phân tích phân tử và khả năng kháng bệnh ghẻ thường do vi khuẩn streptomyces scabies ở một số dòng khoai tây chuyển gen mir

MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây lương thực đóng vai trò quan trọng thứ 4 trên thế giới. Là cây trồng có hàm lượng nước và dinh dưỡng cao nên khoai tây dễ bị tấn công bởi rất nhiều loại sâu bệnh hại. Trong đó đáng chú ý là bệnh ghẻ thường (Common scap) do vi khuẩn Streptomyces Scabies tấn công. Bệnh được ghi nhận gây hại trên hầu hết các quốc gia trồng khoai tây, trong đó có Việt Nam (Dung và cs., 2003) Bệnh ghẻ thường khoai tây là một trong những bệnh hại nghiêm trọng xuất hiện ở tất cả các vùng trồng khoai tây trên thế giới bao gồm: Mỹ, Ấn Độ, Châu Á và Châu Phi (Waner, 2006). Ở Mỹ, bệnh ghẻ thường là bệnh hại nghiêm trọng thứ 4 trên cây khoai tây, gây thiệt hại cho ngành công nghiệp khoai tây khoảng 3.5 tỉ USD (Meng và cs., 2012). Ở Việt Nam, hầu hết các vùng trồng khoai tây đều bị ảnh hưởng bởi bệnh này (Dung và cs., 2003). Các biện pháp phòng chống bệnh hiện nay như: không dùng phân chuồng, tăng cường tưới nước và giảm pH của đất thực tế là không cho hiệu quả rõ rệt, đồng thời cũng gây ra những tác động xấu đến môi trường và giảm tính bền vững của hệ thống nông nghiệp. Hiện tại có rất ít các giống khoai tây thương mại có tính kháng bệnh cao, trong khi đó khả năng phát triển các giống kháng bệnh lại gặp khó khăn do cho đến nay vẫn chưa tìm thấy nguồn gen kháng bệnh trong các loài khoai tây Solanum tuberosum. Trong khi các nỗ lực nhằm tạo giống kháng bệnh thông qua lai tạo truyền thống còn chưa có kết quả, việc sử dụng công nghệ gen đã cung cấp một công cụ hiệu quả để nâng cao tính kháng của khoai tây đối với bệnh này. Yếu tố gây độc ở Streptomyces Scabies (S.scabies) được xác định là Thaxtomin A (TA) – một loại phytotoxin ức chế sinh tổng hợp cellulose. Cùng với phát hiện này, Scheible và cộng sự (2003) đã tìm ra một đột biến gene kháng TA ở Arabidopsis, gọi là txr1. Gen tương ứng với đột biến này là gen TXR1. Đồng thời, sử dụng công cụ Blast (NCBI) cho thấy TXR1 có mức tương đồng cao trên các loài thực vật khác, như cà chua, đậu tương, ngô, lúa và lúa mì… (khoảng từ 73 đến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN VIỆT HÀ PHÂN TÍCH PHÂN TỬ VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GHẺ THƯỜNG DO VI KHUẨN STREPTOMYCES SCABIES Ở MỘT SỐ DÒNG KHOAI TÂY CHUYỂN GEN MIR CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS-TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO HÀ NỘI - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Luận văn công trình nghiên cứu tôi; - Số liệu sử dụng luận văn trung thực; - Thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc có độ xác cao phạm vi hiểu biết tôi. Hà Nội, ngày 24 tháng 02 năm 2015 Tác giả luận văn Học viên Trần Việt Hà Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, cho xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất quý thầy cô giảng dạy công tác Ban quản lý Đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật , Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội quan tâm, tạo điều kiện giúp đỡ ủng hộ trình học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp mình. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, cho phép bày tỏ lòng biết ơn kính trọng sâu sắc tới PGS-TS. Nguyễn Thị Phương Thảo – Trưởng khoa CNSH, Học viện Nông nghiệp Hà Nội tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực đề tài, đánh giá kết hoàn thành luận văn đồng thời bồi dưỡng cho kiến thức chuyên môn kinh nghiệm quý báu. Với tình cảm sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo, Cán công nhân viên Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật - Khoa Công nghệ sinh học, , đặc biệt ThS. Nguyễn Thị Thủy tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực tập. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể gia đình, bạn bè, anh em, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích hoàn thành luận văn này! Hà Nội, ngày 24 tháng 02 năm 2015 Học viên Trần Việt Hà Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu khoai tây 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Chiến lược sản xuất khoai tây bền vững vấn đề an ninh lương thực toàn cầu 1.1.3 Khoai tây bến đổi gen thị trường 1.1.4 Dịch hại khoai tây 1.2 Bệnh ghẻ thường khoai tây (Common scab potato) vi khuẩn Streptomyces 1.2.1 Triệu chứng, nguyên nhân gây bệnh đặc điểm phát sinh bệnh 1.3 Giới thiệu yếu tố Thaxtomin A 11 1.4 Đột biến TXR1 trình vận chuyển độc tố Thaxtomin A 13 1.5 Các biện pháp quản lý bệnh ghẻ thường khoai tây 14 1.5.1 Biện pháp thủy lợi 14 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 1.5.2 Cải tạo tính chất lý hóa đất 15 1.5.3 Sử dụng biện pháp hóa học 15 1.5.4 Sử dụng loài đối kháng 16 1.5.5 Biện pháp di truyền với việc sử dụng giống kháng bệnh: 16 1.6 Những biện pháp sàng lọc tình kháng bệnh ghẻ dòng khoai tây 18 1.7 Công nghệ miRNA ứng dụng 19 1.7.1 RNA interference 19 1.7.2 MicroRNA 20 1.7.3 RNAi thực vật 21 1.7.4 Cơ chế hoạt động miRNA 22 1.7.5 Phương pháp tiếp cận để tạo RNAi trồng 22 1.7.6 Các công cụ phát miRNA mục tiêu mRNA hiệu 23 1.8 Ứng dụng miRNA khoai tây 