bệnh bạc lá
Sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã mang đến những bước tiếng đáng kể trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá. Vi khuẩn Xanthomonas oyzae pv. Oyzae có thể được xác định nhanh chóng bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử. Adachi và T. Oku, 2000, đề xuất sử dụng 2 đoạn mồi XOR-F và XOR-R2 để nhân đoạn ADN, đoạn ADN này nằm giữa hai gen tổng hợp nên cấu tử 16S và 23S của ribosome vi khuẩn bạc lá (dẫn theo Phan Hữu Tôn, 2005).
Ngoài ra, các kỹ thuật phân tử như RFLP (restriction fragment length polymorphism) cũng được áp dụng tành công trong việc xác đánh giá sự đa dạng hay xác định chủng mới của vi khuẩn Xoo ở Việt Nam, Phillipnes, Hàn Quốc và những nước trồng lúa khác (Adhikari, 1995; Yashitola, 1997; Etham Ghasemie, 2008; Phan Hữu Tôn,2009).
Ngày nay, đã có nhiều gen quan trọng của các loại cây trồng được lập bản đồ liên kết với các đoạn ADN genome, đặc biệt là gen kháng bệnh ở các cây lương thực chính (Melchinger, 1990; Kelly, 1995; Penner và cs, 1995; Miklas và cs, 1996; A.C.Sanchez, 2000). Dựa trên bản đồ này, chỉ thị phân tử xác định gen kháng bạc lá đã được xây dựng. Kỹ thuật này ngày càng được sử dụng phổ biến bởi tính khả thi, tính hiệu quả và tính kinh tế. Chỉ thị phân tử đã được ứng dụng thành công trong việc xác định gen kháng (Nelson và cs, 1996), trong việc tổ hợp nhiều gen kháng để tạo thành giống chứa đa gen kháng (Huang và cs, 1997), trong chuyển gen kháng bằng phương pháp nuôi cấy mô, lai tế bào trần (Kelly, 1995).
Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống.
Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ biến trong đánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa địa phương thu thập được ở duyên hải Trung bộ và đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả đã thu được 17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14. Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp chỉ
thị phân tử trong nghiên cứu phát hiện gen kháng ở quần thể con lai giữa IR24/Barer đối với gen xa5 cho thấy độ chính xác lên tới 93,3% (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Bùi Chí Bửu và Cs cũng đã sử dụng chỉ thị phân tử để kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa địa phương mang gen kháng Xa4,
xa5, xa13 với độ chính xác ccao (Nguyen Vinh Phuc , 2005).
Ở miền Bắc, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng thành công trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn giống kháng bệnh. Từ năm 2000 cùng với sự hợp tác của các chuyên gia Nhật Bản trong khuôn khổ dự án Jica, nhóm nghiên cứu về bệnh bạc lá của trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội của Phan Hữu Tôn và cs đã liên tục công bố nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng chỉ thị phân tử và kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn để tiến hành thu thập, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn bạc lá phổ biến ở miền Bắc. Đồng thời, để phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa kháng bệnh, Phan Hữu Tôn cũng tiến hành lây nhiễm trên các dòng đẳng gen nhằm kết luận gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn ở miền Bắc. Cho đến nay, các gen xa5, Xa7, Xa21 đã được xác định là các gen kháng hầu hết các chủng vi khuẩn. Các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc cũng được tiến hành đánh giá khả năng kháng bệnh, kết quả cho thấy chúng không có khả năng kháng các chủng vi khuẩn ở Việt Nam (Phan Hữu Tôn, 2004).
Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành việc tìm kiếm nguồn gen kháng từ các giống lúa địa phương bằng cả hai phương pháp lây nhiễm nhân tạo và PCR. Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu đã công bố của Phan Hữu Tôn thì trên cơ sở điều tra 145 giống lúa địa phương đã phát hiện được 12 giống chứa gen xa5 và 2 giống chứa gen Xa7. Năm 2004, trên cơ sở tiếp tục điều tra 120 giống địa phương, Phan Hữu Tôn và cs phát hiện được thêm 8 giống lúa địa phương chứa gen xa5. Các kết quả nghiên cứu trên đều nhằm mục đích phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004, 2007).
