nghệ sinh học thực vật, khoa Công nghệ sinh học.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được tiến hành từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2014
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. Nông Nghiệp Việt Nam.
2.3 Nội dung nghiên cứu
Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc gen chuyển vào các dòng khoai tây bằng PCR và Southern blot. PCR và Southern blot.
Đánh giá in-vitro các dòng chuyển gen thông qua khả năng chịu độc đối với TA Đánh giá in-vivo các dòng chuyển gen thông qua lây nhiễm nhân tạo với tác Đánh giá in-vivo các dòng chuyển gen thông qua lây nhiễm nhân tạo với tác nhân gây bệnh là S.scablies.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp chiết tách DNA (QUIA gen plant mini kit)
Chiết tách DNA tổng số của 3 dòng khoai tây chuyển gen là D1-At-Po9, D2-At-Po9 và D89-At-Po9 và giống Atlantic không chuyển gen theo các bước sau: At-Po9 và giống Atlantic không chuyển gen theo các bước sau:
- Bước 1: Cắt khoảng 100 mg mẫu mô lá, đặt trong nitơ lỏng sau đó nghiền bằng túi. - Bước 2: Thêm 400µl đệm AP1, nghiền tiếp cho đến đồng nhất, hút sang - Bước 2: Thêm 400µl đệm AP1, nghiền tiếp cho đến đồng nhất, hút sang ống eppendoff 1.5ml, bổ sung 4 µl dung dịch RNase A (100mg/ml). Đảo đều ống nhẹ nhàng.
- Bước 3: Ủ hỗn hợp trong 10 phút ở 65oC. Đảo đều ống 2-3 lần trong suốt thời gian ủ. thời gian ủ.
- Bước 4: Thêm 130 µl đệm AP2 vào hỗn hợp trên, đảo đều ống và ủ 5 phút trong đá. trong đá.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 - Bước 5: Ly tâm 5 phút ở 14000 vòng/phút.
- Bước 6: Chuyển dịch trong phía trên sang cột QIAshedder Minispin được đặt trên ống 2ml, ly tâm 2 phút 14000 vòng/phút. trên ống 2ml, ly tâm 2 phút 14000 vòng/phút.
- Bước 7: Chuyển dịch trong phía dưới sang ống ống 1.5 ml.
- Bước 8: Thêm đệm AP3/E với thể tích gấp 1,5 lần thể tích dịch trong ống, đảo đều ống lên xuống nhẹ nhàng. đảo đều ống lên xuống nhẹ nhàng.
- Bước 9: Hút 650 µl dung dịch ở bước 8 cho lên cột DNeasy Mini spin được đặt trên ống ống 2 ml. Ly tâm 1 phút ở 8 000 vòng/phút. Loại bỏ dịch phía dưới, giữ đặt trên ống ống 2 ml. Ly tâm 1 phút ở 8 000 vòng/phút. Loại bỏ dịch phía dưới, giữ lại ống 2 ml và cột.
- Bước 10: Lặp lại bước 9 cho đến khi hết thể tích dung ở bước 8. Loại bỏ dịch và ống 2 ml phía dưới. và ống 2 ml phía dưới.
- Bước 11: Đặt cột lên ống 2ml mới (có sẵn), thêm 500 µl đệm AW lên cột, ly tâm 1 phút ở 8 000 vòng/phút. Loại bỏ dịch phía dưới, sử dụng lại ống 2 ml. tâm 1 phút ở 8 000 vòng/phút. Loại bỏ dịch phía dưới, sử dụng lại ống 2 ml.
- Bước 12: Thêm 500 µl đệm AW lên cột DNeasy Mini spin, ly tâm 1 phút ở 8 000 vòng/phút. Loại bỏ dịch và ống 2ml phía dưới. 000 vòng/phút. Loại bỏ dịch và ống 2ml phía dưới.
- Bước 13: Chuyển cột DNeasy Mini spin sang ống 1.5 ml, hút 100 µl đệm AE nhỏ trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng (15-250C) và sau đó ly nhỏ trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng (15-250C) và sau đó ly tâm 1 phút ở 8 000 vòng/phút.
- Bước 14: Lặp lại bước 13 một lần nữa, bảo quản DNA ở -20oC.