24 CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 2.2.1 Thời gian nghiên cứu 27 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Phương pháp chiết tách DNA (QUIA gen plant mini kit) 27 2.4.2 Phương pháp kiểm tra chuyển gen PCR: 28 2.4.3 Phương pháp đánh giá tính mẫn cảm với Thaxtomin A dòng khoai tây chuyển gen: 2.4.4 29 Phương pháp đánh giá khả kháng bệnh ghẻ thường lây nhiễm nhân tạo với S.scabies (Wanner, 2006 cải tiến): Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 30 Page iv 2.4.5 Phương pháp xác định số gây bệnh (Wanner Haynes, 2006): 31 23.4.6 Phương pháp Southern blot 32 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết kiểm tra có mặt cấu trúc gen chuyển vào dòng khoai tây PCR 3.2 36 Kết kiểm tra có mặt cấu trúc gen chuyển vào dòng khoai tây Southern blot 37 4.2.1 Kết chiết tách DNA tổng số nhân gen chuyển 38 3.2.2 Kết tạo mẫu dò cắt RE 39 3.2.3 Kết lai 40 3.3 Đánh giá dòng chuyển gen thông qua thử tính mẫn cảm với Thaxtomin A 3.4 41 Kết đánh giá khả kháng bệnh ghẻ thường dòng khoai tây chuyển gen thông qua lây nhiễm nhân tạo với vi khuẩn Streptomyces Scabies. 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 Kết luận 48 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 58 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt Tên đầy đủ S.scabies Streptomyces Scabies TA Thaxtomin A NCBI National Center for Biotechnology information RNAi RNA interference amiRNA Artificial miRNA miRNA microRNA PCR Polymerase Chain Reaction RISC RNA Inducing Silencing Complex RE Restriction Enzyme 10 sRNA Small RNA 11 siRNA Small interfering RNA 12 dsRNA Double-stranded RNA 13 CT Công thức 14 TN Thí nghiệm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Tính mẫm cảm với Thaxtomin A dòng khoai tây chuyển gen 3.2 Chỉ số gây bệnh giống Atlantic dòng chuyển gen vi khuẩn S.scabies (sau 16 tuần theo dõi) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 42 46 Page vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Triệu chứng bệnh ghẻ thường củ khoai tây 1.2 Cấu trúc hóa học loại Thaxtomins 12 2.1 Cấu trúc Vector pPS1-poMir9 26 3.1 Kết điện di sau PCR nhân gen dòng khoai tây chuyển gen sử dụng cặp mồi pPSI 3071, pPSI 3440 3.2 37 Kết điện di sau PCR kiểm tra có mặt vi khuẩn A.tumerfacens cặp mồi VirD F , VirD R. 3.3 37 Kết chiết tách DNA tổng số ( DNAesasy plant mini kit, QIA gen) 3.4 38 Kết kiểm tra PCR dòng chuyển gen cặp mồi pPS1 3071, pPS1 3440 38 3.5 Kết điện di sản phẩm sau phản ứng PCR tạo mẫu dò đặc hiệu 39 3.6 Kết điện di sản phẩm sau phản ứng cắt RE Xba1, Agarose 1%, H = 70V, 1h 39 3.7 Kết lai gen với mẫu dò poMir9 40 3.8 Hình ảnh dòng khoai tây chuyển với công thức thí nghiệm nồng độ Thaxtomin A từ 100ppm đến 600ppm sau 3.9 tuần nuôi cấy 45 Kết lây nhiễm nhân tạo với S.scabies (sau 16 tuần lây nhiễm) 47 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết đề tài Khoai tây (Solanum tuberosum L.) lương thực đóng vai trò quan trọng thứ giới. Là trồng có hàm lượng nước dinh dưỡng cao nên khoai tây dễ bị công nhiều loại sâu bệnh hại. Trong đáng ý bệnh ghẻ thường (Common scap) vi khuẩn Streptomyces Scabies công. Bệnh ghi nhận gây hại hầu hết quốc gia trồng khoai tây, có Việt Nam (Dung cs., 2003) Bệnh ghẻ thường khoai tây bệnh hại nghiêm trọng xuất tất vùng trồng khoai tây giới bao gồm: Mỹ, Ấn Độ, Châu Á Châu Phi (Waner, 2006). Ở Mỹ, bệnh ghẻ thường bệnh hại nghiêm trọng thứ khoai tây, gây thiệt hại cho ngành công nghiệp khoai tây khoảng 3.5 tỉ USD (Meng cs., 2012). Ở Việt Nam, hầu hết vùng trồng khoai tây bị ảnh hưởng bệnh (Dung cs., 2003). Các biện pháp phòng chống bệnh như: không dùng phân chuồng, tăng cường tưới nước giảm pH đất thực tế không cho hiệu rõ rệt, đồng thời gây tác động xấu đến môi trường giảm tính bền vững hệ thống nông nghiệp. Hiện có giống khoai tây thương mại có tính kháng bệnh cao, khả phát triển giống kháng bệnh lại gặp khó khăn chưa tìm thấy nguồn gen kháng bệnh loài khoai tây Solanum tuberosum. Trong nỗ lực nhằm tạo giống kháng bệnh thông qua lai tạo truyền thống chưa có kết quả, việc sử dụng công nghệ gen cung cấp công cụ hiệu để nâng cao tính kháng khoai tây bệnh này. Yếu tố gây độc Streptomyces Scabies (S.scabies) xác định Thaxtomin A (TA) – loại phytotoxin ức chế sinh tổng hợp cellulose. Cùng với phát này, Scheible cộng (2003) tìm đột biến gene kháng TA Arabidopsis, gọi txr1. Gen tương ứng với đột biến gen TXR1. Đồng thời, sử dụng công cụ Blast (NCBI) cho thấy TXR1 có mức tương đồng cao loài thực vật khác, cà chua, đậu tương, ngô, lúa lúa mì… (khoảng từ 73 đến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vivo. Đối với dòng khoai tây chuyển gen mà đánh giá, khả kháng lại thaxtomin A cao đối chứng không chuyển gen. Do đó, để khẳng định tính kháng hiệu hoạt động miRNA hay tính kháng tập nhiễm tiến hành lây nhiễm nhân tạo với S.scabies để đánh giá khả kháng bệnh dòng khoai tây chuyển gen điều kiện in vivo theo phương pháp Wanner Haynes (2006). Theo phương pháp này, số gây bệnh vi khuẩn S.scabies củ khoai tây lớn 20 đánh giá bị nhiễm bệnh. Sau tháng lây nhiễm, kết đánh giá thể bảng 3.2 hình 3.9 cho thấy giống khoai tây không chuyển gen Atlantic lây nhiễm với S.scabies biểu