khảo sát chất lượng và khả năng kháng bệnh bạc lá tập đoàn các mẫu giống lúa nếp mới thu thập bằng chỉ thị phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC    BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: Khảo sát chất lượng và khả năng kháng bệnh bạc lá tập đoàn các mẫu giống lúa nếp mới thu thập bằng chỉ thị phân tử Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS. Phan Hữu Tôn KS. Tống Văn Hải Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng Khoa Công nghệ sinh học - Trường ĐHNN HN Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Hồng Nhung Mã sinh viên : 510281 Lớp : CNSH - K51 “Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học". HÀ NỘI - 2010 ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn PGS.TS. Phan Hữu Tôn, người đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo KS. Tống Văn Hải và các thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2010 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Nhung i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi TÓM TẮT vii PHẦN I MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Nguồn gen lúa địa phương và vấn đề bảo quản nguồn gen cây lúa. 3 2.1.1. Đặc điểm của lúa địa phương 3 2.1.2. Hiện trạng và việc sử dụng nguồn gen địa phương 3 2.1.3. Các hướng sử dụng nguồn gen lúa địa phương 4 2.2. Nghiên cứu về chất lượng gạo 5 2.2.1. Nghiên cứu về tính trạng mùi thơm 5 2.2.2. Nhiệt độ hóa hồ và độ phá hủy kiềm 8 2.2.3. Chiều dài, chiều rộng và tỉ lệ dài/rộng của hạt 9 2.3. Nghiên cứu về bệnh bạc lá 10 2.3.1. Tác hại của bệnh 10 2.3.2. Triệu chứng bệnh 11 2.3.3. Nguyên nhân gây bệnh 12 2.3.4. Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh bạc lá 13 2.3.5. Biện pháp phòng trừ 14 2.4. Cơ sở khoa học của chọn giống lúa kháng bạc lá 15 2.4.1. Cơ sở di truyền tính kháng bệnh bạc lá lúa 15 2.4.3. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng bệnh bạc lá 18 PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 22 3.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 3.2. Nội dung nghiên cứu 23 ii 3.3. Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng 23 3.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học cơ bản 23 3.3.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá 24 3.3.4. Phương pháp đánh giá chất lượng 28 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá 31 4.1.1. Kết quả lây nhiễm nhân tạo 31 4.1.2. Kết quả PCR kiểm tra gen kháng bạc lá 34 4.1.3. So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo 37 4.2. Kết quả đánh giá chất lượng 40 4.2.1. Kết quả chất lượng thương trường của gạo 40 4.2.2. Kết quả đánh giá mùi thơm và khả năng mang gen mùi thơm 44 4.3. Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học 47 4.3.1. Thời gian sinh trưởng 47 4.3.2. Chiều cao cây 50 4.3.3. Khả năng đẻ nhánh, tỉ lệ nhánh hữu hiệu 51 4.3.4. Đặc điểm hình thái của lá đòng 53 4.3.5. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 54 4.3.6. Đặc điểm chiều dài bông 57 4.3.7. Đặc điểm hình thái hạt 58 4.4. Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu 59 4.4.1. Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu kháng bệnh bạc lá 59 4.2.2. Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu chất lượng tốt 60 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 5.1. Kết luận 63 5.2. Đề nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 63 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT - BAC Bacterial Artificial Chromosome - nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn. - BAD2 Enzyme betaine aldehyde dehydrogenase 2. - EAP External antisense primer - mồi ngoại biên của cặp mồi phát hiện gen fgr. - ESP External sense primer- mồi ngoại biên của cặp mồi phát hiện gen fgr. - GBSS Grainule bound starch synthase - enzyme tổng hợp amylose - IFAP Internal fragrant antisense primer - mồi nội biên của cặp mồi phát hiện gen fgr. - INSP Internal non-fragrant sense primer- mồi nội biên của cặp mồi phát hiện gen fgr. - IRRI International Rice Research Institute - Viện nghiên cứu lúa quốc tế - KDML Giống lúa Khao Dawk Mali - NST Nhiễm sắc thế. - PCR Polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp, kĩ thuật chỉ thị phân tử nhằm nhân một đoạn DNA đã biết trước trình tự. - RFLP Restriction fragment length polymorphism - sự đa hình về chiều dài của những đoạn cắt giới hạn. - SNPs Single nucleotide polymorphisms - hiện tượng đa hình đơn nucleotide. - SS Starch synthase - enzyme tổng hợp tinh bột - SSRs simple sequence repeats - kỹ thuật chỉ thị phân tử nhằm nhân hoặc lai các đoạn lặp DNA lặp đi lặp lại trong genome. iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Phản ứng của các dòng đẳng gen với các chủng vi khuẩn 31 Bảng 2. So sánh kết quả xác định gen kháng bằng PCR và kết quả lây nhiễm nhân tạo của các mẫu giống 37 Bảng 3. Chất lượng xay xát của gạo 40 Bảng 4. Kích thước hạt gạo 41 Bảng 5. Nhiệt độ hóa hồ và độ phá hủy kiềm 43 Bảng 6. So sánh kết quả đánh giá mùi thơm bằng phương pháp sử dụng KOH 1,7% và kết quả kiểm tra gen fgr bằng phương pháp PCR. 46 Bảng 7. Thời gian sinh trưởng của các mẫu giống 48 Bảng 8. Chiều cao cây của các mẫu giống 50 Bảng 9. Số nhánh tối đa, số nhánh hữu hiệu, tỷ lệ nhánh hữu hiệu 52 Bảng 10. Chiều dài và chiều rộng lá đòng 53 Bảng 11. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 54 Bảng 12. Chiều dài bông lúa 57 Bảng 13. Chiều dài, chiều rộng hạt thóc và tỷ lệ Dài/Rộng 58 Bảng 14. Đặc điểm của 6 mẫu giống kháng bạc lá được chọn 59 Bảng 15. Đặc điểm của 3 mẫu giống chất lượng tốt được chọn 60 v DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hoạt động của bộ 4 mồi được mô tả trong nghiên cứu của Bradburry và cộng sự (2005) 8 Hình 2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IR24 32 Hình 3. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB4 32 Hình 4. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB5 33 Hình 5. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB7 33 Hình 6. Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Xa4, sử dụng cặp mồi MP2 35 Hình 7. Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Xa7, sử dụng cặp mồi P3 36 Hình 8. Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen xa5, sử dụng cặp mồi RG556 trước cắt enzym DraI 36 Hình 9. Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen xa5, sử dụng cặp mồi RG556 sau khi cắt enzym DraI 37 Hình 10. Nhiệt độ hóa hồ và độ phá hủy kiềm của hạt gạo 44 Hình 11. Điện di sản phẩm PCR xác định mẫu giống mang gen fgr 45 vi TÓM TẮT Để đảm bảo an ninh lương thực thì việc chọn tạo giống lúa có năng suất cao là vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, chỉ nâng cao năng suất là chưa đủ, nhu cầu về giống lúa hiện nay phải là những giống hội tụ đủ 3 yếu tố năng suất cao, chất lượng tốt và kháng sâu bệnh hiệu quả. Muốn chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt và kháng sâu bệnh thành công thì nguồn gen đóng vai trò rất quan trọng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát chất lượng và khả năng kháng bệnh bạc lá tập đoàn các mẫu giống lúa nếp mới thu thập bằng chỉ thị phân tử DNA. Chúng tôi tiến hành khảo sát, đánh giá các đặc điểm nông sinh học, các chỉ tiêu chất lượng, gen mùi thơm, gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7. Từ đó tuyển chọn một số mẫu giống triển vọng để khảo nghiệm và những mẫu giống có phẩm chất tốt, khả năng kháng bạc lá và năng suất cao. Sử dụng chỉ thị MP2 phát hiện