Nghiên cứu diễn thế sinh thái và đặc điểm sinh học của vi sinh vật tham gia quá trình chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ■ * • TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2PHẠM THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU DIỄN THẾ SINH THÁI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT THAM GIA QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA RƠM RẠ TH

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ■ * • TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2

PHẠM THỊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU DIỄN THẾ SINH THÁI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT THAM GIA QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA RƠM RẠ THÀNH

MÙN HỮU cơ

Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC Sĩ SINH HỌC

Ngưòi hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Thúy

HÀ NỘI, 2014LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, chỉ bảo và đóng góp ý kiến quý báu từ các thầy cô giáo, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp.

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Thúy, người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và đồng hành giúp đỡ em trong suốt quá ữình học tập và nghiên cứu đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, trường Đại học Sư phạm Hà Nội Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy, cô giáo trong Bộ môn Vi sinh, khoa Sinh học - Kĩ thuật nông nghiệp, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và Bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã quan tâm, tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thảnh đề tài này.

Em xin cảm ơn tất cả các anh, chị và các bạn đang nghiên cứu, học tập tại phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh, khoa Sinh học - Kĩ thuật nông nghiệp, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và Bộ môn Công nghệ Sinh học - Yi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã giúp đỡ và

có ý kiến đóng góp cho em trong thời gian qua.

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn và yêu thương tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài.

Trong quá trình thực hiện không thể tránh khỏi những thiếu sót, em kính mong thầy

cô giáo và các bạn đóng góp ý kiến để đề tài được hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2014 Học viên

Phạm Thị Thanh Nhàn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này làtrung thực và không tiling lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằngmọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tintrích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

LỜI CAM ĐOAN

MỤCLỤC

DANH CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Đối tượng nghiên cứu 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu 3

5 Những đóng góp của đề tài 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về rơm rạ 4 1.1.1 Phụ phẩm rơm rạ trong sản xuất lúa gạo 4

1.1.2 Hiện trạng sử dụng rơm rạ trên thế giói và ở Việt Nam 10

1.2 Tổng quan về vi sinh vật có khả năng phân giải rom rạ 13 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 18

2.1 Vật liệu 18 2.1.1 Vi sinh vật 18

2.1.2 Môi trường nghiên cứu và hóa chất 18

2.1.3 Thuốc thử 19

2.1.4 Thiết bị 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Lấy mẫu 19

2.2.2 Phương pháp vi sinh vật 19

2.2.3 Phương pháp xác định độ ẩm tuyệt đối của rơm rạ 28

2.2.4 Phương pháp toán học thống kê và xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Diễn thế sinh thái của vi sinh vật trong quá trình mùn hóa tự nhiên

của rơm rạ 29

3.1.1 Đặc điểm trạng thái của rơm rạ trong quá trình mùn hóa 29

3.1.2 Sự thay đổi nhiêt độ của các khối ủ mùa hè và mùa đông 34

3.1.3 Sự giảm khối lượng của các khối ủ mùa hè và mùa đông 36

3.2 Vi sinh vật đất phân lập được từ quá trình mùn hóa tự nhiên của rơm rạ 39

3.3 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đất có hoạt tính enzyme ngoại bào phân giải lignin, cellulose và hemicelluloses 42

3.4 Mô tả một số đặc điểm sinh học của 05 chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme ngoại bào điển hình 44

3.4.1 Hình thái khuẩn lạc và hiển vi của ba chủng vi khuẩn điển hình 45

3.4.2 Hình thái khuẩn lạc và hiển vi của hai chủng xạ khuẩn điển hình 49

3.4.3 Nghiên cứu tính đối kháng của các chủng vsv tuyển chọn 51

3.5 Đánh giá khả năng phân giải rơm rạ của một số chủng vi sinh vật tuyển chọn 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI

LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH CÁC TỪ VIẾT TẤT

1 BG : Bột giấy

2 CMC : Cacboxyl Methyl Cellulose

3 dd : dung dịch

4 g : gram

5 KL : khuẩn lạc

6 NM : Nấm mốc

7 RBBR : Remazol Brilliant Blue R

8 YK : Vi khuẩn

9 YSV : Vi sinh vật

10 XK : xạ khuẩn

DANH MỤC BẢNG

•

Bảng 2 1 Môi trường phân lập và nuôi cấy vsv 18

Bảng 2 2 Thành phần môi trường thử hoạt tính enzyme ngoại bào 18

Bảng 2 3 Các khối ủ và tỉ lệ thảnh phàn phối trộn trong khối ủ 20

Bảng 2 4 Vi sinh vật bổ sung vào cơ chất rơm rạ 27

Bảng 3 1 Sự thay đổi trạng thái rơm rạ trong các khối ủ vào mùa hè 30

Bảng 3 2 Sự thay đổi trạng thái rơm rạ trong các khối ủ vào mùa đông 32

Bảng 3 3 Sự thay đổi độ mủn của rơm rạ trong các khối ủ 34

Bảng 3 4 Vi sinh vật phân lập được trong 5 đợt phân lập các mẫu của khối ủ mùa hè (Ui và u2) 40

Bảng 3 5 Vi sinh vật phân lập được trong 5 đợt phân lập các mẫu của khối ủ mùa đông (Đi và Đ2) 40

Bảng 3 6 Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng vi sinh vật phân lập được từ các khối ủ 42

Bảng 3 7 Hoạt tính của 05 chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme ngoại bào mạnh nhất 43

Bảng 3 8 Một số đặc điểm hình thái của 3 chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại bào mạnh 45

Bảng 3 9 Một số đặc điểm hình thái của 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại bào mạnh 49

Bảng 3.10 Thành phần с và N trong rơm rạ khô (%) 54

DANH MỤC HÌNH • Hình 1.1 Sản lượng và diện tích gieo trồng lúa thế giói 4

Hình1 2 Cấu trúc lập thể của cellulose 6

Hình1.3 Cấu trúc của hemicelluloses 8

Hình1 4 Các đơn vị cơ bản của lignin 9

Hình1 5 Cấu trúc lignin 10

Hình 3.1 Rơm rạ được ủ trong thùng xốp 29

Hình 3 2 Biến thiên nhiệt độ của khối ủ Ui và Ư2 35

Hình 3.3 Biến thiên nhiệt độ của khối ủ Đi và Đ2 36

Hình 3 4 Biến thiên khối lượng của khối ủ Ui và Ư2 ttong 10 tuần 37

Hình 3.5 Biến thiên khối lượng của khối ủ Đi và Đ2 trong 10 tuần 37

Hình 3 6 Các khuẩn lạc vi sinh vật trên đĩa Petri phân lập mẫu từ khối ủ u2 (đợt phân lập IV trên môi trường MPA) 41

Hình 3.7 Hoạt tính enzyme ngoại bào của một số chủng vi sinh vật phân lập được từ các khối ủ rơm rạ 44

Hình 3 8 Hình thái khuẩn lạc (A, B) và tế bào với độ phóng đại 800x (C, D) của chủng IUv2.8.1 47

Hình 3 9 Hình thái khuẩn lạc (A, B) và tế bào với độ phóng đại 800x(C, D) của chủng IUv2.23 47

Hình 3 10 Hình thái khuẩn lạc (A, B) và tế bào với độ phóng đại 800x (C) của chủng IIUvl 22 48

Hình 3 11 Hình thái khuẩn lạc (A, B,C) và tế bào với độ phóng đại 800x (D, E) của chủng xạ khuẩn IIƯxl 13.2 51