triệu chứng đặc trưng bệnh ghẻ thường như: vết bệnh sần sùi, hóa bần lan rộng bề mặt củ…thì dòng chuyển gen D1, D2, D89 lây nhiễm không lây nhiễm; Atlantic không lây nhiễm với S.scabies hoàn toàn không biểu bệnh. Bên cạnh đó, số gây bệnh vi khuẩn S.scabies tất dòng chuyển gen giống khoai tây Atlantic 27.5 >20. Điều chứng tỏ, giống Atlantic mẫn cảm với bệnh ghẻ thường dòng chuyển gen mang cấu trúc pPS1- poMir9 D1-At-Po9, D2-At-Po9, D89-At-Po9 tạo có khả kháng lại tác nhân gây bệnh S.scabies. Bảng 3.2: Chỉ số gây bệnh giống Atlantic dòng chuyển gen vi khuẩn S.scabies (sau 16 tuần theo dõi) Dòng Chỉ số gây bệnh (I) Đánh giá At- không lây nhiễm Không bị bệnh At-scab 27.5 Bị bệnh D1- không lây nhiễm Không bị bệnh D1-scab Không bị bệnh D2- không lây nhiễm Không bị bệnh D2-scab Không bị bệnh D89-không lây nhiễm Không bị bệnh D89-scab Không bị bệnh Ghi I>= 20: bị bệnh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46 Kết lây nhiễm nhân tạo phù hợp với kết đánh giá tính mẫn cảm với thaxtomin A. Như vây, khẳng định tính mẫn cảm với thaxtomin A thông qua số chiều cao chồi có tương quan chặt chẽ với tính mẫn cảm hay kháng bệnh ghẻ thường vi khuẩn S. Scabies gây nên. Kết bước đầu khẳng định tính kháng bệnh ghẻ thường dòng chuyển gen hoạt động miRNA nhân tạo thiết kế. Atlantic D1 D2 D89 Khôn g lây nhiễm Lây nhiễm Hình 3.9: Kết lây nhiễm nhân tạo với S.scabies (sau 16 tuần lây nhiễm) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Đã kiểm tra thành công mức độ phân tử thông qua kiểm tra PCR dòng khoai tây chuyển gen D1- At poMIR9, D2 - At poMIR9 D89 – At poMIR9 mang cấu trúc pPS1-poMIR9 ức chế biểu gen ứng viên TXR1 khoai tây. Nồng độ Thaxtomin A mức 400 ppb (0.4mg/ml) xem nồng độ chọn lọc cho khả chống chịu khoai tây chuyển gen thuộc giống Atlantic. Với nồng độ dòng chuyển gen D1- At poMIR9, D2 - At poMIR9 D89 – At poMIR9 có chiều cao tương đối > 50%, mức coi có khả chống chịu với Thaxtomin A, đó, đặc biệt dòng D2 At poMIR9 dòng có khả chống chịu cao nhất. Ba dòng chuyển gen D1- At poMIR9, D2 - At poMIR9 D89 – At poMIR9 biểu triệu chứng điển hình bệnh ghẻ thường với số gây bệnh tính 0, đó, vi khuẩn Streptomyces Scabies lại gây triệu chứng bệnh điển hình giống khoai tây Atlantic không chuyển gen với số gây bệnh 27.5 (>20) Sự thống kết lây nhiễm nhân tạo in vivo với tác nhân gây bệnh ghẻ thường khoai tây vi khuẩn Streptomyces Scabies kết kiểm tra in vitro, kiểm tra phân tử bước đầu khẳng định dòng chuyển gen D1- At poMIR9, D2 - At poMIR9 D89 – At poMIR9 mang cấu trúc pPS1 – poMIR9, cấu trúc gen chuyển vào có hoạt động tạo thành tính kháng bệnh ghẻ thường khoai tây, đồng thời hoạt động cấu trúc gen chuyển vào không gây ảnh hưởng đến hoạt động gen chức khác khoai tây. 2. Kiến nghị Tiếp tục tiến hành đề tài theo hướng chuẩn hoá quy trình Southern Blot với dòng D1- At poMIR9 D89 – At poMIR9 kết thống Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 Tiến hành nhân giống invitro để thu chuyển gen với số lượng lớn, chất lượng đồng quan trọng kiểm soát gen chuyển vào không bị thất thoát để tiến hành trồng thí nghiệm quy mô đồng ruộng. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: 1. Ngô Thị Thanh Hiền (2012). Tạo khoai tây chuyển gen mang cấu trúc miRNA nhằm ức chế biểu gen TXR1 phục vụ công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh ghẻ thường. Khóa luận tốt nghiệp. 2. Phạm Thị Lan Hương (2011). Nhân dòng gen TXR1 khoai tây bước đầu thiết kế vector amiRNA. Khóa luận tốt nghiệp. 3. Phan Thị Ngân, (2013). Chọn lọc đánh giá dòng khoai tây chuyển gen với cấu trúc miRNA nhân tạo thiết kế đặc hiệu nhằm nâng cao tính kháng bệnh ghẻ thường. Khóa luận tốt nghiệp. 4. Nguyễn Thị Thùy Linh (2010). Nhân dòng gen ứng viên liên quan đến tính kháng bệnh ghẻ củ vi khuẩn Streptomyces scabies khoai tây bước đầu xác định chức chúng công nghệ miRNA. Khóa luận tốt nghiệp. Vũ Triệu Mân, (2007). Bệnh nấm hại rau. Trong: Giáo trình Bệnh chuyên khoa. Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, 233 trang. 5. Tiếng Anh: 6. Abdolhamid AS, Hedayati SS, Poor RH, Poor SS, Shima S, Safoura M. (2010). Application of RNA interference in plants. Plant Omics J. 3:77–84. 7. Acuna, I.A., Strobel, G.A., Jacobsen, B.L., and Corsini, D.L. (2001). Glucosylation as a mechanism of resistance to thaxtomin A in potatoes. Plant Sci. 161: 77–88. 8. Agrios G. (2005). Plant pathology, 5th edn. Elsevier Academic, New York 9. Alam, Z. (1972). Inheritance of scab resistance in 24-chromosome potatoes. Ph.D. diss. Univ. of Wisconsin. Diss. Abstr. Int. B 32: 6764-6765. 10. Alexander A.T. Johnson1 & Richard E. V. (2003). Integration of transgenes into sexual polyploidization schemes for potato (Solanum tuberosum L.). Euphytica 133: 125–138. 11. Alvarez, J.P., Pekker, I., Goldshmidt A., Blum E., and Amsellem Z. (2006). Endogenous and synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species. Plant Cell. 18: 1134–1151. 12. Axtell MJ, Bowman JL. (2008). Evolution of plant microRNAs and their targets. Trends Plant Sci. 13:343–349. 