Đến nay, bước đầu có thể khẳng định các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10,
Nam. Các gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh, bởi chúng có khả năng kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến ở nước ta. Nhưng trong số các gen kháng hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7 có khả năng xuất hiện nhiều hơn xa5. Hiện chưa có nghiên cứu nào công bố việc phát hiện được gen Xa21 trên các giống lúa trồng. Việc sử dụng kỹ thuật PCR xác định gen kháng và vi khuẩn bạc lá trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cho kết quả rất khả quan.
PHẦN III
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- 50 mẫu giống lúa được thu thập và bảo quản tại bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, Đại học Nông nghiệp Hà Nội (Kí hiệu, tên, nguồn gốc các mẫu giống được trình bày chi tiết tại Phụ lục 1).
- Các dòng đẳng gen chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau, gồm dòng nhiễm chuẩn: IR24, các dòng mang gen kháng chuẩn IRBBgồm IRBB4, IRBB5 và IRBB7.
- 7 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá đang tồn tại ở miền Bắc Việt Nam, được phân lập và bảo quản tại bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng như sau:
TT Kí hiệu Isolate Phân lập từ giống Địa điểm thu thập mẫu bệnh
1 HAU 01043 TN 13 – 4 Hà Nội
2B HAU 020361 Nếp tân Thuận Châu (Sơn La)
3A HAU 020083 Nhị ưu – 838 Quỳnh Giang, Quỳnh Lưu (Nghệ An)
4 HAU 010081 Tẻ đỏ Hải Dương
5A HAU 020131 Khang dân Diễn Kỳ, Diễn Châu (Nghệ An)
6 HAU 020346 Nhị ưu 838 Cường Thịnh, Yên Kì (Yên Bái)
8 HAU 020201 Nếp thơm Vinh Hống, Bình Giang (Hải Dương)
- Các loại hóa chất và dụng cụ dùng trong thí nghiệm PCR
3.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Nghiên cứu được tiến hành vào vụ xuân năm 2010 từ tháng 1/2010 đến tháng 6/2010.
- Các thí nghiệm ngoài đồng ruộng được bố trí tại ruộng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng.
- Các thí nghiệm trong phòng được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử, Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng và khả năng mang gen mùi thơm của 50 mẫu giống.
- Đánh giá khả năng kháng và mang gen kháng bệnh bạc lá .
- Đánh giá năng suất và một số tính trạng nông sinh học quan trọng khác.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng
- Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô 1 giống không nhắc lại
- Mật độ cấy: Mỗi giống cấy 5m2. Cây cách cây 11cm, hàng cách hàng 20cm, Cấy 1 dảnh/ khóm.
3.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học cơ bản
Các đặc điểm nông sinh học được khảo sát theo IRRI standard evaluation
system for rice, 2002.
3.3.2.1. Xác định thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng
- Từ cấy đến bắt đầu trỗ: lúc có 10% số cây chính có bông thoát khỏi bẹ lá đòng khoảng 5cm.
- Từ trỗ đến chín: khi 85% số hạt chắc có màu vàng
Sau đó tính tổng thời gian sinh trưởng từ ngày gieo mạ đến ngày lúa chín hoàn toàn.
3.3.2.2. Đặc điểm nông sinh học chính thời kỳ ruộng cấy
- Số nhánh tối đa: đếm 10 cây
- Số nhánh hữu hiệu: đếm 5 – 10 cây (số nhánh có khả năng tạo thành bông) - Chiều dài lá đòng: đo 5 cây
- Chiều rộng lá đòng: đo 5 cây
- Chiều dài bông: đo chiều dài từ cổ đến đỉnh bông thời kỳ vào chắc.
- Chiều cao cây cuối cùng: đo từ mặt đất đến đỉnh bông dài nhất, thời kỳ chín.
- Đo chiều dài, chiều rộng hạt thóc: đo từ cuối đến đỉnh hạt, không đo râu và đo phần rộng nhất của hạt thóc.
3.3.2.3. Đặc điểm nông sinh học thời kỳ chín liên quan đến năng suất
- Số bông hữu hiệu/khóm: đếm 5 cây (lấy số trung bình) - Số hạt chắc/bông
- Khối lượng 1000 hạt đo 3 lần.