Hình 3.12 Hình thái khuẩn lạc (A), tế bào với độ phóng đại 400x (B), Làm đổi màu cơ chất Gause I (C), hệ sợi và bào tử mọc kín hộp thạch (D) của chủng VUnl 51 52

Hình 3 13 Kết quả kiểm ừa tính đối kháng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 53

Hình 3 14 Thử nghiệm khả năng phân giải rơm rạ của các chủng vi sinh yật tuyển chọn 54

và xuất khẩu Hiện nay, ở Việt Nam, sản lượng lúa trung bình hàng nămkhoảng 38 - 40 triệu tấn trên diện tích gieo ừồng khoảng 7,44 triệu hecta Haivùng trồng lúa trọng điểm của cả nước là đồng bằng sông Cửu Long và đồngbằng sông Hồng Nông dân Việt Nam có tập quán canh tác lúa nước từ hai đến

ba vụ ừong năm Trung bình một tấn lúa gạo cho ra 1 - 1,2 tấn rơm rạ Với sảnlượng lúa hiện nay, ước tính lượng rom rạ thải ra có thể lên đến 40 - 46 triệutấn/năm [20]

Việc xử lý rơm rạ - một dạng phế phụ phẩm nông nghiệp sau mỗi vụ thuhoạch lúa - trên thực tế chưa đem lại hiệu quả Trước đây, chất lượng đời sốngcủa nông dân còn thấp, rơm rạ được dùng làm vật liệu đun nấu trong sinh hoạt,làm thức ăn cho gia súc Hiện nay, khi chất lượng cuộc sống của người dânđược nâng cao, khí đốt (gas) được dùng để đun nấu, thức ăn tổng họp được sửdụng phổ biến cho chăn nuôi, do đó, việc xử lý rơm rạ sau thu hoạch đã ừởthành vấn đề cấp bách của xã hội vấn đề này còn trở nên nghiêm ừọng hơn khinhận thức của người nông dân về bảo vệ môi trường sống còn thấp Nếu thuhoạch lúa vào mùa khô, người nông dân sẽ đốt ngoài đồng để tranh thủ mùa

vụ, giảm lượng rơm rạ sau thu hoạch nhanh chóng Còn nếu thu hoạch lúa vàomùa mưa người nông dân thường vun rơm ngay cạnh bờ kênh, rạch hay bên lềđường Rơm rạ để tự nhiên ngoài đồng ruộng cần mất nhiều thời gian để xảy raquá trình phân hủy giúp tăng độ mùn trong đất Xử lý rơm rạ theo các cáchthức trên sẽ gây tắc nghẽn giao thông và gây ô nhiễm môi trường khí, ảnhhưởng tới sức khỏe của con người, đồng thời còn làm thất thoát, lãng phí

nguồn cacbon ừong chu trình chuyển hóa c trong hệ sinh thái nông nghiệp.Theo ước tính nếu đốt 1 tấn rơm thì sẽ thải ra 36,32 kg khí CO; 4,54 kghydrocarbon; 3,18 kg tro bụi và 56,00 kg C02 [dẫn theo 4] Đây là những thảnhphần khí đóng góp một phần không nhỏ gây hiệu ứng nhà kính, gây ô nhiễmmôi trường nói chung và không khí nói riêng

Trên thế giới, nhiều công trình khoa học đã đề cập đến công nghệ xử lýmùn cưa, trấu, rơm và một số nguyên liệu khác thành phân bón hữu cơ của cácnhà khoa học như Kiohyko Nakasaky và công sự (Khoa Kỹ thuật, Đại họcShizuoka, Nhật Bản) Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, vấn đề về xử lýrơm rạ sau thu hoạch đã nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học.Trong đó có nhiều công trình khoa học nghiên cứu và ứng dụng công nghệ xử

lý rơm rạ như: xử lý rơm rạ bằng chế phẩm Trichoderma với nhiều loại đất

canh tác khác nhau (Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long), xử lý rơm rạ tạimộng làm phân bón sinh học (Công ty cổ phàn phân bón FITOHOOCMON), Tuy nhiên chưa có nhiều công trình nghiên cứu đầy đủ về khu hệ vi sinh vật(VSV) tự nhiên tham gia chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ ở nước ta Dovậy, nghiên cứu khu hệ vsv tham gia vào diễn thế sinh thái tự nhiên của quátrình chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ là hướng nghiên cứu cần thiết

Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu diễn thế sinh thái và đặc điểm sinh học của vi sinh vật tham gia quá trình chuyển hóa rơm ra thành mùn hữu cơ”.

•

2 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vsv đất tham gia quá trình chuyển hóa rom rạ thành mùn hữu

cơ tại xã Liên Mạc, huyện Mê Linh, Hà Nội

3 Mục tiều nghiền cứu

Nghiên cứu diễn thế sinh thái, các đặc điểm sinh học của vi sinh vậttham gia quá trình chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ làm phân bón cho câytrồng

4 Nội dung nghiên cứu

- Theo dõi diễn thế sinh thái của vi sinh vật đất trong quá trình mùn hóa

tự nhiên của rơm rạ

- Phân lập vi sinh vật tham gia quá trình mùn hóa tự nhiên của rơm rạ

- Đánh giá vai trò của các vi sinh vật phân lập được thông qua hoạt tínhenzyme ngoại bào và khả năng mùn hóa rơm rạ của chúng

5 Những đóng góp của đề tài

Đánh giá được vai trò của các nhóm vsv đất khác nhau tham gia vàodiễn thế sinh thái của quá trình mùn hóa rơm rạ ttong tự nhiên Trên cơ sở cácnghiên cứu cơ bản, đề tài đóng góp những hiểu biết toàn diện nhằm hướng tóixây dựng quy trình công nghệ xử lý phế phụ phẩm rom rạ trong sản xuất nôngnghiệp, tránh lãng phí các nguồn cacbon và góp phàn hạn chế gây ô nhiễm môitrường

1.1.1 Phụ phẩm rơm rạ trong sản xuất lúa gạo

Lúa gạo (Oryza satỉva) là cây trồng thuộc họ Hòa thảo (Poaceae) Đây

là cây lương thực chính của nhiều nước trên thế giới và Việt Nam

Hình 1.1 Sản lượng và diện tích gieo trồng lúa thế giói [dẫn

theo 21] Sản xuất lúa gạo trên thế giới từ năm 2005 đến nay tăng trưởng cả vềdiện tích gieo ttồng lẫn sản lượng (hình 1.1) Châu Á luôn đứng đầu về sản xuấtlúa gạo chiếm 90,3% (khoảng 651 triệu tấn) sản lượng gạo thế giới năm 2012.Kết quả này có được chủ yếu nhờ sản lượng tăng mạnh tại Trung Quốc, Ấn Độ,Pakistan và Việt Nam Trong đó, Việt Nam đạt 27,12 triệu tấn, xuất khẩu 7,72

triệu năm 2012, tấn đứng thứ hai sau Ấn Độ [dẫn theo 21] Mười quốc gia hàngđầu về xuất khẩu gạo trên thế giới năm 2012 là Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan,Pakistan, Brazil, Uruguay, Campuchia, Argentina, Myanmar, Trung Quốc.