13. Banks, E. (2004). Potato field guide. Publication 823, Queen’s printer for Ontario. Ministry of Agriculture and Food, Ontario, Canada 14. BATS (2003). Genetically modified crops. Molecular and Regulatory details. http://www.gmo-watch.org 15. Bjor, T. (1974). Modification of a method for testing for resistance to common scab. Potato Research. 17:355. 16. Bjor, T. and Roer, L. (1980). Testing the resistance of potato varieties to common Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 scab. Potato Research. 23: 33-47. 17. Bouchek-Mechiche K, Gardan L, Normand P, Jouan B (2000a) DNA relatedness among strains of Streptomyces pathogenic to potato in France: description of three new species, S. europaeiscabiei sp nov, and S. stelliscabiei sp. nov associated with common scab, and S. reticuliscabiei sp nov associated with netted scab. Int J Syst Evol Microbiol 50:91–99 18. Brodersen P, Voinnet O. (2006). The diversity of RNA silencing pathways in plants. Trends Genet. 22:268–280. 19. Bukhalid RA, Loria R (1997) Cloning and expression of a gene from Streptomyces scabies encoding a putative pathogenicity factor. J Bacteriol 179(24):7776–7783 20. Bukhalid, R. A.; Chung, S. Y.; Loria, R. nec1, a gene conferring a necrogenic phenotype, is conserved in plant-pathogenic Streptomyces spp. and linked to a transposase pseudogene. Mol. Plant-Microbe Interact. 1998, 11, 660-967. 21. Burlingame B, Mouillé B, Charrondiére UR (2009) Review: nutrients, bioactive nonnutrients and anti-nutrients in potatoes. J Food Compos Anal 22:494–502 22. Chater KF (2006) Streptomyces inside-out: a new perspective on the bacteria that provide us with antibiotics. Philos Trans Biol Sci 361(1469):761–768 23. Chater KF, Biró S, Lee KJ, Palmer T, Schrempf H (2010) The complex extracellular biology of Streptomyces. FEMS Microbiol Rev 34(2):171–198 24. Cipar, M.S., Lawrence, C.H. (1972). Scab resistance of hapoids from two Solanum tuberosum cultivars. Amer. Potato J. 49:117-119. 25. Conn, K. L. and Lazarovits, G. (1998). Impact of animal manures on verticillium wilt, potato scab, and soil microbial populations. Can. J. Plant Pathol. 21: 81 92. 26. Curwen, D, Groskopp, M. D. (1978). Effects of PCNB and irrigation programs on incidience of scab (Streptomyces scabies) on Russet Burbank potatoes. American Potato J. 55 (7): 373-373. 27. Dees MW, Somervuo P, Lysøe E, Aittamaa M, Valkonen JPT (2012) Species identification and microarraybased comparative genome analysis of Streptomyces species isolates from potato scab lesions in Norway. Mol Plant Pathol 13:174– 186 28. Dionne, L. A. and Lawrence, C. H. (1961). Early scab resistant derivatives of Solanum chacoense X Solanumphureja. Amer. Potato J. 38:6-8. 29. Dung, D.T. and Suyama, H.Y.K. (2003). Susceptibility of different potato varieties against potato common scab in Viet Nam. J. ISSAAS. 9: 40-46. 30. FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) (2009b) The state of food insecurity in the world 2009. FAO, Rome. http://www.fao.org/docrep/012/i0876e/i0876e.pdf 31. FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) (2010) Strengthening potato value chains: technical and policy options for developing countries. http://www.fao.org/docrep/013/i1710e/i1710e00.pdf 32. FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) (2011) The state of Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 food insecurity in the world 2011. http://www.fao.org/docrep/014/i2330e/i2330e00.pdf FAO, Rome. 33. FAOSTAT (2011) World potato production quantity (tonnes), yields and harvested areas for 2009. http://faostat.fao.org/site/567 Accessed 16 Aug 2011 34. Fenselau F, Jiawei W, Detlef W. (2012). MIGS: miRNA-induced gene silencing. Plant J. 70:541–547. 35. Flores-González R, Velasco I, Montes F (2008) Detection and characterization of Streptomyces causing potato common scab in Western Europe. Plant Pathol 57(1):162–169 36. Goyer, C., and Beaulieu, C. (1997). Host Range of Streptomyces stains causing common scab. Plant Disease. 81:901-904 37. Haverkort AJ (1990) Ecology of potato cropping systems in relation to latitude and altitude. Agric Systems 32:251–272 38. Healy, F. G.; Krasnoff, S. B.; Wach, M.; Gibson, D. M.; Loria, R. Involvement of cytochrome P450 monooxygenase in thaxtomin A biosynthesis in Streptomyces acidiscabies. J. Bacteriol. 2002, 184, 2019-2029. 39. Hefferon, K.L., H. Khalilian & M.G. AbouHaidar (1997). Expression of the PVY(O) coat protein (CP) under the control of the PVX CP gene leader sequence: protection under greenhouse and field conditions against PVY(O) and PVY(N) infection in three potato cultivars. Theor Appl Genet 94: 287–292. 40. Hiltunen, L. H., Alanen, M., Laakso, I., Kangas, A., Virtanen, E. and Valkonen, J. P. T. (2006). Influence of Thaxtomins in Different Combinations and Concentrations on Growth of Micropropagated Potato Shoot Cultures. J. Agric. Food Chem. 54: 3372-3379. 41. Hiltunen, L. H., Alanen, M., Laakso, I., Kangas, A., Virtanen, E. and Valkonen, J. P. T. (2011). Elimination of common scab sensitive progeny from a potato breeding population using thaxtomin A as a selective agent. Plant Pathology, 60: 426–435. 