Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác DỊCH NÃO TỦY Mục tiêu • Lấy chuyên chở dòch não tuỷ thấy tính cấp thiết phải gửi gấp dòch não tuỷ đến phòng thí nghiệm để cấy để tăng hội bắt vi khuẩn gây bệnh. • Thực đầy đủ bước để không bỏ sót hội phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh nhờ biết qui trình thực vi sinh lâm sàng mẫu dòch não tuỷ, nhờ • Phát tác nhân thường gây viêm màng não mủ dù tác nhân đa số khó mọc biết dùng phương tiện cần thiết thích hợp để thực xét nghiệm vi sinh lâm sàng dòch não tuỷ. Chỉ đònh chọc dò dòch não tủy (DNT) khảo sát vi sinh lâm sàng DNT nên chọc dò để khảo sát vi sinh lâm sàng trước bệnh nhân có triệu chứng nghi ngờ viêm màng não. Không nên chọc dò DNT trước bệnh nhân có dấu hiệu gia tăng áp lực nội sọ. Dấu hiệu nầy khám phá qua soi đáy mắt thấy gai thò bò phù nề. Thời điểm chọc dò DNT Càng sớm tốt, sau có chẩn đoán lâm sàng. Trước bệnh nhân dùng kháng sinh điều trò hệ thống. Cách lấy chuyên chở DNT phải chọc dò bác só chuyên khoa, phương pháp vô trùng. 5-10ml DNT lấy vào lọ vô trùng nắp chặt (có thể dùng tube nắp vàng vô trùng hay tube Eppendorf biopure) gửi đến phòng thí nghiệm, không chậm trễ. Một lọ khảo sát vi khuẩn học lọ khảo sát sinh hóa tế bào. Có thể cấy giừơng với chai mặt thạch cấy DNT dòch không tạp nhiễm (xem hướng dẫn qui trình sử dụng chai mặt thạch cấy DNT dòch không tạp nhiễm) 52 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Quan sát đại thể Ghi nhận tính chất đại thể DNT, là: Trong, keo Đục, mủ Vàng, hay vàng chanh Có máu, có sợi fibrin, có cặn Khảo sát vi khuẩn học Khảo sát vi khuẩn học theo bước sau 1. Sửa soạn bệnh phẩm √ Nếu DNT đục, không cần ly tâm. √ Các trường hợp khác, ly tâm DNT 10 đến 15 phút tốc độ cao máy ly tâm bàn. Lấy phần cặn khảo sát vi thể nuôi cấy, phần nước làm phản ứng hóa miễn dòch phát kháng nguyên hòa tan làm phản ứng sinh hóa. 2. Khảo sát vi thể √ Làm phết soi tươi Nhỏ giọt cặn ly tâm vào lame kính, đậy lamelle lên. Đọc quang trường x400, đóng bớt hay hạ bớt tụ quang để thấy rõ độ tương phản. Tìm: - Bạch cầu (đa nhân hay lympho), hồng cầu - Vi khuẩn, nấm men - Đơn bào (Naegleria fowleri) Nếu có nấm men nghi Cryptococcus neoformans, quan sát dòch não tủy giọt mực tàu hay với nigrosin 20% √ Làm phết nhuộm - Gram - Kháng acid (nếu có yêu cầu) Kết phết nhuộm kết soi tươi phải thông báo cho Bác só điều trò. 53 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác 3. Cấy phân lập vi khuẩn gây bệnh √ Vì mẫu bệnh phẩm không bò ngoại nhiễm nên cấy nhiều mầm cấy. √ Có thể cần cấy vào thạch nâu có bổ sung XV (CAXV), ủ nhiệt độ 35-37oC bình nến. √ Nếu điều kiện mà DNT trẻ con, cấy vào hộp BA có vạch vạch S. aureus thẳng góc với đường cấy mầm cấy để kích thích H. influenzae mọc được, ủ nhiệt độ 35-37oC bình nến. √ Phần DNT lại cấy lưu dự phòng (back-up) vào dung dòch BHI. √ Theo dõi liên tiếp tối đa ngày, lúc có diện khúm vi khuẩn, tiến hành đònh danh kháng sinh đồ. Nếu có điều kiện, đònh type hay group huyết vi khuẩn. √ Vì