gen kháng Xa4, chỉ thị RG556 phát hiện gen kháng xa5, chỉ thị P3 phát hiện gen kháng Xa7, dùng cặp mồi ESP và IFAP phát hiện gen thơm fgr. Kết quả đã phát hiện được 21 mẫu giống chứa gen Xa4, 6 mẫu giống chứa gen xa5, 23 mẫu giống chứa gen Xa7 và 5 mẫu giống chứa gen thơm fgr. Lây nhiễm nhân tạo cho thấy kết quả PCR là chính xác. Kết quả đánh giá chất lượng và đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống thấy các giống lúa địa phương vô cùng đa dạng và phong phú. Từ đó tuyển chọn được 9 mẫu giống tương đối tốt, trong đó có 6 mẫu giống vừa có khả năng kháng bệnh vừa có tiềm năng cho năng suất cao và 3 mẫu giống có chất lượng tốt, có tiềm năng năng suất. vii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Gạo nếp được sử dụng rất rộng rãi ở nước ta và nó là nguyên liệu không thể thiếu trong các ngày lễ hội, các ngày tết, ma chay, chiếm 10% diện tích trồng lúa, đặc biệt là ở nhiều vùng dân tộc thiếu số gạo nếp được sử dụng là lương thực chính thay gạo tẻ, hơn nữa giá thành lúa nếp lại cao. Vì vậy, sản xuất lúa nói chung và lúa nếp nói riêng đã, đang và vẫn còn là một ngành quan trọng nhất trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn nước ta. Việt Nam là một trong những trung tâm khởi nguyên của cây lúa nên quỹ gen lúa vô cùng phong phú. Đặc biệt ở nước ta cũng tồn tại rất nhiều giống lúa nếp địa phương mang gen kháng bạc lá, có những tính trạng nông sinh học quý làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống. Thế nhưng ngày nay, do sức ép của sự gia tăng dân số, cùng với quá trình hội nhập, và cũng do tập quán canh tác cũng thay đổi… đã dẫn đến nguồn gen lúa địa phương đang có nguy cơ bị mất dần. Chính vì vậy việc thu thập, bảo tồn các giống lúa địa phương làm vật liệu cho chọn giống là rất cần thiết hiện nay. Hàng năm năng suất lúa liên tục tăng nhưng vẫn không đáp ứng đủ nhu cầu do dân số tăng nhanh. Vì vậy, để đảm bảo an ninh lương thực thì việc chọn tạo giống lúa có năng suất cao là vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, chỉ nâng cao năng suất là chưa đủ, nhu cầu về giống lúa hiện nay phải là những giống hội đủ 3 yếu tố năng suất cao, chất lượng tốt và kháng sâu bệnh hiệu quả. Vì vậy, đánh giá khách quan, chính xác và chi tiết các đặc điểm của nguồn gen là việc làm rất cần thiết, từ đó nhà chọn giống có hướng để chọn tạo giống mới thành công sau này. Muốn biết được khả năng kháng bệnh của một giống, theo phương pháp thông thường, người ta tiến hành đánh giá bệnh trong điều kiện tự nhiên và lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp cắt đầu lá. Sau đó, chờ khi lúa biểu hiện bệnh sẽ tiến hành đánh giá dựa trên phổ kháng nhiễm của các dòng đẳng gen. Tuy nhiên, 1 [...]... Khảo sát chất lượng và khả năng kháng bệnh bạc lá tập đoàn các mẫu giống lúa nếp mới thu thập bằng chỉ thị phân tử 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích - Khảo sát các đặc điểm nông sinh học của tập đoàn giống lúa nghiên cứu - Khảo sát, đánh giá chất lượng - Khảo sát, đánh giá gen mùi thơm - Khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá và khả năng mang gen kháng bạc lá Xa4, xa5, Xa7 trong tập đoàn mẫu giống. .. mẫu giống lúa nếp - Tuyển chọn một số mẫu giống triển vọng để khảo nghiệm và những mẫu giống có phẩm chất tốt, khả năng kháng bạc lá và năng suất cao 1.2.2 Yêu cầu - Tiến hành thí nghiệm khảo sát tập đoàn giống nghiên cứu, đo, đếm, đánh giá được một số đặc điểm nông sinh học - Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng - Xác định các mẫu giống có chứa gen kháng bệnh bạc lá và gen mùi thơm bằng kỹ thu t PCR -... ra những giống lúa mang nhiều gen kháng bệnh có tính kháng ngang bền vững hơn 15 2.4.1.2 Nghiên cứu