42. Hiltunen, L. H.; Weckman, A.; Ylha¨inen, A.; Rita, H.; Richter, E.; Valkonen, J. P. T. Responses of potato cultivars to the common scab pathogens, Streptomyces scabies and S. turgidiscabies. Ann. Appl. Biol. 2005, 146, 395-403. 43. Hollister, E.C. (2005). Integrated management strategies and pathogen detection in the potato-Streptomyces spp. pathosystem. Doctoral thesis, Michigan State University, East Lansing, Michigan. 44. Hooker, W.J. (1981). Common Scab. In “Compendium of potato disease”. APS Press. St.Paul, MN.p.33-34. 45. Jansky, S. H. and Rouse, D. I. (2003). Multiple disease resistance in interspecific hybrids of potato. Plant Disease. 87:266-272. 46. Jellis, G. J. (1974). Improving the reliability of screening in the field for resistance to common scab (Streptomyces scabies). Potato Research. 17:356. 47. Jones-Rhoades M.W., Bartel D. P. (2004). Computational identification of plant micro- RNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol Cell. 14:787–799. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 48. Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P. (2006). MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annu Rev Plant Biol. 57:19–53. 49. Joshi, M.V., Bignell, D.R.D., Johnson, E.G., Sparks, J.P., Gibson, D.M.and Loria, R. (2007b). The AraC/XylS regulator TxtR modulatesthaxtomin biosynthesis and virulence in Streptomyces scabies. Mol. Microbiol. 66: 633–642. 50. Katiyar AS, Jin H. (2010). Role of small RNAs in host–microbe interactions. Annu Rev Phytopathol. 48:225–246. 51. Keinath, A.P., and Loria, R. (1991). Effects of inoculum density and cultivar resistance on common scab of potato and population dynamics of Streptomyces scabies. Amer. Potato J. 68:515-524. 52. Kim Y, Cho J, Park D, Lee H, Kim J, Seo S, Shin K, Hur J, Lim C (1999) Production of thaxtomin A by Korean isolates of Streptomyces turgidiscabies and their involvement in pathogenicity. Plant Pathology Journal 15(3):168–171 53. King R, Lawrence C, Clark M, Calhoun L (1989) Isolation and characterization of phytotoxins associates with Streptomyces scabies. J Chem Soc Chem Commun 13:849–850 54. King, R. R.; Lawrence, C. H.(1996). Characterization of new thaxtomin A analogues generated in vitro by Streptomyces scabies. J. Agric. Food Chem. 44, 4, 11081110. 55. King, R. R.; Lawrence, C. H.; Clark, M. C.; Calhoun, L. A. (1989). Isolation and characterization of phytotoxins associated with Streptomyces scabies. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 13, 849-850. 56. King, R. R.; Lawrence, C. H.; Embleton, J.; Calhoun, L. A. (2003). More chemistry of the thaxtomin phytotoxins. Phytochemistry .64, 1091-1096. 57. Kreuze J.F., Suomalainen S., Paulin L., Valkonen J.P.T. (1999) Phylogenetic analysis of 16S rRNA genes and PCR analysis of the nec1 gene from Streptomyces spp. causing common scab, pitted scab, and netted scab in Finland. Phytopathology 89(6):462–469 58. Lambert D.H., Loria R. (1989a) Streptomyces acidiscabies sp. nov. Int J Syst Bacteriol 39(4):393–396 59. Lambert D. H., Loria R. Streptomyces scabies sp. nov. nom.rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39, 387-392. 60. Lapwood, D. H. (1966). The effects of soil moisture at the time potato tubers are forming on the incidence of common scab (Streptomyces scabies). Applied Biology. 58:447-456. 61. Lapwood, D. H., Hering, T. F. (1970a). Soil moisture and the infection of young potato tubers by Streptomyces scabies (common scab). Potato Research. 13:296304. 62. Lapwood, D. H., Wellings, L. W., Rosser, W. R. (1970b). The control of common scab of potatoes by irrigation. Ann. Appl. Biol. 66:397-405. 63. Lea H. Hiltune, Into Laaksa, Vladimir Chobot, Kati S.Hakala, Ana Weckman and Jari P.T. Valkonen (2006). Influence of Thaxtomins in Different Combinations and Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 Concentrations on Growth of Micropropagated Potato Shoot Cultures. J. Agric. Food Chem. 54, 3372-3379. 64. Lehtonen MJ, Rantala H, Kreuze JF, Bang H, Kuisma L, Koski P, Virtanen E, Vihlman K, Valkonen JPT (2004) Occurrence and survival of potato scab pathogens (Streptomyces species) on tuber lesions: quick diagnosis based on a PCR-based assay. Plant Pathol 53(3):280–287 65. Leiner, R.H., Fry, B.A., Carling, D.E., and Loria, R. (1996). Probable involvement of thaxtomin A in pathogenicity of Streptomyces scabies in seedlings. Phytopathology, 86: 709–13. 66. Lerat, S., Simao-Beaunoir, A.M., and Beaulieu, C. (2009). Genetic and physiological determinants of Streptomyces scabies pathogenicity. Mol Plant Pathol. 10(5): 579-85. 67. Lewis, B. G. (1970). Effects of water potential on the infection of potato tubers by Streptomyces scabies in soil. Ann. Appl. Biol. 66:83-88. 68. Lindholm, P.; Kortemaa, H.; Kokkola, M.; Haahtela, K.; Salkinoja- Salonen, M.; Valkonen, J. P. T.(1997). Streptomyces spp. Isolated from potato scab lesions under nordic conditions in Finland. Plant Dis. 81, 1317-1322. 69. Loria R, Bukhalid RA, Fry BA, King RR (1997) Plant pathogenicity in the genus Streptomyces. Plant Dises 81(8):836–846 70. Loria R, Kers J, Joshi M (2006) Evolution of plant pathogenicity in Streptomyces. Annu Rev Phytopathol 44:469–487 71. Loria, R., Bukhalid, R. A., Fry, B. A., King, R. R. (1997). Plant pathogenicity in the genus Streptomyces. Amer. Phytopath. Soc. 81:836-846. 