viêm màng não mủ (VMNM) bệnh nguy hiểm, đe dọa tính mạng, nên có vi khuẩn mọc phải tiến hành nhuộm Gram khúm vi khuẩn kết hợp với tính chất khúm vi khuẩn mọc môi trường phân lập, phải trả lời kết tạm thời cho Bác só lâm sàng ngay. √ Nếu có yêu cầu tìm C. neoformans, cấy DNT thạch Sabouraud, BHI, ủ nhiệt độ 35-37oC. Cũng theo dõi liên tục ngày. √ Nếu có yêu cầu tìm M. tuberculosis, cấy DNT vào môi trường Lowenstein-Jensen (nên cấy ống), ủ nhiệt độ 35-37oC. Theo dõi liên tục tháng. Tìm kháng nguyên hòa tan vi khuẩn gây bệnh thường gặp DNT phương pháp hóa miễn dòch Có thể phát kháng nguyên hòa tan vi khuẩn gây bệnh có DNT phản ứng hóa miễn dòch như: Tụ latex với thuốc thử MENINGITEX, PASTOREX Điện di miễn dòch đối lưu (CCIE) ELISA 54 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Trong phương pháp phương pháp tụ latex cho kết nhanh (không phút), đơn giản (có thể thực giường bệnh), chòu ảnh hưởng thông số kỹ thuật, nhạy cảm. Tác nhân vi khuẩn gây viêm màng não Trẻ sơ sinh (cho đến tháng tuổi) √ Escherichia coli, √ Các Enterobacteriaceae khác (Salmonella spp, Citrobacter spp), √ Streptococcus agalactiae (nhóm B), √ Listeria monocytogenes, Các lứa tuổi khác √ Haemophilus influenzae type b(a), √ Neisseria meningitidis, √ Streptococcus pneumoniae, √ Mycobacterium tuberculosis, √ Listeria monocytogenes(b), √ Cryptococcus neoformans(b), √ Staphylococci(c). Bảng 1: Biện luận kết sinh hóa-tế bào-vi thể-đại thể dòch não tuỷ để từ suy đoán tác nhân vi sinh vật gây viêm màng não mủ Thông số Bạch cầu Glucose Protein Vi thể Đại thể (a) (b) (c) VMN vi khuẩn Đa nhân Rất thấp 5-20mg/100ml Tăng VMN lao Đơn nhân Thấp 20-40mg/100ml Tăng VMN vi nấm Đơn nhân Thấp 20-40mg/100ml Tăng Thường phát vi khuẩn Đục Hiếm thấy AFB Vàng chanh Thường phát vi nấm Đục nhẹ VMN virus Đơn nhân Bình thường 65-70mg/100ml Hơi tăng giai đoạn đầu Âm tính Trong Là tác nhân gây VMNM thường gặp tuổi từ 6th. đến 2t. Hiếm tuổi 5t. Gặp người bò suy giảm miễn dòch (vd AIDS) Gặp người chòu phẩu thuật sọ não hay sau dẫn lưu 55 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Câu hỏi ôn tập 1. Cho biết đònh lâm sàng để cấy dòch não tủy, thời điểm tốt để lấy dòch não tủy. 2. Hãy cho biết cách lấy chuyên chở dòch não tuỷ đến phòng thí nghiệm để làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng. 3. Hãy cho biết phương tiện lấy chuyên chở dòch não tuỷ thích hợp cho bệnh viện nay, phân tích ưu khuyết điểm phương tiện này. 4. Hãy cho biết qui trình xét nghiệm vi sinh lâm sàng thực phòng thí nghiệm bệnh phẩm dòch não tủy. 5. Hãy cho biết vi khuẩn gây bệnh gặp cấy dòch não tủy. 6. Hãy cho biết phương pháp hoá miễn dòch phát kháng nguyên hòa tan vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ có dòch não tuỷ. Phân tích ưu khuyết điểm phương pháp này. 7. Biện luận kết sinh hóa tế bào xét nghiệm dòch não tủy. Naegleria fowleri soi tươi KHV C. neoformans soi KHV đảo phase C. neoformans soi tươi KHV Hình 15: Một số hình ảnh quan sát trực tiếp phết soi tươi hay phết nhuộm