- Năng suất tiềm năng (NSTN) = A x B x C x D x 10-4
Trong đó: A: Số khóm/m2 (45 khóm/m2) B: số bông hữu hiệu/khóm C: Số hạt chắc/bông chính D: Khối lượng 1000 hạt
Với mỗi giai đoạn quan sát, tiến hành lập bảng.
3.3.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
3.3.3.1. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
- Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae được nuôi cấy trên môi trường Wakimoto (Wakimoto,1995).
Thành phần môi trường gồm: Khoai tây 300g; đường saccarose 15g; peptone 5g; agar 17g; Na2HPO4.12H2O 2g; Ca2(NO3)2.4H2O 0.5g; nước cất 100ml; pH 6.8 – 7.0 - Môi trường Wakimoto dược hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong ống nghiệm thời gian 20 phút, tạo mặt thạch nghiêng
Trước khi lây nhiễm nguồn vi khuẩn được cấy bảo quản trong môi trường Skim milk ở -30oC, được cấy truyền sang môi trường Wakimoto ở 28oC sau 48 – 72 giờ tuổi, sau đó pha loãng dung dịch vi khuẩn bằng nước cất vô trùng đạt được nồng độ 108 CFU/ml để lây bệnh.
Phương pháp lây nhiễm
Lây bệnh theo phương pháp sát thương cơ giới cắt đầu lá của N. Furuya,2003: Dùng kéo đã khử trùng nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh bạc lá (mỗi chủng vi khuẩn dùng một kéo vô trùng) cắt lên đầu lá lúa một đoạn dài khoảng 2 – 5cm và lây nhiễm vào giai đoạn lúa làm đòng - trỗ, mỗi chủng một cây, trên một cây cắt toàn bộ lá xanh trên đó.
Trước khi lây nhiễm, tiến hành làm thí nghiệm để xác định khả năng duy trì độ độc tính của các chủng vi khuẩn trong quá trình bảo quản bằng cách lây thử lên dòng mẫm cảm IR24. Sau 5 ngày thấy đầu lá héo xanh và tái đi chứng tỏ các chủng vi khuẩn này có độ độc tính và có thể dùng để lây nhiễm được.
Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
Sau khi lây nhiễm được 18 – 20 ngày tiến hành đo chiều dài vết bệnh theo phương pháp do N. Furuya et al, 2003 đề xuất.
Dựa vào chiều dài của vết bệnh để đánh giá tính kháng của giống như sau: + Chiều dài vết bệnh <8cm: Kháng bệng bạc lá (R)
+ Chiều dài vết bệnh từ 8 - 12cm: Nhiễm vừa (M) + Chiều dài vết bệnh >12cm: Nhiễm nặng (S)
3.3.3.2. Kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR
Chiết tách DNA
Chiết tách DNA theo quy trình của Zheng và cộng sự, 1995, có cải tiến:
Thu ngắt mẫu lá khoẻ dài 2cm bỏ vào ống nghiệm có dung tích 1.5ml, đánh dấu tên giống rồi đặt vào đá lạnh.
Trong phòng thí nghiệm các cối sứ đã được hấp khử trùng đặt trong đá lạnh 1. Các mẩu lá 2cm được cắt nhỏ 0,5mm rồi bỏ vào cối sứ.
2. Nhỏ 400µl dung dịch chiết xuất DNA vào cối sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá.
3. Nghiền kỹ mô lá đến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang màu xanh đen, chứng tỏ tế bào lá đã vỡ và diệp lục được giải phóng ra.
4. Đổ thêm 400µl dung dịch chiết xuất DNA vào, trộn lẫn và chuyển 400µl vào ống nghiệm đã đánh dấu theo tên giống ban đầu.
5. Đổ vào ống nghiệm 400µl (25 Phenol: 24 chloroform: 1 isaminachohol) trộn đều, quay li tâm 13000 vòng trong 5 phút sau đó chuyển phần dung dịch lớp trên sang ống nghiệm mới đã đánh số theo từng tên giống.