72. Loria, R., Coombs J.T., Yoshida M., Kers J., and Bukhalid R. (2003). A paucity of bacterial root diseases: Streptomyces succeeds where others fail. Physiological and Molecular Plant Pathology . 62 : 65-72 73. Loria, R., Bignell, D.R., Moll, S., Huguet-Tapia, J.C., Joshi, M.V., Johnson, E.G., Seipke, R.F., and Gibson, D.M. (2008). Thaxtomin biosynthesis: the path to plant pathogenicity in the genus Streptomyces. Antonie Van Leeuwenhoek. 94(1): 3-10. 74. Loria, R.; Bukhalid, R. A.; Creath, R. A.; Leiner, R. H.; Olivier, M.; Steffens, J. C. (1995).Differential production of thaxtomins by pathogenic Streptomyces species in vitro. Phytopathology. 85, 537-541. 75. Lui, D., Anderson, N. A., Kinkel, L. L. (1995). Biological Control of Potato Scab in the Field with Antagonistic Streptomyces scabies. Amer. Phytopath. Soc. 85:827831. 76. Lui, D., Anderson, N. A., Kinkel, L. L. (1996). Selection and characterization of strains of Streptomyces suppressive to the potato scab pathogen. Can. J. of Micro. 42:487-502. 77. Lutaladio N, Castaldi L (2009) Potato: the hidden treasure. J Food Compos Anal 22:491–493 78. Maki-Valkama, T., T. Pehu, A. Santala, J.P.T. Valkonen, K. Koivu, K. Lehto & E. Pehu (2000). High level of resistance to potato virus Y by expressing P1 sequence in antisense orientation in transgenic potato. Mol Breed 6: 95–104. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 79. Mansoor.M, Imran.A, Mazhar.H, Yusuf Z, Rob W Briddon. (2006). Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends Plant Sci. 11(11):559–565. 80. McIntosh, A. H., Bateman, G. L., Chamberlain, K. (1988). Substituted benzoic and picolinic acids as foliar sprays against potato common scab. Ann. App. Biol. 112: 397- 401. 81. McKee, R. K. 1958. Assessment of the resistance of potato varieties to common scab. Eur. Potato J. 1: 65-80. 82. Meng, Q. X., Yin, J. F., Rosenzweig, N., Douches, D., and Hao, J. J. (2012). Culture-based assessment of microbial communities in soil suppressive to potato common scab. Plant Dis. 96: 712-717. 83. Mishra AK, Agarwal S, Jain CK, Rani V. (2009). High GC content: critical parameter for predicting stress regulated miRNAs in Arabidopsis thaliana. Bioinformation. 4:151–154. 84. Miyajima K, Tanaka F, Takeuchi T, Kuninaga S .(1998). Streptomyces turgidiscabies sp. nov. Int J Syst Bacteriol 48(2):495–502 85. Mohammed, A., D.S. Douches, W. Pett, E. Grafius, J. Coombs, L.W. Liswidowati & M.A. Madkour, (2000). Evaluation of potato tuber moth (Lepidoptera: Gelechiidae) resistance in tubers of Bt-cry5 transgenic potato lines. J Econ Entomol 93: 472–476. 86. Murphy, A. M., DeJong, H., Tai, G.C.C. (1995). Transmission of resistance to common scab from the diploid to the tetraploid level via 4x-2x crosses in potatoes. Euphytica. 82: 227-233. 87. Nakayashiki H. 2005. RNA silencing in fungi: mechanisms and applications. Fed Eur Biochem Soc Lett. 579:5950–5970. 88. Osaki M, Matsumoto M, Shinano T, Tadano T (1996) A root-shoot interaction hypothesis for high productivity of root crops. Soil Sci Plant Nutri 42:289–301 89. Pehu, T.M., T.K. Makivalkonen, J.P.T. Valkonen, K.T. Koivu, K.M. Lehto & E.P. Pehu, (1995). Potato plants transformed with a potato-virus YP1 gene sequence are resistant to PVY-degrees. Am Potato J 72: 523–532. 90. Reddick, D. (1939). Scab Immunity. Amer. Potato J. 16:71-76. 91. Ruiz-Ferrer V, Voinnet O. (2009). Roles of plant small RNAs in biotic stress responses. Annu Rev Plant Biol. 60:485–510. 92. Sanford, G. B. (1923). The relation of soil moisture to the development of common scab of potato. Phytopathology. 13:231 -236. 93. Sanford, G. B. (1926). Some factors affecting the pathogenicity of Actinomyces scabies. Phytopathology. 16: 525-547. 94. Scheible, W.R., Barbara, F., Kochevenko, A., Schindelasch, D., Zimmerli, L., Somerville, S., Loria, R., and Somerville, C.R. (2003). An Arabidopsis Mutant Resistant to Thaxtomin A, a Cellulose Synthesis Inhibitor from Streptomyces Species. Plant Cel. 15(8):1781–1794. 95. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., and Weigel, D. (2006). Highly Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis. Plant Cel. 18:1121–1133. 96. Senthilkumar M, Mysore KS. (2011). Virus-induced gene silencing can persist for more than two years and also be transmitted to progeny seedlings in Nicotiana benthamiana and tomato. Plant Biotechnol J. 9:797–806. 97. Slack SA (1991) A look at potato leafroll virus and potato virus Y: past, present, future. Badger Common. Tater 43:16–21 98. Soltani, N., Conn, K. L., Abbasi, P.A., Lazarovits, G. (2001). Reduction of potato scab and verticillium wilt with ammonium lignosulfonate soil amendment in four Ontario potato filds. Can. J. of Plant Path. 24:332-339. 99. Song J, Lee S-C, Kang J-W, Baek H-J, Suh J-W (2004) Phylogenetic analysis of Streptomyces spp. Isolated from potato scab lesions in Korea on the basis of 16S rRNA gene and 16S–23S rDNA internally transcribed spacer sequences. Int J Syst Evol Microbiol. 