Gram mẫu dòch não tuỷ bệnh nhân VMNM Neisseria meningitidis qua phết Gram dòch não tủy Streptococcus pneumoniae qua phết Gram dòch não tủy 56 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Sản phẩm liên quan: Chai hai mặt thạch CAXV để cấy dòch não tuỷ hay chất dòch không tạp nhiễm khác Mục đích sử dụng Chai cấy hai mặt thạch CAXV nghiên cứu sản xuất để thực kỹ thuật cấy giường hay cấy phiên trực mẫu dòch não tuỷ; hay dòch không tạp nhiễm khác dòch màng phổi, mủ abcess, dòch màng bụng, dòch màng tim, dòch khớp . Đóng gói Chai cấy hai mặt thạch CAXV chai polystyrene có đổ hai mặt thạch CAXV hai mặt hông chai. Chai có nắp vặn chặt với mặt nắp cao su dễ dàng đâm kim bơm mầm cấy vào. Chai có nắp bọc bảo vệ lớp nắp trong. Tất bọc kín màng co. Nắp Cách sử dụng Xé rách màng co, rút nắp khỏi nắp trong. Nắp cao su Mở nắp bệnh phẩm tráng lên Nắp hai mặt thạch, sau vặn chặt lại nắp Thạch CAXV trong. Có thể không mở nắp mà Thân chai polystyrene dùng bơm tiêm hút lấy bệnh phẩm bơm bệnh phẩm qua nắp cao su (sau Thạch CAXV sát trùng cồn để khô) để tráng lên hai mặt thạch. Để chai nằm lên mặt bên (khoảng vài phút cho mặt bên) để bệnh phẩm tráng lên mặt thạch. Sau dựng đứng chai lên, nới Hình 16: Cấu trúc chai mặt thạch CAXV dùng cấy dòch nảo tuỷ dòch không tạp nhiễm khác. lỏng nắp trong, đậy nắp lên, cho 57 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác vào bình nến để vào tủ ấm 35-37oC. Nếu tủ ấm CO2 không cần cho vào bình nến. Quan sát khúm vi khuẩn mọc hai mặt thạch ngày ngày. Do mặt thạch cấy bệnh phẩm thạch CAXV giàu bổ dưỡng giàu XV, tất vi khuẩn dù khó mọc H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae mọc được. Khi thấy có diện khúm vi khuẩn mọc mặt thạch phải làm phết nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn tiến hành đònh danh, kháng sinh đồ theo hướng mà hình ảnh Gram vi khuẩn gợi ý. MENINGITEX – phát nhanh kháng nguyên hòa tan vi khuẩn thường gây viêm màng não mủ Nguyên tắc thử nghiệm Thử nghiệm thực dựa theo nguyên tắc phản ứng tụ latex, kháng thể đặc hiệu gắn hạt latex bò tụ lại gặp kháng nguyên tương ứng, tượng tụ nầy thấy mắt thường. Thành phần thuốc thử Một thuốc thử gồm tube nắp chặt chứa thuốc thử ml huyền dòch hạt latex gắn kháng thể đặc hiệu Neisseria meningitidis group A (lọ NMA), Neisseria meningitidis group B (lọ NMB), Neisseria meningitidis group C (lọ NMC), Haemophilus influenzae (lọ Hib) Streptococcus pneumoniae (1 lọ PNE). Ngoài có lọ chứa 200µl kháng nguyên chứng (lọ C[+]). Hộp thuốc thử phải bảo quản nhiệt độ 4oC, có hạn dùng năm từ sau ngày sản xuất. Phương pháp thực thử nghiệm Chuẩn bò lame soi kính hiển vi mới, lau cồn, sau lau khô. Nhớ cầm lame phải cầm cạnh lame không cầm mặt lame. Dùng bút acetone hay bút mỡ kẻ ô lame. Nhỏ lên ô giọt (khoảng 10µl) dòch não tủy (DNT). Lắc mạnh tube thuốc thử MENINGITEX để thành huyền dòch đục sữa. Sau nhỏ ô đầu 58 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác tiên giọt (khoảng 10µl) NMA, ô thứ giọt (khoảng 10µl) NMB, ô thứ giọt (khoảng 10µl) NMC, ô thứ giọt (khoảng 10µl) Hib, ô thứ giọt (khoảng 10µl) PNE. Thay đầu cône sau lần lấy nhỏ thuốc thử lame. Dùng que tăm trộn giọt thuốc thử vào giọt dòch não tủy, vừa trộn vừa trải rộng hỗn hợp cho gần đầy mặt ô, nhớ thay que tăm sau trộn hỗn hợp ô. Sau trộn xong, giữ cạnh lame hai ngón trỏ và lắc nghiêng tới nghiêng lui vòng phút, vừa lắc vừa quan sát xem ô tụ lại để ghi nhận kết [+] kháng nguyên hòa tan vi khuẩn gây bệnh có dòch não tủy tương ứng với kháng thể đặc hiệu có giọt thuốc thử. Có tượng tụ ô hạt latex không dạng huyền dòch đục sữa mà tụ lại thành hạt lợn cợn trắng dung dòch dần đi. Hạt lợn cợn trắng lớn phản ứng tụ mạnh, nhỏ phản ứng tụ yếu. Nếu sau phút phản ứng tụ chưa thấy rõ, quan sát qua gương lõm ảnh phản chiếu ô qua gương lõm để phát hiện tượng tụ. Kiểm tra thuốc thử Cứ vài tháng kiểm tra thuốc thử xem có đủ nhạy không với chứng [+] với nước muối sinh lý. Thực lame soi kính hiển vi, lame kẻ ô. Thực trên lame, thay nhỏ vào ô giọt DNT, cho vào ô giọt 10 µl chứng [+] (từ lọ C[+]), lame thay nhỏ vào ô giọt DNT nhỏ vào ô giọt 10 µl nước muối sinh lý. Thuốc thử hiệu lực ô nhỏ chứng [+] có tượng tụ so với ô nhỏ nước muối sinh lý tượng tụ. DNT Đọc kết quả: Hib NMA NMB NMC Hib PNE Chứng [+] Chứng âm (nước muối SL) Hình 17: Mô tả cách làm xét nghiệm phát vi khuẩn gây bệnh có dòch não tủy thuốc thử MENINGITEX 59 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Hình 18: Chai mặt thạch CAXV cấy dòch não tuỷ dòch không tạp nhiễm khác, thích hợp phiên trực phòng thí nghiệm nhân viên trực chuyên khoa vi sinh. A B C D Hình 19: Các phương tiện thích hợp để lấy dòch não tuỷ là: (A) Tube ly tâm vô trùng 15ml nắp vặn (trái), (B) tube vô trùng 5ml, tube vô trùng 1.8ml, (D) tube nắp bật kiểu Eppendorf biopure. 60 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác DNT đục D0 Ly tâm 3000 rpm/10 min. DNT Nhỏ 3-5 giọt DNT lên CAXV Cấy trải KSTT qua nhuộm GRAM Ủ 37oC/CO2/qua đêm Nếu có diện VK MENINGITEX phát KN hòa tan KSTT qua nhuộm GRAM Nếu VK Làm KSĐ trực tiếp Nhỏ 3-5 giọt DNT lên CAXV Cấy trải Nếu có diện VK KQ sơ hình dạng Gram vi khuẩn Chờ KQ cấy D1 Nếu VK Ủ 37oC/ CO2/qua đêm KQ sơ MENINGITEX KQ sơ hình dạng Gram vi khuẩn Chờ KQ cấy KQ sơ KSĐ trực tiếp Đònh danh, kháng sinh đồ Có VK mọc Không có VK mọc KQ chung âm nghiệm Sơ đồ 5: QUI TRÌNH VI SINH LÂM SÀNG MẪU DỊCH NÃO TỦY D2 Kết chung cuộc: Đònh danh VK KSĐ 61 . sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 52 DỊCH NÃO TỦY Mục tiêu • Lấy và chuyên chở dòch não tuỷ và thấy được tính cấp thiết phải gửi gấp dòch não tuỷ đến phòng thí nghiệm để cấy ngay để. phết nhuộm Gram các mẫu dòch não tuỷ bệnh nhân VMNM Neisseria meningitidis qua phết Gram dòch não tủy Streptococcus pneumoniae qua phết Gram dòch não tủy Kỹ thuật xét nghiệm vi. lấy dòch não tủy. 2. Hãy cho biết các cách lấy và chuyên chở dòch não tuỷ đến phòng thí nghiệm để làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng. 3. Hãy cho biết phương tiện lấy và chuyên chở dòch não tuỷ