Cũng theo số liệu năm 2012, với lượng phụ phẩm rơm rạ khoảng 40 triệutấn/năm, Việt Nam có tiềm năng rất dồi dào về sinh khối từ rơm rạ và trấu [dẫntheo 21] Lượng sinh khối phụ phẩm lúa gạo này được ước tính chiếm tới 64%các nguồn sinh khối ở nước ta Theo báo cáo của Tổ chức Nông lương thế giớinăm 1997, tỷ lệ rơm rạ/thóc dao động từ 0,4 (với rơm có độ ẩm 27%) đến 1,4(với rơm có độ ẩm 12 - 22%) Một nghiên cứu thực tế khác trên đồng ruộng ởThái Lan đã đưa ra con số bình quân tỷ lệ rơm rạ/thóc là 0,75 (với rơm rạ có độ

ẩm 10%) Nhiều tài liệu khác cũng chỉ ra số liệu tương đối nhất quán với tỷ lệnày Theo tỷ lệ đó thì lượng rơm rạ sau thu hoạch chiếm trên 50% trọng lượngcủa cây lúa [dẫn theo 22]

Trong 40 triệu tấn sinh khối từ phụ phẩm lúa gạo có 32 triệu tấn rom rạ và

8 triệu tấn trấu Tương ứng với sản lượng lúa, khối lượng phụ phẩm này tập trung

chủ yếu ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long (chiếm gàn 54%), Đồng bằng sôngHồng (chiếm 17%) và vùng Bắc trung bộ và duyên hải miền Trung (chiếm15,4%) [dẫn theo 22]

1.1.2 Thành phần, cấu trúc của rơm rạ

Theo Nguyễn Lân Dũng, thành phàn hóa học của rơm rạ nếu tính theonguyên tố thì cacbon (C) chiếm 44%, hyđrô (H) chiếm 5% oxy (O) chiếm 49%

và nitơ (N) chiếm khoảng 0,92% ; một lượng rất nhỏ còn lại là phốt pho (P), lưuhuỳnh (S) và kali (K) [dẫn theo 21]

Thành phần chính của rơm rạ tính theo khối lượng khô là: cellulose (34 38%), hemicelluloses (32 - 40%), lignin (12%), và hàm lượng tro (oxit silic) cao(từ 14 - 18%) Tỷ lệ lignocellulose cao (78 - 90%) gây cản trở việc sử dụng rơm,

-rạ một cách kinh tế Thành phần lignocellulose trong rơm -rạ, trong đó cócenllulose, rất khó bị phân hủy bởi hóa chất và vsv nhưng nếu sử dụng tập hợp

vsv phân giải thích họp thì sẽ tạo thành nguồn phân hữu cơ sinh học tốt

l.ỉ.2.L Cellulose

Cellulose là loại polysaccharide cấu tróc của thực vật, chúng thường tạonên thành tế bào, giúp cho các mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi.Cellulose là thành phần chủ yếu trong thân, lá của thực vật (trong gỗ chứa khoảng95% cellulose, sợi bông vải 97 - 98%, sợi đay 75%, thân cây họ Cói và họ Lúa 30

- 40% [18])

Cellulose có màu ttắng, không mùi, không vị Cellulose không tan trongnước (ngay cả khi đun nóng) và các dung môi hữu cơ thông thường nhưng tantrong một số dung dịch axit vô cơ mạnh (HC1, HNO3) và một số dung dịchmuối (Z11CI2, PbGy,— [dẫn theo 22]

Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo bời hàng nghìn đến hàngchục nghìn gốc /?-D-glucose lien kết vói nhau bằng các liên kết /7-1,4- glycosidenên có cẩu trúc mạch thẳng, rất bền và khó bị phân hủy Cellulose có công thứccấu tạo là (CôHioOsỉn hay [C6H702(0H)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng5000-14000 Trong đó, các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang(hình 1.1) [dẫn theo 22]

Hình 1.2 Cấu trúc lập thể của cellulose [8]

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau tạo thành micel tức là bó sợi cóchiều dài 50 - 100Ả Các micel lại tạo thành bó microfibril với đường kínhkhoảng 250 Ả nhờ nhiều liên kết hydro tạo sợi bền chắc Toàn bộ cấu trúc nàyđược bao bọc bởi lignin và hemicelluloses [8]

1.1.2.2 Hemicellulose

HemỉcelMose là một trong ba sinh khối tự nhiên chính Cùng với cellulose

và lignỉn, hemicellulose tạo nên thành phần lỉgnocellulose, cấu trúc

nên thành tế bào thực vật Hemicellulose là loạipolymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến

200 đơn phân (hình 1.3) Thành phàn cơ bản củahemicellulose là yổ-D xylopyranose, liên kết vói nhau bằngliên kết yổ-(l,4)=glucoside Chúng tạo nên chất nền, khảmvào khung cấu trúc của cellulose [8] cấu trúc và thànhphần của hemicellulose rất khác biệt ttong các loại tế bào

Hemicellulose là polysaccharide dễ tan trong dung dịch kiềm, trong nướcnóng và dễ bị phân hủy bởi axit loãng, về thành phần hóa học, hemicelluloseđược sắp xếp theo 4 nhóm phổ biến dựa theo sự khác nhau về thành phần các đơnphân và cấu trác của chúng: Xylan, mannan, yỡ-glucan đều là các polymer củaxyloglucan Các nhóm này khác biệt nhau về cấu trúc chuỗi, vị trí hay loại liênkết glycoside trong mạng lưới phân tử Chuỗi chính của hemicellulose có thểchứa chỉ một nhóm chức (homopolymer) như xylan, hoặc hai hay nhiều đơn yịtạo nên một heteropolymer như glucomannan [9] Chuỗi chính tronghemicellulose ngắn hơn rất nhiều so với chuỗi phân tử cellulose Ngoài ra, chúng

có các nhóm phụ được phân nhánh ở một vài trường hợp Xylan là thành phầncủa hemicellulose ở màng tế bào thứ cấp, chiếm khoảng 20 - 30% tổng sinh khốicủa cây hai lá mầm (cây gỗ cứng và cây thân cỏ) Trong một vài tổ chức mô củacây một lá mầm (cỏ và ngũ cốc), xylan được tìm thấy chiếm tỷ lệ tới 50% [5]

Hình 1.3 Cấu trúc của hemicelluloses [18]

Một số hemicellulose được cấu tạo từ một số phân tử monosaccaride khôngcùng loại như: D-galactose, D-arabinose, D-xylose, D-manose, D-axitglu.con.onic

1.1.2.3, Lignin

Lignin là họp chất hóa học phổ biến được tìm thấy trong hệ mạch thực yật,chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật Chúng bao bọc xungquanh sợi cellulose và có hàm lượng lớn thứ hai sau cellulose Hàm lượng lignintong thực vật khác nhau tùy từng loài cây, độ tuổi và điều kiện tự nhiên Trungbinh, hàm lượng lignin ừong thực vật chiếm khoảng 25 - 40% Cây lá nhọn chứa

20 - 30% ligDÌn, cây lá rộng chứa 20 - 25%, cây cỏ khoảng 5

- 9% Chúng là hợp chất có khối lượng lớn, có đặc tính thơm và kị nước [3].Lignin có cấu truc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình Ligninkhông phải là carbohydrate nhưng cố liên kết chặt chẽ vói nhóm này để tạo nênmàng tế bào giúp thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nướctrong cơ thể thực vật, giúp cây phát triển và chống lại sự tấn công của

côn trùng và mầm bệnh Thực vật càng già, lượng lignintích tụ càng lớn Hơn nữa, lignin đóng vai trò quan trọngữong chu trình carbon, tích lũy carbon khí quyển trong môcủa thực vật thân gỗ lâu năm; chứng là một trong các thànhphần bị phân hủy lâu nhất của thực vật sau khỉ chết, để rồi

Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, điển hìnhlà: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), ữans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol (hình 1.4) Chúng là mộtpolyphenol có cấu truc mở, chủ yếu đóng vai trò chất liên kết tong thành tế bàothực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemiceHulose Do vậy, khó cóthể tách lignin ra hoàn toàn

OH

p-coumaryl alcỡhol CoriiféfYỈ

Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhấttrong cấu trúc Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấutrúc hình thuôn hoặc hình cầu Thêm vào đó, cấu trúc hốa học và cấu trúc khônggỉan của Ugnin đều bị ảnh hưởng bởi mạng lưới polysaccharide

Hình 1.5 Cấu truc lỉgnin [8]

Ở nhiệt độ phản ứng cao (ữên 200°C) lignin bị kết khối thành những phầnriêng biệt và tách ra khỏi cellulose

1.13 Hiện trạng sử dạng rơm rạ trên thể giới và ở Việt Nam

1.1.3.1, Hiện trạng sử dụng rơm rạ trên thế giới

Khu vực châu Âu, Bắc Á và Bắc Mĩ là khu vực có điều kiện tự nhiên thíchhợp vód sự sinh trưởng của lua mì, không phù hợp ưồng lua gạo Diện tích trồnglúa nủ ở khu vực này rất lớn còn lúa gạo (lúa nước) được ưồng chủ yếu ở khu vựcĐông Nam Á và châu Phi Lúa gạo là thức ăn chính, cung cấp năng lượng chohơn 3 tỉ người (phân nửa dân số trên thế giới) [21] Hơn nữa, lúa gạo còn cungcấp việc làm cho hàng ữăm triệu ngưồd ở cả các nước phát triển và đang pháttriển, từ thôn quê đến thành thị

Đông Nam Á là vựa lúa gạo lớn nhất trên thế giới, Thái Lan và Việt Nam

là hai nước sản xuất và xuất khẩu gạo hàng đầu Cùng với việc đẩy mạnh sự pháttriển của cây lúa, phụ phẩm đi kèm với số lượng khổng lồ là rơm rạ cũng theo đó

mà nhiều lên Mặc dù rơm rạ đã được xử lí theo những cách khác nhau như: làm

thức ăn cho vật nuôi, làm nguyên liệu trồng nấm, nhưng lượng rơm rạ tồn dưvẫn còn rất lớn vấn đề chuyển hóa rơm rạ thành phân bón hữu cơ đã được nghiêncứu và đã có một số công trình nghiên cứu đưa vào thực tiễn Tuy nhiên, phần lớnnhững công trình nghiên cứu đó đều nghiên cứu về xử lí rơm rạ của lúa mì, yếnmạch của khu vực châu Âu và Bắc Á, Bắc Mĩ như: chế biến rơm rạ thành thức ănvật nuôi, phân hữu cơ từ rơm rạ lúa mì (Hoa Kỳ), và gàn đây là nghiên cứu chếbiến rơm rạ các loại lúa mì, lúa mạch, yến mạch, cải dầu, thành nhiên liệu sinhhọc (Anh), [20].

Ở khu vực châu Phi, châu Á đặc biệt là khu vực Đông Nam Á, người ta xử

lí rơm rạ của cây lúa gạo theo nhiều cách khác nhau, tương tự như cách xử lí rơm

rạ của lúa mì ở trên Tuy nhiên, hiệu quả kinh tế của các quy trình xử lí rơm rạ ởkhu yực này lại chưa cao Do vậy, phàn lớn rơm rạ được xử lí theo cách truyềnthống như: đun nấu gia đình, làm thức ăn khô dự trữ cho đại gia súc và đốt rơmngoài đồng mộng

Một số nước Đông Nam Á như Thái Lan và Indonesia đã xử lí rơm rạ sauthu hoạch để sản xuất thành nguồn điện năng phục vụ đời sống Ngoài việc sảnxuất điện từ nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp (rom rạ), các dự án này cũng đưalại những lợi ích khác cho người nông dân như: giảm thiểu ô nhiễm môi trường,tăng thu nhập cho ngưòi nông dân [20]

1.1.3.2 Hiện trạng sử dụng rơm rạ ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong khu yực Đông Nam Á, có kiểu khí hậu cận nhiệt đớigió mùa, lượng mưa hàng năm lớn Do đó, Việt Nam có điều kiện tự nhiên rấtthuận lợi để phát triển sản xuất lúa gạo, trở thành quốc gia đứng đầu thế giới vềxuất khẩu gạo Việt Nam sản xuất gần 6,6 triệu tấn gạo năm 2013, đứng thứ 3 sau

Ấn Độ và Thái Lan [20]

Cùng với sản lượng gạo sản xuất hàng năm cao, sự tồn dư phụ phẩm rơm

rạ là rất lớn Vói bề dày lịch sử của nghề trồng lúa nước, cùng vói sự tồn tại của

hai nền văn minh lúa nước: đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long,vấn đề xử lí rơm rạ sau thu hoạch ở nước ta cũng rất phong phú.

Các giải pháp sử dụng rơm rạ truyền thống như: làm vật liệu lọp mái nhà,phơi khô làm thức ăn dự trữ cho yật nuôi, đun nấu trong gia đình rất phổ biến ởnông thôn Việt Nam trong giai đoạn trước đây, từ những năm 1990 trở về trước.Hiện nay, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, nhiên liệu đun nấu (gas,biogas) dần thay thế rơm rạ trong gia đình các nông hộ Quy trình chăn nuôi giasúc, gia cầm tập trung, sử dụng thức ăn công nghiệp, cũng dàn thay thế việc chănnuôi nhỏ lẻ sử dụng thức ăn tận dụng và rom rạ tại các nông hộ Do vậy, rơm rạtồn dư ngày càng nhiều, dẫn tới hiện tượng phổ biến sau thu hoạch là đốt rơm rạtại ruộng Việc làm đó gây khói bụi, làm mất an toàn giao thông, gây ô nhiễmmôi trường không khí, Đốt rơm rạ tại ruộng làm cho đồng ruộng bị khô, chaicứng, một lượng lớn nước bị bốc hơi do nhiệt độ hun đốt trong quá trình cháyrơm rạ Ngoài ra, lượng dioxit cacbon (C02), phát thải vào khí quyển cùng vớicacbon monoxit (CO); khí metan (CH4); các oxit nitơ (NOx); và một ít dioxitsunfua (SO2) cũng góp phần gây hiệu ứng nhà kính [10] Phần rơm, rạ sót thườngđược cày lấp vào ttong đất làm phân bón cho mùa vụ sau Việc phân hủy gốc rạ

và rơm phụ thuộc vào độ ẩm của đất và các vsv ừong đất Tuy biện pháp nàycung cấp cho đồng ruộng một chút dinh dưỡng cho vụ tiếp theo, nhưng rất có thểchứa mầm sâu bệnh cho cây trồng, ảnh hưởng đến sản lượng vụ sau Nếu tìnhtrạng đốt rơm rạ ngay trên đồng ruộng vẫn tiếp diễn thì cùng với sự lạm dụngphân hóa học, đất sẽ càng ngày càng cằn cỗi và chai cứng Hậu quả lâu dài khôngthể lường trước được Do đó, việc nghiên cứu xử lí rơm rạ sau thu hoạch ở nước

ta là vấn đề nhận được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học cũng như chínhphủ Nhiều công trình nghiên cứu xử lí rơm rạ đã đi vào thực tiễn và đạt đượcnhững kết quả nhất định như: trồng nấm rơm, chế biến rơm thành thức ăn vậtnuôi, chế biến rơm rạ thành phân bón hưu cơ, chế biến rơm thành đồ thủ công,

mỹ nghệ

Quy trình xử lý rơm rạ tại mộng làm phân bón sinh học nhằm bảo yệ môitrường và phát triển nền nông nghiệp bền vững đã được phát triển từ các đề tài:

