3.3.4.1. Các thí nghiệm liên quan đến chất lượng thương trường của gạo
Các phương pháp này được tiến hành theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa của IRRI, 1996”
Tỷ lệ gạo lật, gạo trắng
- Mỗi giống 200 hạt đã phơi khô quạt sạch, ẩm độ khoảng 14%, cân khối lượng và đem đi bóc vỏ trấu, sau đó cân khối gạo sau khi bóc vỏ.
Tỷ lệ gạo lật = (KL gạo đã bóc vỏ /KL lúa ban đầu) * 100% - Từ khối lượng gạo đã bóc vỏ đem làm trắng, sau đó cân khối lượng gạo trắng
Tỷ lệ gạo trắng = (KL gạo trắng /KL lúa ban đầu) * 100% Đo chiều dài gạo xay
Hình dạng hạt gạo được đo sau khi gạo được bóc vỏ trấu, làm trắng. Theo tiêu chuẩn của IRRI (1996), có thể chia hạt gạo thành các loại sau:
Theo chiều dài gạo: Quá dài: >7,5mm Dài: 6,6 – 7,5mm Trung bình: 5,5 – 6,6mm Ngắn: <5,5mm Dạng hình gạo xay
Tiến hành đo chiều dài và chiều rộng hạt gạo trắng bằng thước pame. Mỗi giống đo 5 hạt, lấy trung bình chiều dài và chiều rộng. Dạng hình gạo xay được đánh giá bằng tỷ số dài/rộng theo tiêu chuẩn của IRRI (1996)
Dạng hình Tỷ số (D/R)
Thon dài > 3,0
Trung bình 2,1 - 3,0
Bầu 1,1 – 2,0
Mùi thơm của gạo
Lấy 10 hạt gạo trắng của mỗi giống và nghiền nhỏ. Bột gạo của mỗi giống được đặt trong một hộp kín chứa 500µl KOH 1,7% đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đánh giá mùi thơm bằng phương pháp ngửi, mức độ thơm được đánh giá bởi 5 người.
Điểm 1: Không thơm Điểm 2: Hơi thơm Điểm 3: Thơm Độ phá huỷ kiềm và nhiệt độ hoá hồ
Chỉ tiêu này được đánh giá theo phương pháp của Little, 1958, với quy trình như sau: 6 hạt gạo nguyên đã xát trắng được ngâm vào dung dịch KOH 1,7% trong 23 giờ ở nhiệt độ 30ºC.
Độ phá hủy kiềm và nhiệt độ hóa hồ của các mẫu giống được quan sát và đánh giá theo thang điểm như sau:
Thang điểm
Độ lan rộng Độ trong suốt Độ phá huỷ kiềm
Nhiệt độ hoá hồ
1 Hạt gạo còn nguyên Hạt gạo trắng bột Thấp Cao
2 Hạt gạo phồng lên Gạo trắng bột, có viền
trắng xung quanh Thấp Cao
3 Hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên hay rõ nét Hạt trắng bột, viền nhoè như bông gòn, vẩn đục Thấp - TB Cao - TB 4 Hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên hay mở rộng Tâm nhoè như bông gòn, viền vẩn đục Trung bình Trung bình 5 Hạt gạo rã ra, viền hoàn toàn và mở rộng Tâm nhoè như bông gòn, viền trong suốt Trung bình Trung bình 6 Hạt tan ra hoà chung với
viền Tâm đục, viền trong suốt Cao Thấp
7 Hoà tan ra hoàn toàn và
quyện vào nhau Tâm và viền trong suốt Cao Thấp
3.3.4.2. Kiểm tra gen mùi thơm
Chiết tách DNA
Tiến hành phản ứng PCR
- PCR sử dụng cặp mồi theo nghiên cứu của Bradbury và cs, năm 2005 có trình tự như sau:
IFAP 5’-CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC-3’
- Thành phần 20µl dung dịch phản ứng PCR gồm có: 14 μl nuclease – Free water, 2.5 μl buffer, 0.4 μl dNTP 25mM, 1 μl Primer ESP, 1 μl Primer IFAP, 0.1 μl dream taq polymerase, 1 μl DNA mẫu.
- PCR được thực hiện theo chu kỳ nhiệt như sau: 940C trong 2 phút, 34 chu kỳ, 940C trrong 30 giây, 580C trong 30 giây, 720C trong 30 giây, và 720C trong 5 phút.
Điện di sản phẩm PCR
Kết quả mẫu giống có chứa gen thơm (fgr) sẽ xuất hiện một vạch có kích thước 257bp trùng với đối chứng dương Bắc thơm và các giống không chứa gen sẽ không có vạch nhân lên giống như đối chứng âm IR64.
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
Theo các nghiên cứu trước đây thì 3 gen kháng Xa4, xa5, Xa7 là 3 gen kháng hiệu quả đối với các chủng bạc lá ở miền Bắc Việt Nam (Phan hữu Tôn, 2004). Vì vậy, trong phạm vi của nghiên cứu này chúng tôi chỉ tiến hành xác định khả năng mang 3 gen kháng nói trên của các mẫu giống .
4.1.1. Kết quả lây nhiễm nhân tạo
Để dự đoán khả năng chứa gen kháng của các mẫu giống lúa, các dòng đẳng gen và các mẫu giống được tiến hành lây nhiễm song song với 7 chủng vi khuẩn Xanthomonas Oryzae pv. Oryzae. Các chủng này được lựa chọn dựa trên tiêu chí có độc tính, phổ biến ở miền Bắc Việt Nam và có thể phân biệt được các gen kháng.
4.1.1.1. Phản ứng của các dòng đẳng gen với các chủng vi khuẩn lây nhiễm
Kết quả phản ứng của các dòng đẳng gen với các chủng được trình bày ở bảng sau:
Bảng 1. Phản ứng của các dòng đẳng gen với các chủng vi khuẩn
STT giốngKH 1 2B 3A 4 5A 6 8 khángTỷ lệ khángGen
1 IRBB4 S R R S S S S 6S/2R Xa4
2 IRBB5 R R R R R R R 7R xa5
3 IRBB7 R R R S R S R 2S/5R Xa7
4 IR24 S S S S S S S 7S 0
- Dòng đẳng gen IR24, không mang gen kháng, bị nhiễm nặng cả 7 chủng vi khuẩn.
- Dòng IRBB4 mang gen Xa4 bị nhiễm 5 chủng và chỉ kháng được 2 chủng 2B, 3A.
- Dòng IRBB5 mang gen xa5 kháng được cả 7 chủng.
Hình 2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IR24.
Hình 3. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB4.
Chủng: 1 2 3 4 5 6 8
Hình 4. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB5.
Hình 5. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB7.
Chủng: 1 2 3 4 5 6 8 Chủng: 1 2 3 4 5 6 8
4.1.1.2. Phản ứng của các mẫu giống địa phương với chủng vi khuẩn lây nhiễm
Kết quả lây nhiễm nhân tạo được trình bày chi tiết ở phụ lục 2 và phụ lục 3.
Sau khi tiến hành so sánh song song phổ kháng nhiễm của các mẫu giống địa phương với từng dòng đẳng gen, có thể sơ bộ dự đoán khả năng chứa gen kháng của các mẫu giống như sau:
- Có 5 mẫu giống có có phổ kháng nhiễm tương tự IR24, do vậy bước đầu chúng tôi dự đoán các giống này có thể không chứa gen kháng như IR24 hoặc chứa một trong số các gen kháng không hữu hiệu.
- Có 13 mẫu giống có phổ kháng nhiễm tương tự IRBB4. Do đó tạm kết luận 13 giống này mang gen Xa4.
- Có 17 mẫu giống có phổ kháng nhiễm tương tự IRBB7 nên có thể tạm kết luận những mẫu giống này có thể chứa gen Xa7 hoặc chứa cả 2 gen Xa7 và Xa4.
- Có 7 mẫu giống kháng được cả 7 chủng vi khuẩn, có thể tạm kết luận những giống này mang từ 1 đến 3 gen kháng là Xa4, xa5, Xa7.
- Có 8 mẫu giống còn lại biểu hiện kháng nhiễm với các chủng vi khuẩn nhưng phổ kháng nhiễm không trùng với các dòng đẳng gen, các giống này cần lây nhiễm thêm để kiểm chứng chính xác gen kháng.
*Độ độc tính của các chủng lây nhiễm
Dựa trên tỉ lệ kháng nhiễm của các mẫu giống với các chủng vi khuẩn chúng tôi đưa ra kết luận về độ độc tính của các chủng vi khuẩn như sau:
+ Chủng 6 có độ độc tính cao nhất với tỉ lệ kháng nhiễm là 7R/1M/42S.
+ Tiếp theo là chủng 4 (7R/6M/37S), chủng 1 (24R/3M/23S), chủng 8 (25R/4M/21S) và chủng 5 (26R/6M/18S).
+ Chủng 3 (38R/2M/10S) và chủng 2 (39R/4M/7S)có độ độc tính yếu nhất, hầu hết các giống chứa gen kháng đều có khả năng kháng được với 2 chủng này.
4.1.2. Kết quả PCR kiểm tra gen kháng bạc lá
Để kiểm tra khả năng mang 3 gen kháng bạc lá Xa4, xa5, Xa7 của các mẫu giống lúa, chúng tôi tiến hành PCR xác định gen kháng sử dụng các cặp mồi có trình tự như đã nêu ở Mục 3.3.3, phần phương pháp nghiên cứu.
Các đối chứng được sử dụng là các dòng đẳng gen IRBB4, IRBB5, IRBB7 (đối chứng dương có chứa gen kháng) và IR24 (đối chứng âm không chứa gen kháng).
Trong phản ứng PCR xác định gen kháng, các gen kháng được xác định bằng cách so sánh kích cỡ vệt băng nhân lên của mẫu với kích thước vệt băng của đối chứng từ đó đưa ra kết luận về gen kháng của mẫu.
Cụ thể như sau:
Đối với gen Xa4 với cặp mồi MP2, thì kích thước vệt băng nếu mẫu chứa gen Xa4 là 150bp, không chứa gen Xa4 là 120bp.
1. ladder
2. IR24, đối chứng âm 3. IRBB4, đối chứng dương 4. 10001 5. 10051 6. 10002 7. 10060 8. 10079 9. 10790 10. 10795 11. 10792 12. 10796 13. 10798
(Những mẫu giống in đậm là chứa gen kháng)
Hình 6. Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Xa4, sử dụng cặp mồi MP2
Kết quả chúng tôi xác định được 21 mẫu giống mang gen Xa4
Đối với gen Xa7 với cặp mồi P3, thì kích thước vệt băng nếu mẫu chứa gen
Xa7 là 297bp, không chứa gen Xa7 là 262 bp.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
150 120
1. ladder
2. IR24, đối chứng âm 3. IRBB7, đối chứng dương 4. 10001 5. 10002 6. 10051 7. 10060 8. 10061 9. 10076 10. 10790 11. 10792 12. 10079 13. 10139 14. 10152 15. 10278 16. 10780 17. 10781
(Những mẫu giống in đậm là chứa gen kháng)
Hình 7. Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Xa7, sử dụng cặp mồi P3
Kết quả xác định được 23 mẫu giống mang gen Xa7
Đối với gen xa5 sử dụng cặp mồi RG556 và enzyme DraI, sản phẩm PCR của mẫu mang gen lặn xa5 sau khi cắt bằng enzyme sẽ xuất hiện vạch băng kép tại kích thước khoảng 450bp.
Hình 8. Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen xa5, sử dụng cặp mồi RG556 trước cắt enzym DraI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 297 bp
1. ladder
2. IR24, đối chứng âm 3. IRBB5, đối chứng dương 4. 10001 5. 10061 6. 10274 7. 10788 8. 10800 9. 10803 10. 10002
(Những mẫu giống in đậm là chứa gen kháng)
Hình 9. Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen xa5, sử dụng cặp mồi RG556sau khi cắt enzym DraI
Kết quả, chúng tôi xác định được 6 mẫu giống mang gen xa5 Đặc biệt kết quả thu được:
+ 2 mẫu giống kí hiệu 10800 và 10803 chứa cả 3 gen Xa4, xa5 và Xa7 + 1 mẫu giống kí hiệu 10293 chứa 2 gen xa5 và Xa7
+ 6 mẫu giống kí hiệu 10173, 10275, 10282, 10288, 10795 và 10796 chứa 2 gen Xa4 và Xa7.
4.1.3. So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo
Sau khi tiến hành phản ứng PCR và lây nhiễm nhân tạo, chúng tôi đưa ra bảng so sánh kết quả như sau:
Bảng 2. So sánh kết quả xác định gen kháng bằng PCR và kết quả lây nhiễm nhân tạo của các mẫu giống.
STT KH giống
Gen Xa4 Gen xa5 Gen Xa7
PCR Lây nhiễm PCR Lây nhiễm PCR Lây nhiễm
1 10001 + + - - - - 2 10002 + + - - - - 3 10051 - - - - 4 10055 - - - - 5 10060 - - - - 6 10061 - - + + - - 7 10072 + + - - - - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
STT KH giống
Gen Xa4 Gen xa5 Gen Xa7
PCR Lây nhiễm PCR Lây nhiễm PCR Lây nhiễm
9 10079 + + - - - - 10 10095 + + - - - - 11 10113 - - - - 12 10139 - - - - 13 10140 - - - - + + 14 10152 - - - - + + 15 10161 + + - - - - 16 10165 - - - - 17 10169 - - - - + + 18 10171 + + - - - - 19 10173 + + - - + + 20 10180 - - - - + + 21 10181 - - - - 22 10183 + + - - - - 23 10184 + + - - - - 24 10186 - - - - + + 25 10274 - - + + - - 26 10275 + + - - + + 27 10276 + + - - - - 28 10278 + + - - - - 29 10282 + + - - + + 30 10286 - - - - + - 31 10287 - - - - + + 32 10288 + + - - + + 33 10291 - - - - 34 10293 - - + + + + 35 10700 + + - - - - 36 10710 + + - - - - 37 10780 - - - - + + 38 10781 - - - - 39 10787 - - - - + + 40 10788 - - + + - - 41 10789 - - - - 42 10790 - - - - 43 10792 - - - - + + 44 10795 + + - - + + 45 10796 + + - - + - 46 10798 - - - - + + 47 10799 - - - - + + 48 10800 + + + + + + 49 10801 - - - - + + 50 10803 + + + + + +
Qua kết quả thu được chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:
- 13 mẫu giống chỉ chứa gen Xa4 (xác định bằng PCR) đều kháng được 2 chủng 2B, 3A tương tự như dòng đẳng gen IRBB4.
- 3 mẫu giống 10061, 10274 và 10788 chỉ chứa gen xa5 kháng được cả 7 chủng như IRBB5.
- Có 12 mẫu giống chỉ chứa gen Xa7 (xác định bằng PCR) đều kháng hoặc kháng vừa với 5 chủng : 1, 2B, 3A, 5A, 8 tương tự như IRBB7, song có 2 mẫu giống chỉ chứa gen Xa7 nhưng không kháng được 5 chủng như IRBB7.
- Đối với các mẫu giống có chứa 2 gen kháng: 1 mẫu giống kí hiệu 10293 chứa 2 gen xa5 và Xa7 thì kháng hoàn toàn với 7 chủng vi khuẩn, 5 mẫu giống kí hiệu 10173, 10275, 10288, 10795 và 10796 chứa 2 gen Xa4 và Xa7 thì kháng và kháng vừa với 5 chủng vi khuẩn tương tự như IRBB7.
- Đối với các mẫu giống chứa cả 3 gen kháng: 2 mẫu giống kí hiệu 10800 và 10803 chứa cả 3 gen Xa4, xa5 và Xa7 thì kháng hoàn toàn với 7 chủng vi khuẩn tương tự IRBB5.
Như vậy, các mẫu giống 10800 và 10803 chứa cả 3 gen Xa4, xa5, Xa7 và mẫu giống 10293 chứa 2 gen kháng xa5, Xa7 là những vật liệu rất tốt cho chọn giống kháng bệnh do chứa 3, 2 gen kháng mạnh nên hầu như kháng được tất cả các chủng bạc lá. Ngoài ra, 6 mẫu 10173, 10275, 10282, 10288, 10795 và 10796 chứa gen kháng Xa7, Xa4 tuy là 2 gen kháng yếu hơn xa5 nhưng do có 2 gen kháng nên tính kháng cũng tương đối bền vững.
- Trong quá trình lây nhiễm nhân tạo chúng tôi cũng ghi nhận mẫu giống 10282 được xác định chứa gen kháng Xa4 và Xa7, không chứa gen kháng xa5 nhưng lại kháng được cả 7 chủng vi khuẩn. Có 8 mẫu giống biểu hiện kháng nhiễm với các chủng vi khuẩn nhưng phổ kháng nhiễm không trùng với các dòng đẳng gen Những mẫu giống này có thể chứa các gen kháng khác ngoài các gen nghiên cứu,
những trường hợp này cần kiểm tra thêm để xác định chính xác gen kháng.
Có sự khác nhau giữa 2 phương pháp PCR và lây nhiễm nhân tạo là do phương pháp lây nhiễm nhân tạo phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh và một số yếu
4.2. Kết quả đánh giá chất lượng
4.2.1. Kết quả chất lượng thương trường của gạo
4.2.1.1. Chất lượng xay xát
Chất lượng xay xát là một yếu tố quan trọng khi đánh giá chất lượng của giống lúa. Chất lượng xay xát được xác định dựa vào tỷ lệ gạo lật, gạo nguyên và gạo trắng. Giống có chất lượng xay xát tốt là giống có tỷ lệ gạo lật, gạo trắng và gạo nguyên cao.
Bảng 3. Chất lượng xay xát của gạo
TT KH giống Tỷ lệ gạo lật (%) Tỷ lệ gạo trắng (%) TT KH giống Tỷ lệ gạo lật (%) Tỷ lệ gạo trắng (%) 1 10001 76.1 71.6 26 10275 84.7 41.3 2 10002 74.5 57.5 27 10276 77.7 62.9 3 10051 79.9 71.4 28 10278 4 10055 79.5 42.1 29 10282 77.7 58.9 5 10060 82.4 75.3 30 10286 82.3 34.1 6 10061 75.8 54.6 31 10287 80.7 48.8 7 10072 77.4 72.8 32 10288 76.7 72.4 8 10076 82.4 57.4 33 10291 67.5 55.9 9 10079 74.9 68.6 34 10293 72.3 49.8 10 10095 75.1 38.7 35 10700 77.6 67.3 11 10113 77.7 71.1 36 10710 81.6 62.3 12 10139 76.0 68.2 37 10780 88.9 79.1 13 10140 83.7 71.6 38 10781 14 10152 88.7 73.9 39 10787 83.1 71.9 15 10161 81.0 55.6 40 10788 79.1 68.5 16 10165 78.5 45.1 41 10789 76.0 68.1 17 10169 79.4 56.2 42 10790 86.0 63.3 18 10171 76.0 65.8 43 10792 75.5 62.2 19 10173 69.8 47.5 44 10795 64.0 54.1 20 10180 86.6 62.3 45 10796 89.3 72.6 21 10181 76.0 57.7 46 10798 72.7 67.8 22 10183 79.1 67.7 47 10799 75.3 57.4 23 10184 72.8 61.6 48 10800 72.2 38.1 24 10186 75.4 51.6 49 10801 83.2 73.6 25 10274 80.3 40.1 50 10803 81.2 41.6
Tỷ lệ gạo lật của các mẫu giống dao động từ 64.0% (10795) đến 89.3% (10796). Tỷ lệ gạo trắng là từ 34,1% (10286) đến 79.18% (10780)
Tuy nhiên, kết quả theo dõi cũng cho thấy có những mẫu giống có tỉ lệ gạo lật cao nhưng lại có tỷ lệ gạo trắng thấp. Như mẫu giống 10286 có tỷ lệ gạo lật là 82,3% và chỉ đạt 34.1% gạo trắng.
Nguyên nhân của sự biến động này là do tỷ lệ gạo trắng được quyết định bởi