3.3.3.1. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
- Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae được nuôi cấy trên môi trường Wakimoto (Wakimoto,1995).
Thành phần môi trường gồm: Khoai tây 300g; đường saccarose 15g; peptone 5g; agar 17g; Na2HPO4.12H2O 2g; Ca2(NO3)2.4H2O 0.5g; nước cất 100ml; pH 6.8 – 7.0 - Môi trường Wakimoto dược hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong ống nghiệm thời gian 20 phút, tạo mặt thạch nghiêng
Trước khi lây nhiễm nguồn vi khuẩn được cấy bảo quản trong môi trường Skim milk ở -30oC, được cấy truyền sang môi trường Wakimoto ở 28oC sau 48 – 72 giờ tuổi, sau đó pha loãng dung dịch vi khuẩn bằng nước cất vô trùng đạt được nồng độ 108 CFU/ml để lây bệnh.
Phương pháp lây nhiễm
Lây bệnh theo phương pháp sát thương cơ giới cắt đầu lá của N. Furuya,2003: Dùng kéo đã khử trùng nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh bạc lá (mỗi chủng vi khuẩn dùng một kéo vô trùng) cắt lên đầu lá lúa một đoạn dài khoảng 2 – 5cm và lây nhiễm vào giai đoạn lúa làm đòng - trỗ, mỗi chủng một cây, trên một cây cắt toàn bộ lá xanh trên đó.
Trước khi lây nhiễm, tiến hành làm thí nghiệm để xác định khả năng duy trì độ độc tính của các chủng vi khuẩn trong quá trình bảo quản bằng cách lây thử lên dòng mẫm cảm IR24. Sau 5 ngày thấy đầu lá héo xanh và tái đi chứng tỏ các chủng vi khuẩn này có độ độc tính và có thể dùng để lây nhiễm được.
Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
Sau khi lây nhiễm được 18 – 20 ngày tiến hành đo chiều dài vết bệnh theo phương pháp do N. Furuya et al, 2003 đề xuất.
Dựa vào chiều dài của vết bệnh để đánh giá tính kháng của giống như sau: + Chiều dài vết bệnh <8cm: Kháng bệng bạc lá (R)
+ Chiều dài vết bệnh từ 8 - 12cm: Nhiễm vừa (M) + Chiều dài vết bệnh >12cm: Nhiễm nặng (S)
3.3.3.2. Kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR
Chiết tách DNA
Chiết tách DNA theo quy trình của Zheng và cộng sự, 1995, có cải tiến:
Thu ngắt mẫu lá khoẻ dài 2cm bỏ vào ống nghiệm có dung tích 1.5ml, đánh dấu tên giống rồi đặt vào đá lạnh.
Trong phòng thí nghiệm các cối sứ đã được hấp khử trùng đặt trong đá lạnh 1. Các mẩu lá 2cm được cắt nhỏ 0,5mm rồi bỏ vào cối sứ.
2. Nhỏ 400µl dung dịch chiết xuất DNA vào cối sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá.
3. Nghiền kỹ mô lá đến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang màu xanh đen, chứng tỏ tế bào lá đã vỡ và diệp lục được giải phóng ra.
4. Đổ thêm 400µl dung dịch chiết xuất DNA vào, trộn lẫn và chuyển 400µl vào ống nghiệm đã đánh dấu theo tên giống ban đầu.
5. Đổ vào ống nghiệm 400µl (25 Phenol: 24 chloroform: 1 isaminachohol) trộn đều, quay li tâm 13000 vòng trong 5 phút sau đó chuyển phần dung dịch lớp trên sang ống nghiệm mới đã đánh số theo từng tên giống.
6. Đổ vào ống nghiệm 400µl (24chlorofrom : 1 isaminachohol) làm tương tự như bước 5.
7. Đổ 800µl ethanol (Isopropanol) trộn đều sau đó li tâm 13000 vòng trong 5 phút. Đổ phần dung tích phía trên đi, giữ lại phần kết tủa ở đáy ống nghiệm.