về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá Nghiên cứu về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá, các nhà khoa học Nhật Bản là những người đi đầu trong lĩnh vực này Nisimura, 1961, đã có những nghiên cứu đầu tiên về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá Trong khi nghiên cứu về sự luân chuyển các giống lúa trồng... trên cơ sở của tính kháng bệnh bạc lá là do gen quy định, cho đến nay phương pháp chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá phổ biến và quan trọng nhất là phương pháp lai hữu tính, thông qua phương pháp này ta có thể chuyển những gen có khả năng kháng bệnh cao vào các giống có đặc tính nông sinh học quý thông qua Backcross Từ đó mà nhiều giống kháng bệnh đã được tạo ra Khả năng kháng bạc lá thường do đơn gen... sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ biến trong đánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa địa phương thu thập được ở duyên hải Trung bộ và đồng bằng sông Cửu Long Kết quả đã thu được 17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14 Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp chỉ 19 thị phân tử trong... xác định gen kháng (Nelson và cs, 1996), trong việc tổ hợp nhiều gen kháng để tạo thành giống chứa đa gen kháng (Huang và cs, 1997), trong chuyển gen kháng bằng phương pháp nuôi cấy mô, lai tế bào trần (Kelly, 1995) Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu... bệnh bạc lá là dùng giống kháng bệnh, xây dựng ruộng nhân giống không bệnh và điều chỉnh sinh trưởng của lúa bằng các biện pháp canh tác, nhất là kỹ thu t bón phân và nước 14 Đồng thời trên cơ sở các biện pháp đó trong các trường hợp cụ thể cần kết hợp làm tốt khâu xử lý hạt giống và dùng vôi, kali, phân hữu cơ, bón lót, bón thúc sớm, giữ nước nông, để phòng ngừa bệnh bạc lá và các bệnh khác Cho đến... hiện kháng với gen Xa4 (K.s Lee,2003) Như vậy, sự ra đời của các giống lúa kháng bệnh kéo theo sự tiến hoá của các chủng vi khuẩn, làm giảm tính bền vững của gen kháng bệnh Mục tiêu nhằm kéo dài thời gian kháng bền vững của gen kháng là vô cùng quan trọng trong công tác chọn giống kháng bệnh bạc lá Theo Tika và Mew nghiên cứu về khả năng kháng bệnh trên 11 dòng đẳng gen mang 1, 2, 3 hoặc 4 gen kháng bằng. .. dụng giống kháng bệnh vẫn là biện pháp hiệu quả nhất và có một ý nghĩa rất lớn 2.4 Cơ sở khoa học của chọn giống lúa kháng bạc lá 2.4.1 Cơ sở di truyền tính kháng bệnh bạc lá lúa 2.4.1.1 Nghiên cứu về chủng nòi và sự phát triển của bệnh bạc lá Từ những kết quả của các nghiên cứu gần đây về vi khuẩn bạc lá Xanthomonas Oryzae P.v Oryzae Cho thấy mỗi vùng, mỗi lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá. .. trồng ở Nhật Bản, ông đã phát hiện khả năng kháng bệnh bạc lá ở hai giống lúa trồng Kogyoku và kaganeman, được điều khiển bởi một gen trội nằm trên NST số 11 (Theo hệ thống thứ tự NST của ông) Tiếp theo đó IRRI cũng đã tiến hành đánh giá khả năng kháng bệnh của các giống lúa nhiệt đới, đồng thời tiến hành nghiên cứu về bản chất di truyền của khả năng kháng bệnh bạc lá là do gen quy định (Tsugufumi Ogawa, . Tôn và KS. Tống Văn Hải chúng tôi tiến hành đề tài: Khảo sát chất lượng và khả năng kháng bệnh bạc lá tập đoàn các mẫu giống lúa nếp mới thu thập bằng chỉ thị phân tử . 1.2. Mục đích và yêu. HỌC    BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: Khảo sát chất lượng và khả năng kháng bệnh bạc lá tập đoàn các mẫu giống lúa nếp mới thu thập bằng chỉ thị phân tử Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS đích - Khảo sát các đặc điểm nông sinh học của tập đoàn giống lúa nghiên cứu. - Khảo sát, đánh giá chất lượng - Khảo sát, đánh giá gen mùi thơm - Khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá và khả năng