6. Đổ vào ống nghiệm 400µl (24chlorofrom : 1 isaminachohol) làm tương tự như bước 5.
7. Đổ 800µl ethanol (Isopropanol) trộn đều sau đó li tâm 13000 vòng trong 5 phút. Đổ phần dung tích phía trên đi, giữ lại phần kết tủa ở đáy ống nghiệm.
8. Rửa kết tủa bằng ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ trong phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm.
Phần kết tủa chính là DNA. Hoà tan DNA kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ -200C hoặc 40C, dùng cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy chu trình nhiệt
- Chuẩn bị DNA các mẫu giống nghiên cứu và các dòng chỉ thị (gồm: IR24 – đối chứng âm không chứa gen kháng , IRBB4, IRBB5, IRBB7 – đối chứng dương chứa gen kháng Xa4, xa5, Xa7)
- Thành phần dung dịch phản ứng PCR gồm có:
+ Đối với Xa4 và Xa7 thành phần 25 μl gồm: 12.5 μl gotaq master mix, 1 μl Primer Forward, 1 μl Primer Revese, 1 μl DNA mẫu và 9.5 μl nuclease – Free water.
+ Đối với xa5 thành phần 20 μl gồm có: 14.24 μl nuclease – Free water, 2.5 μl buffer, 0.16 μl dNTP 25mM, 1 μl Primer Forward, 1 μl Primer Revese, 0.1 μl dream taq polymerase, 1 μl DNA mẫu.
- Các mồi sử dụng để phát hiện ra gen kháng bạc lá Xa4, xa5 và Xa7
Kí hiệu, trình tự và nguồn gốc các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR được trình bày ở bảng dưới đây:
KH mồi Gen Trình tự mồi Enzyme Tác giả
MP2 Xa4 R 5’GTG CTA TAA AAG GCA TTC GGG 3’
F 5’ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG 3’ -
N. Furuya et al, 1992
P3 Xa7 F 5’ CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT 3’
R 5’ CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA 3’ -
N. Furuya et al, 2003
RG556 xa5 R 5’TAG CTG CTG CCG TGC TGT GC 3’
F 5’ AAT ATT TCA GTG TGC ATC TC 3’ DraI
Yoshimura et al., 1995
- Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7 như sau:
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 4 phút 2 94 1 phút 3 56 1 phút 4 72 2 phút 5 Lặp lại 34 lần từ bước 2 6 72 8 phút 7 4 8 Kết thúc
- Chu kỳ nhiệt cho gen xa5 như sau:
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 4 phút 2 94 1 phút 3 60 1 phút 4 72 1 phút 50 giây 5 Lặp lại 34 lần từ bước 2 6 72 7 phút 7 4 8 Kết thúc
Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng
Sau khi tiến hành phản ứng PCR, sản phẩm nhân gen sẽ được chạy điện di để phát hiện gen kháng.
- Chuẩn bị gel agarose 1,5% - Chạy điện di ở hiệu điện thế 75V
- Sau khi chạy điện di xong, nhuộm bản điện di bằng ethilium bromide nồng độ 10mg/ml trong 10 phút.
- Quan sát vệt băng dưới đèn chiếu tia UV và chụp ảnh bản điện di để xem có gen kháng hay không. Phát hiện bằng cách so sánh kích cỡ vệt băng nhân lên của mẫu với kích thước vệt băng của đối chứng, nếu vạch nào trùng với đối chứng âm là không chứa gen kháng, còn vạch nào trùng với đối chứng dương thì chứa gen kháng.
Phản ứng cắt DNA sản phẩm PCR phát hiện gen xa5
vệt băng của IR24. Do đó phải dùng đến enzym cắt giới hạn RE ( dùng enzym DraI với trình tự cắt là TTT - AAA ).
Thành phần 15 μl dung dịch cắt bằng enzyme DraI như sau: Nuclease free water: 3,2µl; 10X Buffer R: 1,5µl; enzym DraI 10unit/µl: 0,3µl; Sản phẩm PCR: 10µl.
Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 370C với thời gian từ 6h đến qua đêm. Điện di sản phẩm ADN đã được cắt bằng enzym trên gel agarose 1.5%
3.3.4. Phương pháp đánh giá chất lượng