54(1):203–209 100. Spooner, D. M., and J.B. Bamberg. (1994). Potato genetic resources: sources of resistance and systematics. Amer. Potato J. 71:325-337. 101. St-Onge R, Goyer C, Coffin R, Filion M (2008) Genetic diversity of Streptomyces spp. causing common scab of potato in eastern Canada. Syst Appl Microbiol 31(6– 8):474–484 102. Sturz, A. V., Ryan, D.A.J., Coffin, A. D., Matheson, B.G., Arsenault, W.J., Kimpinski, J., Christie, B.R. (2004). Stimulating disease suppression in soils: sulphate fertilizers can increase biodiversity and antibiosis ability of root zone bacteria against Streptomyces scabies. Soil Bio. and Biochem. 36:343-352. 103. Tai, G. C. C., Murphy, A., De Jong, H. (1996). Comparison of efficiency of alternative selection strategies: An example of selection for resistance to common scab in potatoes. Can. J. of Plant Sci. 76:849-852. 104. Thwaites R, Wale SJ, Nelson D, Munday D, Elphinstone JG (2010) Streptomyces turgidiscabies and S. acidiscabies: two new causal agents of common scab of potato (Solanum tuberosum) in the UK. Plant Pathol 59(4):804–804 105. Tyagi H, Rajasubramaniam S, Rajam MV, Dasgupta I. (2008). RNA interference in rice against Rice Tungro Bacilliform virus results in its decreased accumulation in inoculated rice plants. Transgenic Res. 17:897–904. 106. Umesh BJ, Ranjit GG, Vishwas AB. (2012). Role of RNA interference in plant improvement. Naturwissenschaften. 1:1913–1919. 107. Waksman SA, Henrici AT (eds) (1948) Family II. Actinomycetaceae, Buchanan and family Streptomycetaceae, Waksman and Henrici. Bergey’s manual of determinative microbiology, 6th edn. Williams and Wilkins, Baltimore 108. Wang A, Lazarovits G. (2005) Role of seed tubers in the spread of plant pathogenic Streptomyces and initiating potato common scab disease. Am J Potato Res 82:221–230 109. Wanner LA. (2009) A patchwork of Streptomyces species isolated from potato common scab lesions in North America. Am J Potato Res 86(4):247–264 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 110. Wanner, L. A (2006). Survey of Genetic Variation in Streptomyces Isolates Causing Potato Common Scab in the United States. Phytopathology, 96:1363-1371. 111. Warthmann N, Chen H, Ossowski S, Weigel D, Hervé P. (2008). Highly specific gene silencing by artificial miRNAs in rice. PLoS One.3(3):e18-29. 112. Wiersema, H.T. (1970). A reliable method for testing scab resistance in the green house. P.210-212. In Proceedings of the 4th Triennial Conference of the European Association for Potato Research. Brest, France. 8-13 Sept. 1969. Inst. Natl, de la Recherche Agronomique Publ. 70-5, Paris. 113. Wilson CR, Ransom LM, Pemberton BM (1999) The relative importance of seedborne inoculum to common scab disease of potato and the efficacy of seed tuber and soil treatments for disease control. J Phytopathol 147(1):13–18 114. Wilson, C. R., G. A. Luckman, R. S. Tegg, Z. Q. Yuan, A. J. Wilson, A. Eyles, A. J.Conner (2009). Enhanced resistance to common scab of potato through somatic cell selection in cv. Iwa with the phytotoxin thaxtomin A. Plant Pathology, 58: 137–144. 115. Xinshun Qu, Leslie A. Wanner, and Barbara J. Christ (2008). Using the TxtAB operon to quantify pathogenic Streptomyces in potato tubers and soil. Phytopathology, 98, 405. 116. Ylha¨inen, A. Perunarupibakteerien takstomiinit (Thaxtomins produced by potato scab pathogens). M.Sc. thesis, Department of Applied Biology, University of Helsinki, Finland, 2001 (in Finnish). 117. Zhao WQ, Liu DQ, Yu XM (2008) First report of potato scab caused by Streptomyces turgidiscabies in China. Plant Dis 92(11):1587 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng đánh giá diện tích tác động bệnh ghẻ thường (Merz.U,2002) - Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 Phụ lục 2: Bảng hóa chất sử dụng phương pháp lai Southern Blot (theo quy trình kit “DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I”, hãng Roche) Dung dịch Hỗn hợp đánh dấu-DIG (DIG –labeling mix) Thành phần DIG-High Prime DIG-labeled Control DNA Đệm hòa tan DNA (DNA Dilution Buffer) Dung dịch kháng thể Anti-Digoxigenin – AP pha dung dịch khóa (Antibody solution) tỷ lệ 1:5000 Dung dịch chất màu NBT/BCIP Dung dịch khóa (Blocking solution) Dung dịch gốc % SDS (Roche) đệm Maleic Dung dịch tiền lai (Pre - nước cất hai lần hybridization solution) DIG Easy Hyb dạng hạt Dung dịch lai Mẫu dò đánh dấu DNA (Hybridization solution) DIG Easy Hyb (pre-hybridization) Dung dịch Depurinizing 0.25 M HCl Dung dịch biến tính 0.5 M NaOH (Denaturation solution) 1.5M NaCl Dung dịch trung hòa 0.5 M Tris-HCl pH 7.5 (Neutralization solution) M NaCl Đệm Maleic acid 0.1 M Maleic acid, 0.15 M NaCl, pH 7.5 Đệm rửa (Washing buffer) Đệm Maleic Acid 0.3 % Tween20 Đệm phát (Detection 100 mM Tris-base, pH 9.5 buffer) 100 mM NaCl Dệm TE (TE buffer) 10 mM Tris – HCl Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 mM EDTA, pH 8.0 Dung dịch 10 % SDS 10 g SDS Nước cất lần 100 ml Đệm 20X SSC M NaCl (20X SSC buffer) 0.3 M sodium citrate, pH 7.5 100 ml đệm 20 X SSC X SCC + 0.1 % SDS 10 ml 10 % SDS Lên thể tích 1000 ml với nước cất lần 25 ml đệm 20 X SSC 0.5 X SCC + 0.1 % SDS 10 ml 10 % SDS Lên thể tích 1000 ml với nước cất lần ml đệm 20 X SSC 0.1 X SCC + 0.1 % SDS 10 ml 10 % SDS Lên thể tích 1000 ml với nước cất lần Đệm tẩy màu (Stripping 0.2 M NaOH buffer) 0.1 % SDS Dimethylformamid (DMF) NH4 – acetate 7.5M Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 Phụ lục 3: Thang đo kích thước DNA ( ladder 1kb 100 bp) Thang chuẩn 1kb Thang chuẩn 100bp Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 [...]