Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 21 123

B ộ G IÁ O D Ụ C V À Đ À O T Ạ O TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • B ộ Y TẾ Dược HÀ NỘI • • HOÀNG THỊ THÙY HƯƠNG NGHIÊN Cứ U LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 21.123 Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm & Bào chế M ã số: 60 73 01 LUẬN VĂN THẠC s ĩ DƯỢC HỌC • • • Người hướng dẫn khoa học PGS.TS CAO VĂN THU Hà Nội, năm 2009 • LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS-TS Cao Văn Thu trực tiếp hướng dