Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2014 đến hết tháng 11/2014.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Thu mẫu và chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống
Mẫu tóc: thu 300 g mẫu tóc, cắt khoảng > 5cm, rửa sạch rồi để khô tự nhiên. Bảo quản tóc ở nơi khô thoáng, tránh ánh nắng trực tiếp từ mặt trời và tránh những nơi ẩm ướt.
Mẫu vi khuẩn: 2 chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 và Bacillus cereus
K13 được cấy chuyển sang môi trường đặc (môi trường agar) để sinh trưởng và phát triển (thành phần: NaCl 0,5 g/L, K2HPO4 0,3 g/L, KH2PO4 0,4 g/L, MgCl2.6H2O 0,1 g/L, bột lông gia cầm 10 g/L, NH4Cl 0,5 g/L, agar 15 g/L, pH 7,5) (Bo Xu et al., 2009)
3.2.2. Chuẩn bị cơ chất
Bột lông gia cầm thô (tỷ lệ lông gà – lông vịt là 1:1) được thu tại một số cơ sở giết mổ gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long, cắt bỏ phần da, thịt, rửa sạch, cắt các mẫu lông thành những mảnh nhỏ và sấy khô ở 80oC trong 48 giờ trong tủ sấy. Sau đó, nghiền thành bột bằng máy nghiền lông.
Bột lông heo: lông heo được thu tại một số cơ sở giết mổ heo tại tỉnh Vĩnh Long, cắt bỏ phần da, thịt, rửa sạch, sấy khô ở 80oC trong 48 giờ trong tủ sấy, sau đó cắt nhuyễn khoảng 1,5mm.
Bột tóc: tóc được thu tại một số tiệm cắt tóc ở thành phố Cần Thơ, rửa sạch, sấy khô ở 80oC trong 48 giờ trong tủ sấy, sau đó cắt nhuyễn khoảng 1,5 mm.
Các mẫu cơ chất được lưu trữ ở 4oC cho đến khi sử dụng
3.2.3. Điều chế keratin thủy phân từ vi khuẩn phân giải keratin Mục đích Mục đích
Khảo sát và sản xuất keratin thủy phân.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 2 nhân tố: 2 chủng vi khuẩn (Bacillus megaterium VL2 và Bacillus cereus K13) với 3 loại cơ chất (bột lông gia súc, bột lông gia cầm và bột tóc).
Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại.
Tổng số nghiệm thức là 2 x 3 = 6 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 18 đơn vị thí nghiệm.
Cách tiến hành
Tăng sinh khối: vi khuẩn được nuôi tăng sinh khối trong môi trường lỏng (thành phần: NaCl 0,5 g/L, K2HPO4 0,3 g/L, KH2PO4 0,4 g/L, MgCl2.6H2O 0,24 g/L, bột lông gia cầm 10 g/L, NH4Cl 0,5 g/L, pH 7,5) (Sangali và Brandelli, 2000) được ủ ở 30oC trên máy lắc (120 rpm) trong vòng 48 giờ.
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: cho vào bình tam giác 50 mL môi trường lỏng (Bo Xu et al., 2009) (thành phần: NaCl 0,5 g/L, K2HPO4 0,3 g/L, KH2PO4 0,4 g/L, MgCl2.6H2O 0,1 g/L, bột (lông gia cầm hoặc lông heo hoặc tóc) 10 g/L, NH4Cl 0,5
g/L, pH=7,5 đối với K13 hoặc pH=9,0 đối với VL2), khử trùng ở 121oC, 20 phút, để nguội.
* Đếm mật số vi khuẩn: vi khuẩn được đếm bằng phương pháp đếm sống (Hoben và
Somasegaran, 1982) Phương pháp đếm sống:
- Mẫu được pha loãng ở độ pha loãng 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 lần.
- Mỗi đĩa môi trường được phân làm 4 phần cho 4 mức độ pha loãng khác nhau).
- Mỗi độ pha loãng sẽ hút 3 giọt (mỗi giọt là 5 µL) nhỏ lên môi trường thạch ở 3 điểm riêng biệt trên 1 phần đĩa Petri.
- Ủ ở nhiệt độ 30oC, sau 24 giờ tiến hành đếm khuẩn lạc, tính mật số.
Chọn mức pha loãng có khuẩn lạc rời tốt để đếm số khuẩn lạc, mỗi một khuẩn lạc này được hình thành từ một tế bào vi khuẩn, thông qua đếm số khuẩn lạc sẽ xác định được mật số vi khuẩn tương ứng với độ pha loãng, từ đó tính được mật số vi khuẩn trong mẫu ban đầu.
Công thức tính mật số vi khuẩn:
Số tế bào/mL = A x 200 x B
- A: số khuẩn lạc đếm được trung bình của 3 giọt (số khuẩn lạc/5 µL) - B: mức độ pha loãng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- 200: hệ số chuyển từ 5 µL đến 1 mL
Cấy vi khuẩn phân hủy keratin: Chủng 1 mL dung dịch vi khuẩn đã nuôi tăng sinh khối sau 48 giờ vào các bình tam giác, đậy nút gòn. Ủ lắc ở 120 vòng/phút ở 37oC đối với K13 và ở 50oC đối với VL2 trong 7 ngày. Thu số lông còn lại bằng cách lọc bằng giấy lọc.
Thu dịch lọc đem khử trùng ở 121oC để loại bỏ vi khuẩn trong dung dịch và bất hoạt lượng enzyme keratinase thô.
Chỉ tiêu theo dõi: lượng cơ chất bị phân hủy bằng phương pháp tỷ lệ phần trăm,
hàm lượng protein thủy phân bằng phương pháp Bradford, định tính các acid amin chứa lưu huỳnh bằng phản ứng Folia
3.2.4. Điều chế keratin thủy phân bằng phƣơng pháp sinh hóa. Mục đích
Khảo sát và sản xuất keratin thủy phân.
Cách tiến hành
Dựa vào kết quả của nội dung 1 để sử dụng loại cơ chất có khả năng bị thủy phân tốt nhất.
Cho vào bình tam giác 10 g bột lông, 0,75 g Ca(OH)2 và 150 mL nước cất. Đun nóng và khuấy hỗn hợp ở 80oC trong 6 giờ. Sau đó, bình được đóng kín và ủ tĩnh ở 80oC trong 18 giờ.
Bình được làm lạnh ở 55oC, điều chỉnh pH tới 6,5 bằng dung dịch HCl 5%. Thêm enzyme proteinase 5% (tương ứng 0,5 g) vào hỗn hợp. Đun nóng và khuấy hỗn hợp ở 55oC trong 6 giờ. Sau đó, bình được đóng kín và ủ tĩnh ở 55oC trong 18 giờ.
Thu số lông còn lại bằng cách lọc bằng giấy lọc. Thu dịch lọc đem khử trùng ở 121oC để bất hoạt lượng enzyme proteinase bằng nhiệt.
Chỉ tiêu theo dõi: lượng cơ chất bị phân hủy bằng phương pháp tỷ lệ phần trăm,
hàm lượng protein thủy phân bằng phương pháp Bradford, định tính các acid amin chứa lưu huỳnh bằng phản ứng Folia
3.2.5. Khảo sát khả năng hồi phục của tóc hƣ tổn khi bổ sung keratin thủy phân Mục đích
Khảo sát và so sánh khả năng hồi phục của các mẫu tóc sau khi được bổ sung keratin thủy phân
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 2 nhân tố: 5 loại tóc (tóc duỗi bị hư tổn, tóc nhuộm bị hư tổn, tóc uốn bị hư tổn, tóc bị cháy nắng và tóc bình thường) và 3 loại sản phẩm (keratin thủy phân thô thu được bằng phương pháp sinh hóa, keratin thủy phân thô thu được từ vi khuẩn phân giải keratin và keratin thủy phân thương mại).
Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại.
Tổng số nghiệm thức là 5 x 3 = 15 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 45 đơn vị thí nghiệm.