“Xây dựng mô hình xử lý rơm rạ làm phân hữu cơ vi sinh phục vụ cho sản xuấtlúa an toàn và góp phần giảm ô nhiễm môi trường trên địa bàn huyện Bình Giang

- Tinh Hải Dương”, do UBND tỉnh Hải Dương quản lí năm 2009 - 2010; “ứngdụng chế phẩm vi sinh Biomix-RR chế biến rơm rạ thành phân hữu cơ tại đồngmộng bón cho cây trồng nhằm phát triển nền nông nghiệp bền vững tại tinh HòaBình”, do UBND tinh Hòa Bình quản lí năm 2010 - 2011, đã được Thủ tướngChính Phủ tặng Bằng khen về sáng tạo trong khoa hoc công nghệ năm 2008, cúpvàng - Giải nhất giải thưởng sáng tạo KHCN-VIFOTECH năm 2006, huy chươngbạc - triển lãm sáng tạo Quốc tế lần thứ 4 tại Seoul - Hàn Quốc, cúp vàng hội chợ

công nghệ Techmart năm 2003, 2005 [dẫn theo 22].

1.2 Tổng quan về vỉ sinh vật có khả năng phân giải rơm rạ

Nhóm vsv phân hủy chất hữu cơ, rơm rạ trong tự nhiên rất phong phú vàđược các nhà khoa học đặc biệt quan tâm Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới vàtrong nước, rom rạ được phân hủy bởi nhiều nhóm vsv Các vsv điển hình có khả

năng phân giải rơm rạ là Bacillus sp, Streptomyces sp, Actinomyces sp,

Pseudomonas sp, Azospirillum sp, Azotobacter sp, Trỉchoderma sp, Aspergillus

sp [6] Một số chế phẩm sinh học phân hủy chất hữu cơ, đặc biệt là những chếphẩm phân hủy rơm rạ được lưu hành trên thị trường (chế phẩm Compost maker,nấm Trichoderma, chế phẩm Viura, chế phẩm EM, ) thường bao gồm tập họpmột vài hoặc hàng chục loại vsv khác nhau

Chế phẩm Compost maker được ứng dụng để xử lý nhiều loại cơ chất hữu

cơ như: than bùn, phân gia súc, gia cầm, phế phụ phẩm nông nghiệp (rơm, thân lácây, vỏ cà phê ) làm phân bón hữu cơ sinh học hoặc làm nguyên liệu sản xuấtphân hữu cơ vi sinh vật Chế phẩm bao gồm 3 chủng vi sinh vật: Chửng xạ khuẩn

(Streptomyces sp.), chủng vi khuẩn phân giải lân (Bacillus subtỉlỉs) và chủng nấm

men (Saccharomyces cerevỉsỉae).

Chế phẩm Vixura: là chế phẩm dạng bột chứa 12-15 loại vi sinh vật đượcphân lập, tuyển chọn tại Viện Công nghệ Sinh học, trong đó có các chủng

Bacillus và xạ khuẩn có khả năng sinh ra các enzyme khác nhau để phân huỷ chất

hữu cơ trong rác và rơm rạ Ngoài ra, còn có một số vsv chức năng như các vsv

đối kháng với một số bệnh của cây trồng {Bacillus sp.), vsv cố định đạm

(Azotobacter sp.) và vsv phân huỷ phốt phát khó tan (Bacillus sp.) giúp cho cây

trồng dễ dàng hấp thụ dinh dưỡng

Chế phẩm E.M (Effective Microorganisms - vi sinh yật hữu hiệu) được sảnxuất từ Nhật Bản do Giáo sư Tiến sĩ Teuro Higa - Trường Đại học tổng hợpRyukyus, Okinawa sáng chế và được áp dụng vào thực tiễn năm 1980 Chế phẩmE.M được tạo ra từ việc phân lập và lựa chọn các chủng vsv khác nhau có sựtương họp về sinh lý Chúng sống cộng sinh và phát triển có ích nhằm phân giảitriệt để các họp chất hữu cơ Các nhóm vsv chính trong chế phẩm EM là: vikhuẩn quang họp, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm mốc Dùng E.M để ủphân compost với nguyên liệu là lá cây, vỏ trái ca cao, rơm rạ rất hữu hiệu

Các chế phẩm phân hủy rơm rạ kể trên có thể bao gồm hỗn hợp vsv vớinhiều nhóm vsv khác nhau (như Compost maker, Vixura, E.M) nhưng cũng cónhững chế phẩm chỉ có một chủng vsv (chế phẩm nấm Trichoderma)

Phần lớn các công trình nghiên cứu phân hủy rom rạ đều nghiên cứuchuyên sâu về quy trình xử lí rơm rạ và công nghệ tạo chế phẩm Diễn thế sinhthái tự nhiên trong quá trinh phân hủy rơm rạ vẫn còn ít được đề cập đến

Để phân hủy rơm rạ, vsv phải có enzyme phân hủy cả 03 thành phàn chínhcủa rơm rạ: cellulose, hemicellulose và lignin

• Enzyme phân giải cellulose

Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là /?-(l,4) glucoside Để thủyphân hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có một hệ enzyme cellulasevới những tác động đặc trưng riêng biệt Dựa theo nghiên cứu về hệ enzyme

cellulase của nấm Trichoderma reesei, hệ enzyme thủy phân cellulose gồm 3 loại

enzyme:

(1) Endoglucanase hoặc 1,4-yỡ-D-glucan glucanohydrolase là enzymethủy phân các liên kết 1,4-yổ-D-glucoside trong phân tử cellulose ở các điểmngẫu nhiên bên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự do và cácchuỗi oligosaccharide ngắn Các endoglucanase không thể thủy phân cellulosetinh thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tươngđối dễ tiếp cận.

(2) Exoglucanase bao gồm các 1,4- ß -D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.74), giải phóng D-glucose từ yổ-glucan và cellodextrin; và các 1,4- ß -D-

glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), thủy phân D-cellobiose Tỷ lệ thủy phâncủa enzyme cellobiohydrolase bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu khử của mạchcellulose

(3) yổ-glucosidase hay yổ-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) giảiphóng phân tử D-glucose từ cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác

Rất ít sinh vật có khả năng phân giải cellulose để làm nguồn cung cấp thức

ăn Vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng cao; chúng chỉ có tác dụng điềuhòa hệ thống tiêu hóa, làm giảm lượng mỡ, cholesterol trong máu và tăng cườngđào thải chất cặn bã Vi khuẩn trong dạ cỏ của các động vật nhai lại và các độngvật nguyên sinh trong ruột mối là những vsv có khả năng sinh enzyme phân giảicellulose Ngoài ra, một số vsv đất cũng có khả năng này [19]

• Enzyme phân giải hemỉcellulose

Xylan là cơ chất điển hình trong nhóm hemicellulose của thực vật.Enzyme xylanase, thủy phân xylan, được sản xuất chủ yếu từ vsv Các vsv có khảnăng sinh enzyme xylanase ngoại bào bao gồm chủ yếu là vi khuẩn và nấm mốc[8; 11; 17]

Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân đòi hỏi một hệ thốngenzyme phức tạp Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme cắt mạch chính

không phân nhánh (ß-1,4-endoxylanse và yỡ-xylosidase) và enzyme cắt mạch

nhánh (cc-arabinofuranosidase, a-glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase

axit phenolic) Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển đổi xylanthảnh các cấu tử đường của nó Hệ thống các enzyme thủy phân xylan đa chứcnăng như vậy khá phổ biến ở vi khuẩn và nấm.

• Enzyme phân giải lignin

Lignin cấu trúc tò nhiều đơn phân có vòng thơm, có đặc tính không ưanước Do đó rất khổ phân huỷ

về cấu tạo, lignin gồm các mạch phenylpropanoid phức tạp, cấu trúc khôngđồng nhất Chính vì tính chất đó nên việc phân huỷ sinh học lignin đòi hỏi hệenzyme oxy hóa khử mạnh Trong các enzyme oxy hóa khử phân hủy lignin,enzyme có hoạt tính mạnh là ligninase (lignin peroxidase, với phản ứng đặc hiệuphân huỷ H2O2) và manganese peroxidase (EC 1.11.1.13) Manganese peroxidase(MnP) xúc tác phản ứng đặc hiệu phân huỷ H202 MnP xúc tác phản ứng oxy hoákhử một vài loại phenol đơn vòng và sắc tố vòng, nhưng những phản ứng nàyphụ thuộc vào sự có mặt của Mg2+ và dung dịch đệm Trên thực tế, MnP xúc tácphản ứng oxy hoá khử Mn(II) thành Mn(m) khi có mặt chất nhận làm bền vữngMn(III) Kết quả là tạo thành phức hợp Mn(III) sau khi xảy ra phản ứng oxi hoákhử các chất hữu cơ Ligninase (EC 1.11.1.14, LiP) là một phần của hệ thống

enzyme ngoại bào của nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium LiP có đặc

tính gây khoáng hoá nhiều loại họp chất thơm khó xử lý và oxy hoá một số lượnglớn các hợp chất phenol và hợp chất thơm đa vòng LiP thường được cố định trênchất mang xốp ceramic hoặc trên màng silicon, sử dụng để xử lý các rác thải khóphân hủy [12]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

Bảng 2.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy vsv

- Nước 1 lít - Nước 1 lít - Nước 1 lít - Nước 1 lít

BG: Bột giây RBBR: Remazol Brilliant Blue R

CMC: Cacboxyl Methyl Cellulose

- Kính hiển vi (Olympus, Nhật Bản)

- Box cấy vô trùng (Holíten, Đan Mạch)

- Tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật Bản)

- Pipet (Gilson, Pháp) vái các thể tích khác nhau

- Hộp đĩa Petri, ống nghiệm có nút bông, que trang, đèn cồn và các dụng cụ thí nghiệm càn thiết khác.

- Máy vortex (Kinka, Đức)

- Máy đo pH (MP200R, Thụy Sĩ)

- Máy li tâm (Bekman, Đức)

2.2 Phương pháp nghiền cứu

2.2.1 Lẩy mẫu

Lấy mẫu đất đồng mộng tại xã Liên Mạc, huyện Mê Linh, thành phố HàNội Lấy mẫu vào thời điểm ngay sau thu hoạch lúa (tháng 6 đối với vụ lúa mùa,tháng 10 đối với vụ lúa chiêm) Lúc này, đất ruộng đã được cày bừa để chuẩn bịcấy, chưa bón phân Lấy mẫu ở vị trí giữa mộng, từ mặt đất đến độ sâu 5cm

Mau rơm rạ trong khối ủ: Được lấy ở giữa khối ủ (5g), được cắt nhỏ, trộnđều Sau đó, lg mẫu này được đem phân lập vsv

nguồn nitơ (bảng 2.3) Các khối ủ vào mùa hè (từ ngày

30 tháng 06 đến ngày 09 tháng 09 năm 2013) được ký hiệu

tiến hành tương tự như đối với các khối ủ mùa hè Cơ chấtrơm rạ trong khối ủ được để trong thùng xốp sạch với thể

mưa nắng ảnh hưởng tói quá trình phân hủy rơm rạ của khu

3 ĐI lOkg rơm khô +1,2 lít nước mưa + 255g NH4NO3

4 Đ2 lOkg rơm khô + l,5kg đât đông mộng +1,2 lít nước mưa + 255g

NH4NO3

Theo tính toán lý thuyết thì tỷ lệ C:N trong rơm rạ khô là khoảng 40:1[12] Để đạt tới tỉ lệ C:N thích họp cho vsv sinh trưởng và phát triển (~ 30:1),khối ủ được bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (ammonium nitrate) theo tính toánsau:

ĩĩic rơm — 40m N rơmĐể đạt lượng mùn tối ưu thì:

nic mùn = 30m N m {jn = 30(m N rơm + ĨĨI N bổ sung)'

Do đó:

Sau khi phân hủy rơm rạ có khoảng 35%c tạo mùn và 65%c tạo khíC02 thoát ra [12] Như vậy, ừong 10kg rơm khô: mcmùn = 0,35x10 = 3,5kg

Trong mùn tiêu chuẩn có C:N = 10:1 tức là mcmùn= 10mNmùn Do đó:

IĨIn mùn — rơm "I" IHn bồ sung — 0,1x3,5 — 0,35 (kg) (II)

Từ (I), (II): mN bổ sung = 0,089 (kg) và mNrơm= 0,263 (kg)

Nguồn bổ sung là amonium nitơrat (NH4NO3) Do đó, khối lượngamonium nitơrat cần bổ sung cho 10kg rơm khô là:

(0.0875x80)/28 = 0,255 (kg) = 255 (g)

Theo dõi các khối ủ trong vòng 70 ngày với các thông số sau:

- Nhiệt độ của môi trường và khối ủ, đặc điểm hình thái của rơm rạ (mùi,

độ nhớt, mầu sắc) trong các khối ủ được kiểm tra hàng ngày Đối với mỗi đặcđiểm hình thái mới xuất hiện của cơ chất rơm rạ, xác định nhóm vsv sơ bộ thôngqua quan sát dưới kính hiển vi quang học Kiểm tra nhiệt độ 3 lần/ngày vàokhoảng thòi gian 5h, 13h, 21h

- Đảo trộn khối ủ và kiểm tra độ mủn, độ nhớt, mùi và sự thay đổi khốilượng các khối ủ định kì 7 ngày/lần

- Lấy mẫu để phân lập và kiểm tra độ ẩm khối ủ định kì 14 ngày/đợt hoặckhông định kì (ở thời điểm nhiệt độ lên cao nhất)

2.2.2.2 Phân lập vi sinh vật từ các khối ủ [2]

Lấy mẫu rơm rạ từ các khối ủ (đã nêu ttên) để phân lập vsv Nghiền nhỏmẫu và pha loãng mẫu bằng nước muối sinh lý vô trùng, sau đó ừang đều mẫu đãpha loãng trên môi trường thạch MPA, Czapek Dox và Gause I Giữ các đĩa Petrimôi trường đã phân lập này trong tủ ấm 30 - 37°c trong vòng 7 ngày để đếm sốlượng vsv sống và tách các khuẩn lạc vsv Cụ thể như sau:

