Nghiên cứu tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 32 123

p m BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI **** CQ **** TRẦN THỊ THANH VÂN NGHIÊN CỨU SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 32.123 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHOÁ 2001-2006) Người hướng dẫn Nơi thực hiện : PGS.TS Cao Văn Thu : Bộ môn Vi sinh- Sinh học Thời gian thực hiện : 01/2006 - 05/2006 HÀ NỘI, THÁNG 05/ 2006 m imQj rpmtfß, HW! 9 00 Z £ ^ tự iỊ Ị ỏ!,^rwũn *rở}i, wg^ p t a m u r i t Ị n i ì Ị Ị Ị i n r i f t m r n t ị y i Ị I f ô j i f f n r n n Ị î t p j t j t i r í t n j r n n p Ị ^ T H Ị i t Ì H Ị i r a i j f j J f m ' ñ ĩ í i r õ j r t ^ P ] } i r í n p ề I n t í n u J Ì M I M Ọ */O T m r t Ị Ị m m p t I t ữ ĩ t v m p i r b n j T H n p Ị ‘ i r o T Ị Ị lấmỊ ^ iprhtỊ rra Jìjn im ifù n K # à^ titßjnfdi *inrrõ Tfnfl ^ Ifknf m jp ^(Jj ' l ã n l ầ T n ũ 1 r i * Ò Ị Ị * ị f Ị Ị ' ứ m ù I * m r ¡ V Ị Ị i r t r i f f j p j r ừ u T H I i r Ì H Ị ^ ' t p n j î T T Ị Ũ ' Ị p r Ị 7 n x f ĩ r m l i f t I * n t 9 i p j y r r b n n p ' V i r b ĩ ^ ử ì f i M t m t Ç ^ fO T T f l ữ ^ t ị M Ị I * n m p J p j ' u i r n r t Ị Ị i ñ r p i m r Ị Ị Ị V Ì T Ị r ỵ p > ò r ị f j V Ọ £ ^ ^ J i Q j ^ > ử ì j T Ì Ỉ Q ^ 'ù iM p jM T f v n r r ú ' h m Ị Ị v m ^ % r í r Ị - ơ T ỉ ( Ị j ' b i t m j d j * r ĩ 7 n ọ £ ^ I t r o r ^ ^ ^ Í ¡ J ^ * p ' ừ ì t ò đ T Ị ' M V i T Ị n r a e . u u ọ ' i r ừ ĩ r i r n n p j i m r b w i f Ị i r ì H h T Ị T t t õ ^ d m h lỊIIIỊ ÌÙÌỊ ÌÌỊỊ Ị Ì ììììỊỊ íìĩỊ rìỏ ìỊ tìỢ ÌỊ'^ ìlh ìO tH ỊỊ ^ộ/f <ff T f > ịp ^ p n j 'ỉt 0 j i ñ íl Q ) ^9L ^(í> 'bupT*^ lềĩHỊ 1bi*infi ^Cí) ^ Ỉ D ^ j n r n f f f n ^ V U 9 i f 9 ‘ t m i Ị Ị 1 * P l u m ' t p n r t f f n m j 9 I t n e ' f m r u i r í m j T n n p ! J ơ f j p * m f Ị l ầ i H n Ị i M f 9 ' d m ù l ị U T ị j k n p * i r ợ p ^ t ỹ ĩ t y l ỷ ỹ t Ị ĩ ự M Ị y j Ị ỵ ^ ĩ r õ i * * m f £ ị J f v f í j n m ^ Ỹ £ ) ' ^ Ơ J 7 f t j ÍW T j r m T T Ú T f u m f f i n n p 1 * P i M ĩ f 9 ^ * 0 ] Ỵ Ị i r m Ị I * n e . I * n I f d j } r ì V Ị Ị 7 p ^ MỤC LỤC Trang ĐẶT VÂN ĐỂ 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Vài nét về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2 1.1.3. Khái niệm về tính kháng kháng sinh 2 1.1.4. Phân loại kháng sinh 3 1.1.5. Sơ đồ mô tả quy trình sản xuất một kháng sinh 4 1.2. Đặc điểm về xạ khuẩn {Actinomycetes) 5 1.2.1. Đặc điểm chung .5 1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 5 1.2.3. Phân loại Streptomyces 7 1.3. Cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh KS 7 1.3.1. Mục đích 7 1.3.2. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 8 1.3.3. Đột biến cải tạo giống 8 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn 9 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9 1.4.1. Khái niệm lên men 9 1.4.2. Các phưoỉng pháp lên men 9 1.5. Chiết tách và tinh chế 11 1.6. Một số nghiên cứu gần đây về vi sinh-kháng sinh 13 1.6.1. Sự tinh khiết và đặc tính của enzym sinh tổng hợp Cephalexin từ chủng Gluconobacter oxydans 13 1.6.2. Sản xuất KS Retamycin từ quá trình lên men có bổ sung chủng Streptomyces olỉndensis 14 1.6.3. Quá trình hấp phụ liên tục acid clavulanic 15 PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 16 2.1.1. Nguyên vật liệu 16 2.1.2. Phương pháp thực nghiệm 21 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 28 2.2.1. Hình thái và phân loại xạ khuẩn Streptomyces 32.123 28 2.2.2. Khả năng sinh tổng hợp KS của Streptomyces 32.123 trên 7 MT 30 2.2.3. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 31 2.2.4. Kết quả đột biến cải tạo giống 32 2.2.