Cách tiến hành * Xử lý tóc
Mẫu tóc thu về là loại tóc bình thường được chia thành năm phần bằng nhau và được xử lý thành năm mẫu tóc gồm tóc duỗi bị hư tổn, tóc nhuộm bị hư tổn, tóc uốn bị hư tổn, tóc bị hư tổn do cháy nắng và tóc bình thường.
- Tóc duỗi bị hư tổn: sử dụng thuốc duỗi Lavox 3 trong 1 để duỗi tóc. Mẫu được duỗi 3 lần/tháng đến khi đạt đến mức độ hư tổn nhất định (tóc bị khô, dễ gãy rụng, mất độ bóng, dễ bị rối và khó chải tóc, tóc bị đổi màu từ màu đen sang màu vàng cháy).
- Tóc nhuộm bị hư tổn: sử dụng thuốc nhuộm Berina A2 để nhuộm tóc màu đen. Mẫu được nhuộm 5 – 6 lần/tháng đến khi đạt đến mức độ hư tổn nhất định (tóc bị khô, mất độ bóng, dễ bị rối và khó chải tóc, tóc không bị đổi màu vì thuốc nhuộm có màu đen)
- Tóc uốn bị hư tổn: sử dụng thuốc uốn Koriko để uốn tóc. Mẫu được uốn 3 lần/tháng đến khi đạt đến mức độ hư tổn nhất định (tóc bị khô, chẻ ngọn, mất độ bóng, dễ bị rối và khó chải tóc, tóc bị đổi màu từ màu đen sang màu vàng cháy).
- Tóc bị hư tổn do cháy nắng: Mẫu được làm ướt rồi phơi nắng đến khi đạt đến mức độ hư tổn nhất định (tóc bị khô, chẻ ngọn, mất độ bóng, dễ bị rối và khó chải tóc, tóc bị đổi màu từ màu đen sang màu vàng cháy).
* Bổ sung các sản phẩm cho tóc
Mỗi mẫu tóc chia thành ba mẫu nhỏ: 1 mẫu bổ sung keratin thủy phân thô thu được bằng phương pháp sinh hóa, 1 mẫu bổ sung keratin thủy phân thô thu được từ vi khuẩn phân giải keratin và 1 mẫu bổ sung keratin thủy phân thương mại.
Cân khoảng 3 g tóc ở mỗi mẫu nhỏ để ngâm trong dung dịch keratin thủy phân. Keratin thủy phân được bổ sung cho tóc trong 5 – 6 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi: độ bóng, màu sắc và độ mềm mượt của tóc bằng phương pháp đánh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
giá cảm quan; độ ẩm của tóc bằng phương pháp đo độ ẩm và cấu trúc của tóc bằng phương pháp chụp SEM (Scanning Electron Microscope).
3.2.6. Chỉ tiêu theo dõi
* Xác định lƣợng cơ chất bị phân hủy bằng phƣơng pháp tỷ lệ phần trăm (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010)
Cách tiến hành
Khả năng phân hủy lông của vi khuẩn được xác định bằng cách cân lượng bột lông khô còn lại trong môi trường sau khi đã lọc và sấy khô ở 80oC đến khối lượng không đổi để tính khối lượng bột lông đã bị tiêu hao trong quá trình nuôi cấy.
Tỷ lệ phân hủy bột lông của vi khuẩn được tính theo công thức sau (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010):
A (%) = (mBĐ – mC) x 100 / mBĐ
Trong đó: A (%) là tỷ lệ bột lông bị phân hủy bởi vi khuẩn mBĐ là khối lượng bột lông ban đầu
mC là khối lượng bột lông còn lại sau khi bị phân hủy
* Khảo sát hàm lƣợng protein thủy phân của các sản phẩm bằng phƣơng pháp Bradford.
Cách tiến hành
Chuẩn bị dung dịch Bradford:
Hòa tan 100 mg Coomassie Blue G250 trong 50 mL ethanol 95%. Sau đó thêm 100 mL acid phosphoric 85%, khuấy đều. Bổ sung nước cất cho đến 1 L, lọc qua giấy lọc Whatman no.1 và trữ trong chai tối ở nhiệt độ phòng. Dung dịch sau khi pha có thể sử dụng trong 2 tuần nhưng trong thời gian này chất màu có thể bị tủa nên khi sử dụng cần phải lọc lại.
Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn: Cân 3 g BSA, hòa tan trong 1 mL nước cất và giữ ở -20°C. Thu được dung dịch gốc BSA có nồng độ 3 mg/mL.
Xây dựng đường chuẩn:
Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần 0 µg/mL, 30 µg/mL, 60 µg/mL, 120 µg/mL, 180 µg/mL, 240 µg/mL, 300 µg/mL.
Chuẩn bị các ống eppendorf có đánh số thứ tự lần lượt từ 1 – 6 và 1 ống đối chứng, thêm vào các chất theo bảng 5:
Bảng 5. Xây dựng đƣờng chuẩn Bradford.
Eppendorf Đối chứng 1 2 3 4 5 6
BSA (µL) 0 30 60 120 180 240 300
Nước cất (µL) 1000 970 940 880 820 760 700 Lấy 100 µl dung dịch từ các eppendorf trên cho vào các ống nghiệm được đánh số tương tự. Cho vào mỗi ống nghiệm 2 mL thuốc thử. Lắc đều bằng máy vortex, tránh tạo bọt. Sau 10 phút tiến hành đo OD ở bước sóng 595 nm. Thí nghiệm tiến hành được lặp lại 3 lần.
Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein với độ hấp thụ tại bước sóng 595 nm. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch:
Chuẩn bị các ống nghiệm có đánh số thứ tự lần lượt từ 1 – 3 và 1 ống đối chứng, thêm vào các ống các chất như sau:
Ống đối chứng: 100 µL nước cất + 2 mL thuốc thử Bradford. Các ống 1,2,3: 100 µL mẫu protein + 2 mL thuốc thử Bradford. Sau đó đem đo OD ở bước sóng 595 nm.
Dựa vào phương trình đường chuẩn, ta suy ra được hàm lượng protein trong 1 mL dung dịch.
Hàm lượng protein tổng trong dung dịch enyzme được xác định theo công thức: P = p x V x k
P: protein tổng trong mẫu (mg) p: hàm lượng protein (mg/mL) V: thể tích dịch chiết thô thu được. k: hệ số pha loãng (nếu có pha loãng).
* Định tính các acid amin chứa lƣu huỳnh bằng phản ứng Folia (Nguyễn Quang Vinh et al., 2007)
Nguyên tắc
Các acid amin chứa lưu huỳnh như cystin, cysteine, methionine dưới tác dụng của kiềm bị phân hủy tạo thành natri sunfur (Na2S) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thêm chì acetat vào sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì sunfur (PbS) Na2S +Pb(CH3COO)2 -> 2CH3COONa + PbS (kết tủa nâu đen)
Cách tiến hành
Cho vào ống nghiệm 1 mL dung dịch mẫu và 1 mL NaOH 10%. Đun sôi trong 3 phút, lắc đều. Thêm vài giọt Pb(CH3COO)2 1%
* Độ bóng, màu sắc, độ suông và mềm mƣợt của tóc: đánh giá cảm quan.
Sử dụng phiếu đánh giá cảm quan, đánh giá bằng mắt và tay, số lượng ≥ 30 người. Tiến hành thu phiếu và ghi nhận kết quả
Đánh giá cảm quan thông qua phiếu đánh giá cảm quan như sau:
* Độ ẩm của tóc – độ hydrate hóa:
Sau 5 – 6 tuần, thu số tóc, sử dụng cân sấy ẩm SARTORIUS – Đức để đo độ ẩm của tóc
PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN
Họ và tên: Nam/nữ:
Câu hỏi:
Bạn cảm thấy mức độ bóng của mẫu khảo sát như thế nào:
Rất bóng (+) Ít bóng (--)
Khá bóng (-) Không bóng (---)
Bạn cảm thấy mức độ màu sắc của mẫu khảo sát như thế nào:
Rất đen (+) Hơi vàng (--)
Khá đen (-) Vàng cháy (---)
Bạn cảm thấy mức độ suông và mềm mượt của mẫu khảo sát như thế nào:
Rất suông và mềm mượt (+) Ít suông và mềm mượt (--) Khá suông và mềm mượt (-) Không suông và mềm mượt (---)
* Cấu trúc của tóc:
Kiểm tra cấu trúc của tóc bằng cách chụp SEM (Scanning Electron Microscope). Kiểm tra cuối thời gian khảo sát.