... các amir lên vi c hình thành tính kháng bệnh ở dòng khoai tây chuyển gen, tạo tiền đề cho vi c sản xuất giống khoai tây kháng bệnh ghẻ thường do vi khuẩn S.scablies gây ra Học vi n Nông nghiệp Vi t Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc gen chuyển vào các dòng khoai tây bằng PCR và Southern blot Đánh giá in vitro các dòng chuyển gen thông... để đánh giá đồng bộ ở cả ba mức là đánh giá phân tử, đánh giá in-vitro và đánh giá in-vivo một số dòng khoai tây chuyển gen để bước đầu khẳng định các dòng khoai tây đã được chuyển gen thành công và đánh giá được tính kháng bệnh ghẻ thường của các dòng này 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung Đánh giá đồng bộ ở cả 3 phương diện là phân tử, in vitro, in vivo các dòng chuyển gen để kết luận được... nghiên cứu nào về chuyển gen miRNA vào khoai tây kháng bệnh do vi khuẩn gây ra Tuy nhiên, trên khoai tây, người ta đã ứng dụng công nghệ RNAi thành công trong vi c tạo các giống kháng virus như: kháng virus PVX (Angell và Baulcombe, 1997) và PVY (Missiou và cs., 2004) Bên cạnh đó, vi c chuyển gen RNAi nhằm tới các mục tiêu tính trạng nông sinh học cũng được công bố: dòng khoai tây có gen tổng hợp patatin... Maki-Valkama và cs., 2000; Pehu và cs., 1995) Các chiến lược phòng chống bệnh do virus ở khoai tây bằng phương pháp chuyển gen sản xuất protein vỏ của virus đã thu được các dòng khoai tây kháng bệnh hiệu quả (Barler và cs., 1999; Spillane và cs., 1998) và ứng dụng công nghệ RNAi cũng được áp dụng trong vi c kháng bệnh do virus gây ra với công trình của Alexander và cộng sự năm 2003 Khoai tây biến đổi di truyền... và không bị chết ngay cả trong điều kiện bị đóng băng (Bank, 2004); bệnh ghẻ thường do Streptomyces scabies với vi c gây hại trực tiếp lên củ và có thể tồn tại lâu trong đất và truyền bệnh cho vụ sau 1.2 Bệnh ghẻ thường khoai tây (Common scab potato) và vi khuẩn Streptomyces Có hơn 400 loài được xác định thuộc chi Streptomyces nhưng chỉ một số ít trong đó được xác định là tác nhân gây bệnh (Loria và. .. dụng của miRNA trên cây khoai tây Khoai tây được coi là một hệ thống mô hình chuyển gen vì khả năng tiếp nhận Agrobacterium và tái sinh từ bất kỳ một bộ phận nào của cây Hơn nữa, khoai tây được nhân giống vô tính do đó không có bất kỳ vấn đề nào về lo ngại sự phân ly, làm mất hay chuyển gen ngang các thông tin di truyền (Montanelli và Nascari., 1990) Vi c chuyển gen vào khoai tây được thực hiện đã từ... 2011; Ngô Thị Thanh Hiền, 2012) và đã chuyển gen thành công 1 vector miRNA cho 3 dòng khoai tây (Ngô Thị Thanh Hiền, 2012), bước đầu đánh giá biotest 3 dòng chuyển gen ở mức độ chống chịu với TA và tiến hành lây nhiễm nhân tạo ở 3 dòng chuyển gen đều cho kết quả khả quan (Phan Thị Ngân, 2013) Để khẳng định sự có mặt của cấu trúc miRNA được chuyển vào 3 dòng khoai tây và sự hoạt động của cấu trúc này... qua khả năng chịu độc đối với TA Đánh giá in vivo các dòng chuyển gen thông qua lây nhiễm nhân tạo với tác nhân gây bệnh là S.scablies 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đây là nghiên cứu đầu tiên của Vi t Nam ứng dụng công nghệ RNAi nhằm phòng chống bệnh ghẻ thường ở cây khoai tây Nghiên cứu đã chứng tỏ được 3 dòng khoai tây D1-At-Po9, D2-At-Po9 và D89-At-Po9 chuyển gen có biểu hiện kháng bệnh. .. sinh Bệnh ghẻ thường được gây ra bởi một loại vi khuẩn Gram (+) thuộc chi Streptomyces, đây được đánh giá là một bệnh gây hại nghiêm trọng trên khoai tây Bệnh chủ yếu gây ảnh hưởng đến chất lượng củ và tạo nên các vết tổn thương tùy mức độ trên bề mặt củ Bệnh ghẻ thường được đánh giá là một trong 5 loại dịch hại hàng đầu trên khoai tây trồng ở Mỹ (Slack, 1991) Streptomyces scablies là vi khuẩn đất, tuy... rộng và tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh (Reiette Gouws, 2006) Nhìn chung, tổn thương do ghẻ trên củ khoai tây có thể được phân thành 3 loại: ghẻ nâu đỏ; ghẻ lồi với những vết lồi khoảng 1-2 mm; ghẻ sao với những vết bệnh sâu đến 7mm (Hooker, 1981) Hình 1.1 Triệu chứng bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây (nguồn Steven B Johnson và David Lambert 2010) • Nguyên nhân gây bệnh và đặc tính phát sinh Bệnh ghẻ . DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VI N NÔNG NGHIỆP VI T NAM TRẦN VI T HÀ PHÂN TÍCH PHÂN TỬ VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GHẺ THƯỜNG DO VI KHUẨN STREPTOMYCES SCABIES Ở MỘT SỐ DÒNG. của các amir lên vi c hình thành tính kháng bệnh ở dòng khoai tây chuyển gen, tạo tiền đề cho vi c sản xuất giống khoai tây kháng bệnh ghẻ thường do vi khuẩn S.scablies gây ra. Học vi n Nông. đồng bộ ở cả ba mức là đánh giá phân tử, đánh giá in-vitro và đánh giá in-vivo một số dòng khoai tây chuyển gen để bước đầu khẳng định các dòng khoai tây đã được chuyển gen thành công và đánh