8. Rửa kết tủa bằng ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ trong phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm.
Phần kết tủa chính là DNA. Hoà tan DNA kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ -200C hoặc 40C, dùng cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy chu trình nhiệt
- Chuẩn bị DNA các mẫu giống nghiên cứu và các dòng chỉ thị (gồm: IR24 – đối chứng âm không chứa gen kháng , IRBB4, IRBB5, IRBB7 – đối chứng dương chứa gen kháng Xa4, xa5, Xa7)
- Thành phần dung dịch phản ứng PCR gồm có:
+ Đối với Xa4 và Xa7 thành phần 25 μl gồm: 12.5 μl gotaq master mix, 1 μl Primer Forward, 1 μl Primer Revese, 1 μl DNA mẫu và 9.5 μl nuclease – Free water.
+ Đối với xa5 thành phần 20 μl gồm có: 14.24 μl nuclease – Free water, 2.5 μl buffer, 0.16 μl dNTP 25mM, 1 μl Primer Forward, 1 μl Primer Revese, 0.1 μl dream taq polymerase, 1 μl DNA mẫu.
- Các mồi sử dụng để phát hiện ra gen kháng bạc lá Xa4, xa5 và Xa7
Kí hiệu, trình tự và nguồn gốc các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR được trình bày ở bảng dưới đây:
KH mồi Gen Trình tự mồi Enzyme Tác giả
MP2 Xa4 R 5’GTG CTA TAA AAG GCA TTC GGG 3’
F 5’ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG 3’ -
N. Furuya et al, 1992
P3 Xa7 F 5’ CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT 3’
R 5’ CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA 3’ -
N. Furuya et al, 2003
RG556 xa5 R 5’TAG CTG CTG CCG TGC TGT GC 3’
F 5’ AAT ATT TCA GTG TGC ATC TC 3’ DraI
Yoshimura et al., 1995
- Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7 như sau:
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 4 phút 2 94 1 phút 3 56 1 phút 4 72 2 phút 5 Lặp lại 34 lần từ bước 2 6 72 8 phút 7 4 8 Kết thúc
- Chu kỳ nhiệt cho gen xa5 như sau:
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 4 phút 2 94 1 phút 3 60 1 phút 4 72 1 phút 50 giây 5 Lặp lại 34 lần từ bước 2 6 72 7 phút 7 4 8 Kết thúc
Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng
Sau khi tiến hành phản ứng PCR, sản phẩm nhân gen sẽ được chạy điện di để phát hiện gen kháng.
- Chuẩn bị gel agarose 1,5% - Chạy điện di ở hiệu điện thế 75V
- Sau khi chạy điện di xong, nhuộm bản điện di bằng ethilium bromide nồng độ 10mg/ml trong 10 phút.
- Quan sát vệt băng dưới đèn chiếu tia UV và chụp ảnh bản điện di để xem có gen kháng hay không. Phát hiện bằng cách so sánh kích cỡ vệt băng nhân lên của mẫu với kích thước vệt băng của đối chứng, nếu vạch nào trùng với đối chứng âm là không chứa gen kháng, còn vạch nào trùng với đối chứng dương thì chứa gen kháng.
Phản ứng cắt DNA sản phẩm PCR phát hiện gen xa5
vệt băng của IR24. Do đó phải dùng đến enzym cắt giới hạn RE ( dùng enzym DraI với trình tự cắt là TTT - AAA ).
Thành phần 15 μl dung dịch cắt bằng enzyme DraI như sau: Nuclease free water: 3,2µl; 10X Buffer R: 1,5µl; enzym DraI 10unit/µl: 0,3µl; Sản phẩm PCR: 10µl.
Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 370C với thời gian từ 6h đến qua đêm. Điện di sản phẩm ADN đã được cắt bằng enzym trên gel agarose 1.5%