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp KS 34 2.2.6. Sự ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của KS 35 2.2.7. Chiết bằng dung môi hữu cơ 36 2.2.8. Trao đổi ion chiết xuất KS 36 2.2.9. Sắc ký lớp mỏng 38 2.2.10. Kết quả thử độ bền nhiệt của KS 39 PHẦN III; KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 40 3.1. Kết luận 40 3.2. Đề xuất 40 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ADN B.cereus B.pumìlus B.subtilis dd Z)(mm) E.coli ISP KS MT p.aeruginosa p.mirabilis s.typhi s.ýlexnerì s.lutea S.aureus v sv : Acid deoxyribonucleic : Bacillus cereus ATCC 9946 : Bacillus pumilus ATCC10441 : Bacillus subtilis ATCC 6633 : Dung dịch : Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn tính theo milimet : Escherichia coli ATCC 25922 : (The International Streptomyces Project) Chương trình Streptomyces quốc tế : Kháng sinh : Môi trường : Pseudomonas aeruginosa VM 201 : Proteus mỉrabỉlis B V 108 : Salmonella typhỉ DT 220 : Shigella flexneri D T122 : Sarcina lutea ATCC 9314 : Staphylococcus aureus ATCC1228 : Vi sinh vât ĐẶT VẤN ĐỂ Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra tác dụng kháng sinh đầu tiên của Penicillium notatum đối với Staphylococcus aureus. Năm 1939, penicillin được sản xuất thành công. Kể từ đó, kháng sinh luôn được coi là thẩn dược, là thứ vũ khí vô cùng lợi hại trong cuộc chiến chống lại bệnh nhiễm trùng. Thế giới nhanh chóng phát triển ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh. Ngày càng nhiều kháng sinh mới được tạo ra và có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Tuy nhiên, nó cũng như con dao hai lưỡi. Chính do việc sử dụng không hợp lý và lạm dụng kháng sinh đã dẫn đến vi khuẩn ngày càng trở nên kháng thuốc. Hơn nữa, bên cạnh lợi ích không thể không cảnh giác với những độc tính của nhiều kháng sinh có thể dẫn đến thương tật và tử vong. Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải đẩy mạnh việc nghiên cứu, sản xuất nhiều kháng sinh mới có hiệu quả điều trị cao, độc tính thấp, ít bị kháng thuốc. Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới. Vì vậy, tỉ lệ bệnh nhiễm trùng rất cao. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân mà nước ta vẫn chưa có điều kiện để phát triển ngành công nghiệp kháng sinh, mới chỉ dừng lại ở nghiên cứu cơ bản. Nước ta có thuận lợi là hệ vi sinh vật rất phong phú, trong đó đáng chú ý là xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Đó là một nguồn sinh kháng sinh lớn vì trong số hơn 8. 0 0 0 kháng sinh hiện nay thì có đến 80% từ xạ khuẩn, trong đó hơn 50% là từ chi Streptomyces. Do vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 32.123” . Chủng Streptomyces 32.123 do Bộ môn Vi sinh- Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội phân lập. Khoá luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau: - Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 32.123, - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, - Bước đầu nghiên cứu lên men ở qui mô phòng thí nghiệm, - Sơ bộ nghiên cứu chiết tách kháng sinh. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. VÀI NÉT VỂ KHÁNG SINH 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [2] Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, ) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp. 1.1.2. Cơ chê tác dụng của kháng sinh [3] Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào v s v làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. Có 6 kiểu chủ yếu: - Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào, - Tác dụng lên màng nguyên sinh chất, - Tác dụng lên sự tổng hợp ADN, - Tác dụng lên sự tổng hợp protein, - Tác dụng lên sự trao đổi chất hô hấp, - Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian. 1.1.3. Khái niệm vê tính kháng kháng sinh [2] Kháng kháng