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm được trình bày dưới dạng bảng và hình, kết quả được xử lý và phân tích bằng phần mềm minitab 16.0 và Excel 2010.
CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Điều chế keratin thủy phân từ vi khuẩn phân giải keratin
4.1.1. Khảo sát khả năng phân hủy cơ chất của vi khuẩn và hàm lƣợng protein hòa tan sinh ra.
Khả năng phân hủy của vi sinh vật và hàm lượng protein hòa tan sinh ra rất quan trọng trong việc sử dụng và ứng dụng của vi sinh vật. Mỗi loài vi sinh vật khác nhau có khả năng phân hủy khác nhau ngay cả trên cùng một cơ chất. Bên cạnh đó, mỗi loài vi sinh vật sẽ phù hợp với một loại cơ chất riêng nên sự khác nhau của loại cơ chất cũng ảnh hưởng đến khả năng phân hủy của vi sinh vật và hàm lượng protein hòa tan sinh ra.
Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại cơ chất là bột lông gia cầm, bột lông heo, bột tóc và 2 dòng vi khuẩn là Bacillus megaterium VL2 và Bacillus cereus K13 trong vòng 7 ngày ở nhiệt độ và pH tối ưu theo Trần Hồng Thảo (2014) và Dương Trọng Tín (2013) để 2 dòng vi khuẩn phân hủy cơ chất; từ đó chọn ra loại cơ chất và dòng vi khuẩn có khả năng thủy phân tốt nhất để tạo ra keratin thủy phân hay còn gọi là keratin hòa tan.
Bảng 6. Khả năng phân hủy các loại cơ chất của 2 dòng vi khuẩn và hàm lƣợng protein hòa tan sinh ra sau 7 ngày nuôi cấy.
Vi khuẩn Cơ chất Hiệu suất phân hủy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(%) Hàm lƣợng protein hòa tan (mg) ĐC K13 T 1.36e 4.263e ĐC K13 LH 2.20e 5.338e ĐC K13 LG 1.99e 4.848e ĐC VL2 T 1.51e 4.482e ĐC VL2 LH 3.35e 7.204e ĐC VL2 LG 2.69e 7.006e K13 T 23.31d 53.299d K13 LH 64.68b 99.228ab K13 LG 59.48bc 94.155bc
VL2 T 24.80d 57.660d
VL2 LH 56.35c 84.363c
VL2 LG 71.85a 112.404a
Hiệu suất phân hủy (%): P-value: 0.000; %CV: 7.558
Hàm lượng protein hòa tan (mg): P-value: 0.000; %CV: 10.195
Ghi chú: các giá trị thể hiện trên bảng là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị mang chữ số giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%
Ghi chú: ĐC K13: mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn K13, có nhiệt độ 37oC và pH=7,5 tối ưu cho dòng vi khuẩn K13 hoạt động; ĐC VL2: mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn VL2, có nhiệt độ 50oC và pH=9 tối ưu cho dòng vi khuẩn VL2 hoạt động
Từ kết quả bảng 6 cho thấy có sự biến động giữa các nghiệm thức về khả năng phân hủy cơ chất của vi khuẩn; đồng thời thấy được mối liên hệ giữa khả năng phân hủy cơ chất và hàm lượng protein hòa tan sinh ra. So sánh giữa 2 dòng vi khuẩn và giữa vi khuẩn với đối chứng, kết quả từ bảng 6 cho thấy khả năng phân hủy cơ chất có sự khác nhau rõ rệt; đồng thời, hàm lượng protein hòa tan sinh ra cũng khác nhau.
Kết quả phân tích thống kê số liệu ở phụ lục 3 cho thấy sự khác nhau về khả năng