 ngày ở nhiệt độ và pH tối ưu theo Trần Hồng Thảo (2014) và Dương Trọng Tín (2013) để 2 dòng vi khuẩn phân hủy cơ chất; từ đó chọn ra loại cơ chất và dòng vi khuẩn có khả năng thủy phân tốt nhất để tạo ra keratin thủy phân hay còn gọi là keratin hòa tan

Bảng 6 Khả năng phân hủy các loại cơ chất của 2 dòng vi khuẩn và hàm lượng protein hòa tan sinh ra sau 7 ngày nuôi cấy

Vi khuẩn Cơ chất Hiệu suất phân hủy

(%)

Hàm lượng protein hòa tan (mg)

VL2 T 24.80d 57.660d

Hiệu suất phân hủy (%): P-value: 0.000; %CV: 7.558

Hàm lượng protein hòa tan (mg): P-value: 0.000; %CV: 10.195

Ghi chú: các giá trị thể hiện trên bảng là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị mang chữ số giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%

Ghi chú: ĐC K13: mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn K13, có nhiệt độ 37 o C và pH=7,5 tối ưu cho dòng vi khuẩn K13 hoạt động; ĐC VL2: mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn VL2, có nhiệt độ 50oC và pH=9 tối ưu cho dòng vi khuẩn VL2 hoạt động

Từ kết quả bảng 6 cho thấy có sự biến động giữa các nghiệm thức về khả năng phân hủy cơ chất của vi khuẩn; đồng thời thấy được mối liên hệ giữa khả năng phân hủy cơ chất và hàm lượng protein hòa tan sinh ra So sánh giữa 2 dòng vi khuẩn và giữa vi khuẩn với đối chứng, kết quả từ bảng 6 cho thấy khả năng phân hủy cơ chất có

sự khác nhau rõ rệt; đồng thời, hàm lượng protein hòa tan sinh ra cũng khác nhau Kết quả phân tích thống kê số liệu ở phụ lục 3 cho thấy sự khác nhau về khả năng phân hủy và hàm lượng protein hòa tan giữa 2 dòng vi khuẩn và giữa vi khuẩn với đối chứng là có ý nghĩa thống kê ở mức 5% Khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn VL2 khác biệt có ý nghĩa so với dòng K13 và 2 nghiệm thức đối chứng Dòng vi khuẩn VL2 có khả năng phân hủy trung bình đạt cao nhất (51,00%) và thấp nhất là đối chứng ĐC K13 (1,85%) Như vậy, khi không có vi khuẩn, ở điều kiện nhiệt độ 37oC

và pH = 7,5 cơ chất có thể bị phân hủy với số lượng rất ít Tương tự, hàm lượng protein hòa tan từ sản phẩm phân hủy bột lông bởi vi khuẩn VL2 trung bình đạt cao nhất (84,809 mg), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với K13 và 2 đối chứng, thấp nhất là đối chứng ĐC K13 (4,816 mg)

Bên cạnh đó còn có thể thấy được sự thay đổi về khả năng phân hủy cơ chất và hàm lượng protein hòa tan sinh ra giữa 3 loại cơ chất khác nhau

Kết quả phân tích thống kê số liệu ở phụ lục 3 cho thấy sự khác nhau về khả năng

bị phân hủy và hàm lượng protein hòa tan sinh ra giữa 3 loại cơ chất là có ý nghĩa Khả năng bị phân hủy của bột lông gia cầm khác biệt có ý nghĩa so với bột lông heo và bột tóc; và có khả năng bị phân hủy trung bình đạt cao nhất (34,00%); tương ứng với hàm lượng protein hòa tan trung bình cao nhất (54,603 mg) Bột tóc là cơ chất có khả năng

bị phân hủy trung bình đạt thấp nhất (12,75%); khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với 2 loại cơ chất còn lại; với hàm lượng protein hòa tan trung bình thấp nhất (29,926 mg) Có thể do cấu trúc của tóc có chứa α – keratin (Akhtar, Edwards, 1997), khá phức tạp nên khó bị phân hủy bởi vi khuẩn hơn so với cấu trúc của lông heo và cấu trúc β – keratin của lông gia cầm Bên cạnh đó, tóc có thể là cơ chất không thích hợp cho 2 dòng vi khuẩn VL2 và K13 phát triển mạnh

Kết quả phân tích thống kê ở phụ lục 3 còn cho thấy sự tương tác giữa 2 nhân tố

vi khuẩn và cơ chất ảnh hưởng đến khả năng phân hủy cơ chất và hàm lượng protein hòa tan sinh ra

T LH

kê so với các nghiệm thức còn lại Vi khuẩn VL2 có khả năng phân hủy bột lông gia cầm cao nhất, trong khi vi khuẩn K13 có khả năng phân hủy bột lông heo cao nhất Sự khác biệt này có thể là do dòng vi khuẩn VL2 có nguồn gốc được phân lập từ lông gia cầm nên kết quả phân hủy lông gia cầm cao hơn so với lông heo Dòng vi khuẩn K13 được phân lập từ lông gia súc nên thích hợp để phân hủy lông heo; vì vậy khả năng

phân hủy lông gia cầm của K13 thấp hơn so với VL2 Cả hai dòng vi khuẩn VL2 và K13 đều có tỉ lệ phân hủy bột tóc rất thấp, lần lượt là 24,80% và 23,31%; khác biệt không có ý nghĩa so với nhau, nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với những nghiệm thức còn lại Tất cả các nghiệm thức đối chứng đều khác biệt không có ý nghĩa với nhau

T LH

4.1.2 Định tính các acid amin chứa lưu huỳnh trong keratin thủy phân thô từ vi khuẩn phân giải keratin

Hình 6 Dung dịch keratin thủy phân từ vi khuẩn trước và sau phản ứng Folia

(a,b: dung dịch trước và sau phản ứng; T1, T2, T3, T4: lần lượt là từ cơ chất bột tóc do đối chứng ĐC K13, đối chứng ĐC VL2, K13 phân hủy, VL2 phân hủy; G1, G2, G3, G4: lần lượt là từ bột lông gia cầm

do đối chứng ĐC K13, đối chứng ĐC VL2, K13 phân hủy, VL2 phân hủy; H1, H2, H3, H4: lần lượt là từ bột lông heo do đối chứng ĐC K13, đối chứng ĐC VL2, K13 phân hủy, VL2 phân hủy)

Phản ứng Folia là phản ứng sử dụng hai hóa chất là dung dịch NaOH 10% và dung dịch Pb(CH3COO)2 1% để nhận biết các acid amin có chứa gốc lưu huỳnh trong

H3a H2a

G3b G3a

G2b G2a

G1b G1 a

H1a

T4b T4a

G4b G4a