sinh là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh. Về mặt sinh học người ta có các kiểu kháng thuốc khác nhau: - Kháng thuốc nhiễm sắc thể: bao gồm kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc do đột biến. - Kháng thuốc ngoài nhiễm sắc thể: bao gồm khái niệm đa kháng thuốc do nhân tố -R và các cơ chế di truyền như tải nạp, biến nạp, tiếp hợp. Ngoài ra còn khái niệm kháng chéo ở các vi khuẩn có cơ chế kháng như nhau đối với các chất kháng sinh có cấu trúc hóa học gần giống nhau. Để hạn chế hiện tượng kháng kháng sinh cần phải tìm hiểu rõ về cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn, theo 3 cơ chế chủ yếu: - Thay đổi vị trí đích tác dụng, - Thay đổi cấu trúc thành tế bào, - Tiết ra những enzym phân hủy thuốc. 1.1.4. Phân loại kháng sinh [2], [4] Có nhiều cách phân loại KS như; theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hoá học. Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hoá học là khoa học nhất, KS được chia thành các nhóm sau: - KS ß-lactam: + KS Penicillin + KS Cephalosporin - KS Aminoglycosid - KS Macrolid - KS Lincosamid - KS Tetracyclin - KS Phenicol - KS Peptid - KS Quinolon - KS Co- Trimoxazol - Các KS khác: KS chống ung thư, chống nấm 1.1.5. Sơ đồ mô tả quy trình sản xuất một kháng sinh [10] Hình 1: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất một KS 1.2. ĐẶC ĐIỂM VỂ XẠ KHUẨN (ACTINOMYCETES) 1.2.1. Đặc điểm chung [6], [7] > Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Đa số thuộc nhóm Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty). Xạ khuẩn có khả năng sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzym, một số vitamin và acid hữu cơ. Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật và cây trồng. > Đặc điểm cấu tạo tế bào: - Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn khoảng từ 0,2 - 3 |Lim, - Thành tế bào xạ khuẩn dày khoảng 10-20 nm , - Màng nguyên sinh chất dày khoảng 7,5 - 10 nm bao gồm 2 thành phần phospholipid và protein, - Tế bào phân chia theo kiểu vô tính. > Sơ bộ phân loại xạ khuẩn: Actinomycetales i í ^ Actinoplanaceaee Streptomycetaceae Actinomycetaceae ị Streptomyces Hình 2: Sơ đồ vị trí phân loại của chi Streptomyces 1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces [6], [7] > Đặc điểm hình thái: + Khuẩn lạc: - Tạo thành cụm, bề mặt khô, xù xì, được bao phủ bởi một lớp bột mịn như bụi phấn hoặc những sợi nhỏ bông như lông tơ có thể có các nếp toả ra theo hình phóng xạ. [...]... NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 2.2.1 Hình thái và phân loại xạ khuẩn Streptomyces 32. 123 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 32. 123 theo ISP, so sánh với các đặc điểm của xạ khuẩn Streptomyces recỉ/ensis Kết quả giới thiệu ở bảng 4 Bảng 4: Các đặc điểm phân loại ISP của xạ khuẩn Streptomyces 32. 123 và Streptomyces recifensis Xạ khuẩn Đặc Streptomyces 32. 123 Streptomyces recifensis Gy-xám Gy Màu khuẩn ty cơ chất 0... trong những nhiệm vụ hàng đầu của công nghiệp sẩn xuất kháng sinh là cải tạo giống vi sinh vật nhằm các mục đích sau: + Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh + Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên men, tạo ít bọt hơn, + Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn, + Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới tạo ra các liên kết mới, nhóm... chuỗi bào tử xạ khuẩn Streptomyces 32. 123 sau 10 ngày nuôi cấy trên M TISP3 dưới kính hiển vi điện tử Kết quả giới thiệu ở hình 3, 4 Hình 3: Dạng chuỗi bào tử của xạ khuẩn Streptomyces 32. 123 (Độ phóng đại 8.000 lần) Hình 4: Hình ảnh bào tử Streptomyces 32. 123 (Độ phóng đại 15.000 lần) Từ các đặc điểm hình thái và phân loại trên, chúng tôi căn bản kết luận chủng Streptomyces 32. 