- Sau khi đảo trộn khối ủ, lấy 5g mẫu rơm ủ, cắt nhỏ, trộn đều và cho lgvào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, lắc đều trên máyvortex trong vài phút thu được dịch pha loãng 10"1

- Dùng pipet lấy lml ở ống nghiệm ở độ pha loãng 10"1 cho vào ống nghiệmchứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, đảo trộn đều bằng máy vortex để thuđược dung dịch có độ pha loãng 10'2 Tiếp tục pha loãng như vậy, thu được nhiềunồng độ pha loãng nhỏ hơn

- Hút o.lml dịch pha loãng ở nồng độ nghiên cứu (10'7, 10'8) vào môitrường thạch ừên đĩa Petri (môi trường MPA, Czapek Dox, Gause I) và trang đềutrên bề mặt thạch cho đến khi khô dịch Gói kín các hộp đĩa Petri môi trường đãphân lập này bằng giấy báo và đặt vào tủ ấm 30°c Theo dõi sự phát triển củakhuẩn lạc trên các hộp đĩa Petri phân lập trong 7 - 1 0 ngày Khi các khuẩn lạckhác nhau của từng nhóm vsv xuất hiện, cấy ria nhiều lần (nếu cần) để thu đượckhuẩn lạc thuần trước khi cấy khuẩn lạc vào môi trường giữ giống thích hợp.

Môi trường MPA dùng để cấy vi khuẩn, Czapek Dox để cấy nấm mốc,Gause I để cấy xạ khuẩn

2.2.2.3 Đem sổ lượng tể bào vi sinh vật sống trên đĩa thạch [2]

Khuẩn lạc vi khuẩn được đếm trên đĩa môi trường phân lập sau 1-3 ngày ủtrong tủ ấm 30 - 37°c Khuẩn lạc nấm mốc và xạ khuẩn được đếm trên đĩa môitrường phân lập sau 3-7 ngày ủ trong tủ ấm 30 - 37°c.

Tổng số vsv trong đống ủ (N) được xác định theo công thức:

2.2.2.4 Kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào phân giải lignin, cellulose và hemicellulose

Sử dụng phương pháp khuếch tán enzyme ngoại bào ttên môi trường thạchchứa cơ chất (đặt thạch hoặc nhỏ dịch) Sau đó dùng thuốc thử để kiểm tra sựphân giải của cơ chất trong môi trường thạch

• Phương pháp đặt khối thạch [2]

- Nuôi cấy các chủng vsv nghiên cứu trên môi trường thạch thích hợptrong đĩa Petri, sao cho môi trường thạch có độ dày đồng đều 3mm

Hút 0,lml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng cho vào giữa đĩa thạch và dùngque cấy lấy sinh khối vsv nghiên cứu hòa vào giọt nước trong đĩa thạch, trang đềusinh khối vsv trên bề mặt thạch đến khi khô dịch Đặt các đĩa Petri này ừong tủ

ấm 30°c trong khoảng thòi gian thích hợp cho đến khi vsv mọc kín đĩa thạch ( 2

-3 ngày đối với VK, -3-5 ngày đối với NM, 5-7 ngày đối với XK)

- Chuẩn bị môi trường thử hoạt tính (môi trường chứa cơ chất) trong cácđĩa Petri với độ dày đồng đều 3mm như độ dày của môi trường nuôi cấy Dùngkhoan nút chai (đường kính d = lOmm) vô trùng, khoan các khối thạch có vsvừên môi trường nuôi cấy và đặt lên môi trường thử hoạt tính Các thí nghiệmđược lặp lại 3 lần cho mỗi chủng vsv nghiên cứu Đặt các đĩa Petri thử hoạt tínhnày ở 4°c trong 24h, sau đó, chuyển chúng sang tủ ấm 30°c để 24h (lưu ý: không

để trôi khối thạch)

- Kiểm tta hoạt tính của các vsv nghiên cứu thông qua sự phân giải cơ chấttrên môi trường thử hoạt tính:

+ Môi trường chứa RBBR: Quan sát trực tiếp vòng phân giải Trường họp

có hoạt tính phân giải RBBR, quanh khối thạch có vòng trong suốt, màu sáng hơnvùng xung quanh, đó là vòng phân giải cơ chất

+ Môi trường chứa CMC hoặc bột giấy: Nhuộm dung dịch congo đỏ 1%trong 5 phút, đổ bỏ dung dịch thuốc thử và rửa bằng dung dịch NaCl IM trong 15phút/lần (rửa khoảng 2-3 lần đến khi rõ vòng phân giải cơ chất) Quan sát vòngphân giải cơ chất có màu vàng nhạt hoặc trong suốt ở quanh khối thạch

+ Môi trường chứa xylan: Nhuộm lugol trong 5 - 1 0 phút, đổ bỏ dung dịchthuốc nhuộm và quan sát vòng phân giải cơ chất màu sáng trong suốt quanh khốithạch

Hoạt tính phân giải cellulose, hemicellulose, lignin được xác định bằngkích thước vòng phân giải (D - d), tính bằng mm, D là đường kính vòng phângiải, d là đường kính khối thạch

• Phương pháp nhỏ dịch [2]

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong bình nón lOOml chứa 15ml môitrường dịch thể thích họp Dùng que cấy lấy sinh khối vsv nghiên cứu, đưa vàocác bình nón trên và nuôi lắc ở điều kiện 35 - 37°c trong khoảng thời gian thíchhọp (2 ngày đối với VK, 3 ngày đối với NM, 4 ngày đối với XK).

- Chuẩn bị môi trường chứa cơ chất tương tự như đối với phương pháp đặtkhối thạch Dùng khoan nút chai vô trùng khoan lên môi trường cơ chất, nhấc bỏkhối thạch có đường kính lOmm để tạo các lỗ

- Nhỏ 0,1 ml dịch nuôi cấy vsv nghiên cứu vào lỗ thạch trên môi trường

cơ chất, lặp lại thí nghiệm 3 lần đối vói mỗi chủng vsv nghiên cứu Đặt các đĩaPetri thử hoạt tính này ở 4°c trong 24 giờ, sau đó, chuyển chúng sang tủ ấm 30°cthêm 24 giờ nữa

- Kiểm tra sự phân giải cơ chất quanh các lỗ thạch trên môi trường thửhoạt, và xác định hoạt tính tương tự như với phương pháp đặt khối thạch

2.2.2.5 Kiểm tra tỉnh đối kháng giữa các chủng vi sinh vật nghiên cứu

Dùng phương pháp cấy chữ thập trên môi trường thạch để kiểm tra tính đốikháng của các chủng vi khuẩn nghiên cứu; phương pháp đặt khối thạch để kiểm

ừa tính đối kháng của các chủng nấm mốc và xạ khuẩn nghiên cứu

• Phương pháp cấy chữ thập [2]

Các chủng vi khuẩn được cấy vạch, mỗi chủng cấy thành 01 vạch giao vớivạch cấy của chủng vi khuẩn khác, tạo thành hình chữ thập trên môi trường thạchđĩa MPA ủ ở 37°c trong 48 giờ cho đến khi các vạch cấy vi khuẩn mọc rõ