2.4.2 Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR:
Chọn lọc các mẫu thuộc 3 dòng khoai tây chuyển gen là D1-At-Po9, D2-At-Po9 và D89-At-Po9 để chiết tách DNA và kiểm tra PCR sự có mặt của vi khuẩn và Po9 và D89-At-Po9 để chiết tách DNA và kiểm tra PCR sự có mặt của vi khuẩn và kiểm tra gen được chuyển với thành phần phản ứng như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µL)
Nước 14.5
Dream tag buffer 10X 2
dNTPs 0.2mM 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mồi xuôi 10µM 0.1
Mồi ngược 10 µM 0.2
Dream tag polymerase 5U/ µM 0.2
DNA 50ng/µL 1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 Chu kì nhiệt được thực hiện như sau: 950C trong 5 phút, 940 trong 2 phút, 55- 600C trong 30s (tùy cặp mồi), 720C trong 30s, (lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4), 720C trong 7 phút, giữỞ 40C.
Mồi xuôi Mồi ngược
Kích thước sản phẩm (bp) VirD F: GAAGAAAGCCGAAATAAAGAG VirD R: TTGAACGTATAGTCGCCGATA 560 pPS13071: TAAGGGATGACGCACAATCCCACT pPS13440: TCACCTAAGACACTCCACGTACCT 716
Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel Agarose 1%, đệm TAE, hiệu điện thế 70V.
2.4.3 Phương pháp đánh giá tính mẫn cảm với Thaxtomin A của các dòng khoai tây chuyển gen: tây chuyển gen:
3 dòng khoai tây đã được chuyển gen kí hiệu là D1-At-Po9, D2-At- Po9, D89-At-Po9 và 1 giống đối chứng Atlantic được sử dụng đểđánh giá tính mẫn cảm D89-At-Po9 và 1 giống đối chứng Atlantic được sử dụng đểđánh giá tính mẫn cảm với TA ở các nồng độ khác nhau theo công thức dưới đây:
Công thức Môi trường CT0 (ĐC) MS CT0 (ĐC) MS CT1 MS + 100 ppb TA CT2 MS + 200 ppb TA CT3 MS + 300 ppb TA CT4 MS + 400 ppb TA CT5 MS + 500 ppb TA CT6 MS + 600 ppb TA
Các đoạn thân mang một mắt ngủ (đốt thứ 2 tính từ ngọn) của chồi sinh trưởng của mỗi dòng được cấy vào 2 bình môi trường có bổ sung TA và 2 bình môi trưởng của mỗi dòng được cấy vào 2 bình môi trường có bổ sung TA và 2 bình môi trường không bổ sung TA, mỗi bình cấy 5 chồi.
Điều kiện nuôi cấy: 20oC, 16 giờ chiếu sáng/8 giờ tối.
Tiến hành quan sát và theo dõi sau 7, 14, 21 và 28 ngày nuôi cấy.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 đối (Chiều cao tương đối là tỷ lệ chiều cao trung bình chồi ở công thức có bổ sung thaxtomin A so với chiều cao trung bình chồi ở công thức không bổ sung thaxtomin A) của cây thí nghiệm (nuôi cấy trên môi trường có bổ sung TA) so với cây đối chứng (nuôi cấy trên môi trường không bổ sung TA).
Các chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ chồi hình thành (%)= Tổng số chồi hình thành/ tổng số mẫu Tỷ lệ ra rễ(%) = Tổng số chồi hình thành rễ/ tổng số chồi tạo thành Tỷ lệ ra rễ(%) = Tổng số chồi hình thành rễ/ tổng số chồi tạo thành Tỷ lệ chuyển gen(%)= Tổng số cây chuyển gen/ tổng số mẫu
Chiều cao tương đối (%)= chiều cao trung bình chồi (Thí nghiệm)/ chiều cao trung bình chồi (đối chứng)*100. trung bình chồi (đối chứng)*100.
Xử lý số liệu: Các số liệu được xử lý bằng excel.
2.4.4 Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh ghẻ thường bằng lây nhiễm nhân tạo với S.scabies (Wanner, 2006 cải tiến): nhân tạo với S.scabies (Wanner, 2006 cải tiến):
Chuẩn bị dịch khuẩn lây nhiễm
- Nuôi các vi khuẩn Streptomyces trên môi trường YME agar trong 2- 3 tuần - Tạo dịch khuẩn với mật độ tế bào 4* 106 CFU/ml trong 50ml YME ở 280