123 là Streptomyces recỉýensỉs... trong đó có biến chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 10 - 20% những biến chủng khác Cần phải chọn lấy các biến chủng có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp 1.3.3 Đột biến cải tạo giống Các chủng xạ khuẩn mới phân lập, kể cả các chủng sau chọn lọc ngẫu nhiên thường có hoạt tính KS thấp và hiệu suất sinh tổng hợp không cao Do đó để nâng cao năng suất sinh tổng hợp KS của các chủng này người ta thường... recỉýensỉs 2.2.2 Khả năng sinh tổng hợp KS của Streptomyces 32. 123 trên 7 MT Đánh giá hoạt tính KS của xạ khuẩn Streptomyces 32. 123 trên 7 MT khác nhau để lựa chọn MT tốt nhất cho nuôi cấy bề mặt và lên men chìm Thử bằng phương pháp khối thạch Kết quả giới thiệu ở bảng 5 Bảng 5: Kết quả chọn môi trường nuôi cấy VK B.cereus Tham số MTl D(mm) 16,97 10,73 11,08 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 10 ,32 19,01 15,02 15,37... nghịch giữa các ion trong dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi anion gọi là anionit Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lượng 1.6 MỘT SỐ NGHIÊN c ứ u GẦN ĐÂY VỂ VISINH-KHÁNG SINH: 1.6.1 Sự tinh khiết và đặc tính của enzym sinh tổng hợp Cephalexin từ chủng Gluconobacter oxydans... B.pumỉlus và VK Gram(-) là s.flexnerỉ 2.2.3 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên Giống xạ khuẩn Streptomyces 32. 123 đem sàng lọc ngẫu nhiên để chọn biến chủng có khả năng sinh tổng hợp KS cao nhất Thử bằng phương pháp khối thạch Kết quả giới thiệu ở bảng 6 , hình 5 Bảng 6 : Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên trên chủng Streptomyces 32. 123 BC B.pumilus s.ýlexnerí BC D(mm) s Z)(mm) s 1 21,21 0,45 18,65 0,57 17 2 21,91 0,53... định các môi trường cấy thích hợp: Streptomyces 32. 123 được cấy vô trùng trong tủ cấy vô trùng trên 7 MT đặc M Tl, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6 , MTV trong hộp petri, ủ ở 37®c trong 6 ngày Thử hoạt tính KS bằng phương pháp khối thạch, mỗi môi trường làm 3 mẫu song song > Phương pháp iên men gián đoạn: + Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 32. 123 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng (MTl) đủ 6 ngày tuổi... 7amino-3-deacetoxycephalosporanic(7-ADCA) bằng con đường tổng hợp hoá học Phương pháp hóa học có nhược điểm là: qua nhiều giai đoạn, phải bảo vệ nhóm amin của tác nhân acyl và nhóm carboxyl của vòng nhân, loại bỏ yếu tố bảo vệ sau khi gắn ngoài ra còn gây ô nhiễm môi trường Những nghiên cứu về việc sử dụng enzym đã mở ra một hướng đi mới khắc phục được các nhược điểm trên Một số enzym như: enzym sinh tổng hợp cephalexin (CSE), enzym... hỗn hợp KS anthracyclin có tác dụng chống khối u, hiệu quả trong điều trị bệnh bạch cầu cấp, tương tự dunorubicin và doxorubicin Hỗn hợp retamycin có dạng bột màu đỏ, ít tan trong nước, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ (methanol, cloroform) và được sinh tổng hợp từ quá trình lên men chìm chủng Streptomyces olindensis Phương pháp lến men gián đoạn- bổ sung có ưu điểm là kiểm soát được tốc độ sinh . 32. 123, - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, - Bước đầu nghiên cứu lên men ở qui mô phòng thí nghiệm, - Sơ bộ nghiên cứu chiết tách kháng sinh. PHẦN 1: TỔNG. THANH VÂN NGHIÊN CỨU SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 32. 123 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHOÁ 2001-2006) Người hướng dẫn Nơi thực hiện : PGS.TS Cao Văn Thu : Bộ môn Vi sinh- Sinh học Thời. 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Vài nét về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2 1.1.3. Khái niệm về tính kháng kháng sinh 2 1.1.4. Phân loại kháng sinh 3 1.1.5.