Quan sát sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn nghiên cứu tại những điểmgiao nhau giữa các vạch cấy Các chủng không đối kháng nhau khi tại điểm giaonhau đó không có vùng vô khuẩn Ngược lại, nếu tại điểm giao nhau xuất hiệnvùng vô khuẩn chứng tỏ các chủng vi khuẩn nghiên cứu đó đối kháng nhau

• Phương pháp đặt khối thạch [1]

Các chủng vi nấm hoặc xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạchthích họp trong đĩa Petri Dùng khoan nút chai vô trùng (d = lOmm) khoan vào

môi trường đã mọc kín vsv nghiên cứu để nhấc các khối thạch chứa sinh khối vsvnghiên cứu ra, đặt lên môi trường nuôi cấy Các khối thạch có chứa các chủng vsvkhác nhau được đặt cách nhau lcm ủ đĩa Petri môi trường nuôi cấy này trong tủ

ấm 37°c ttong 72 giờ và quan sát sự sinh trưởng của vsv nghiên cứu từ các khốithạch lan ra môi trường thạch đĩa Nếu xuất hiện vùng vô khuẩn giữa hai khốithạch chứng tỏ các chủng vsv nghiên cứu trên khối thạch đối kháng nhau Ngượclại, nếu không có vùng YÔ khuẩn giữa hai khối thạch thì các chủng vsv nghiêncứu không đối kháng nhau

2.22.6 Quan sát hình thái vi sinh vật [2]

• Quan sát hình thái khuẩn lạc

Sau khi xác định hoạt tính theo phương pháp đã trình bày ở trên (mục

2.2.2A), tuyển chọn các chủng vsv có hoạt tính để quan sát đặc điểm hình thái

khuẩn lạc bằng phương pháp cấy ria trên môi trường thạch hoặc phương pháp phaloãng vsv nghiên cứu để trang thành các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạchđĩa như phương pháp phân lập vsv

- Đối với phương pháp ria cấy: Dùng que cấy vô trùng, lấy sinh khối vsvnghiên cứu, cấy thành đường zíc zắc từ một góc trên bề mặt thạch đĩa (hoặc 4góc) để tạo thành khuẩn lạc riêng rẽ sau thời gian nuôi cấy từ 24 - 72 giờ ở 30°c.Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc khi khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trườngthạch, mô tả và chụp ảnh khuẩn lạc

- Phương pháp pha loãng vsv nghiên cứu trong môi trường dịch thể đượcthực hiện tương tự như phương pháp phân lập vsv, chỉ khác là mẫu phân lập đượcthay bằng mẫu sinh khối vsv nghiên cứu

+ Đối với mẫu vi khuẩn, chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi trong môitrường MPA dịch thể

Giống cấp 1 được nuôi ttong 3 - 5ml môi trường dịch thể, nuôi lắc 180

- 200 vòng/phút ở 35 - 37°c trong 24 giờ Bổ sung 3% dịch nuôi cấy cấp 1 vào15ml môi trường dịch thể trong bình nón 100ml, nuôi lắc 180 - 200 vòng/phút ở 35

- 37°c trong 24 giờ để được giống cấp 2 Pha loãng giống cấp 2 tới nồng độ thíchhợp (từ 10' 6 đến 10'8) bằng dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, ủ các đĩa Petri phânlập vsv ở điều kiện 35 - 37°c, trong 72h và quan sát định kì trong 3 ngày liên tiếp(mỗi ngày một làn) Mô tả hình thái khuẩn lạc, chụp ảnh đồng thời xác định sốlượng tế bào trung bình của vsv nghiên cứu trong lml dịch nuôi cấp 2 để sử dụngtrong các thí nghiệm tiếp theo.

+ Đối với xạ khuẩn, chủng vsv nghiên cứu được nuôi ừên môi trườngthạch Gause I; vi nấm được nuôi ừên môi trường thạch Czapek Dox Sau khi vsvnghiên cứu đã mọc kín đĩa Petri môi trường thạch, khoan lấy một khối thạch chứavsv nghiên cứu tương tự trong phương pháp thử hoạt tính và đối kháng Lấy 03khối thạch cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng và dầmnát khối thạch Sau đó, dùng dung dịch NaCl 0,9% vô trùng để pha loãng mẫuđến nồng độ thích hợp (từ 10'5 - 10'7 đối vói xạ khuẩn, từ 10 1 - 103 đối với vi nấm).Hút 0,1 ml của mỗi nồng độ trên vào môi trường thạch thích hợp trên đĩa Petri vàtrang đều cho đến khi khô dịch, lặp 3 lần đối với mỗi nồng độ pha loãng, ủ cácđĩa Petri này ở điều kiện 35 - 37°c Quan

sát định kì trong 3 ngày sau khi khuẩn lạc bắt đàu mọc (mỗi ngày một lần), mô

tả khuẩn lạc, chụp ảnh, đồng thời xác định số lượng bào tử trung bình của vsv

nghiên cứu trong 1 cm2 bề mặt môi trường thạch để sử dụng trong các thínghiệm tiếp theo

• Quan sát hình thái hiển vi các vsv nghiên cứu Sử dụng các phương pháp làm tiêu bản vsv sống, kĩ thuật tiêu bản ép lam và tiêu bản cố định nhuộm mầu để quan sát hình thái tế bào vsv dưới kính hiển vi quang học [3]

2.2.2.7 Phương pháp cấy truyền và bảo quản giống [2]

Cấy truyền định kì hàng tháng trên môi trường giữ giống thạch nghiêng

và bảo quản ở 4 - 10°c Giữ giống vi khuẩn lạnh sâu (-30°C) trong dung dịch10-30% glycerol Giống nấm mốc và xạ khuẩn được giữ dạng bào tử trong cátkhô, vô trùng

2.2.2.8 Xác định khả năng phân giải rơm rạ của các chủng vsv nghiên cứu Các

chủng vsv nghiên cứu được bổ sung riêng rẽ hoặc bổ sung thành

tập họp vào cơ chất rơm rạ trong các túi ủ (30g rơm + lgNH4N03 + 60ml H20 +vsv tuyển chọn) Các thí nghiệm (bảng 2.4) được lặp lại 3 lần

Dựa vào nghiên cứu và tính toán lượng tế bào hoặc bảo tử của mỗi chủngvsv trên lml dịch thể nuôi cấy hoặc 1 cm2 môi trường thạch, chúng tôi xác địnhlượng vsv bổ sung vào cơ chất rơm rạ trong bảng 2.4

Bảng 2.4 Vỉ sinh yật bổ sung vào cơ chất rơm rạ

Các thông số được theo dõi:

- Khối lượng túi ủ, theo dõi hàng tuần

- Độ mủn cơ chất rơm rạ, theo dõi 2 tuàn/lần

- Đặc điểm hình thái cơ chất rơm rạ (mùi, màu sắc, độ nhớt), theo dõihàng ngày

2.2.3 Phương pháp xác định độ ẩm tuyệt đối của rơm rạ

Độ ẩm của rơm tươi và rơm khô (rơm được phơi khô tự nhiên) được xácđịnh bằng phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi: Cân 20g rơm (tươi hoặckhô) cho vào đĩa Petri, sấy ở 105°c ttong 16 giờ Sau đó cân lại mẫu và tiếp tụcsấy trong 1 giờ Tiếp tục làm như vậy cho đến khi trọng lượng mẫu sấy khôngđổi

Xác định độ ẩm tuyệt đối theo công thức:

%H20 = [(rrio - m) : mj X 100%

Trong đó: ĩĩio: Khối lượng mẫu trước khi sấy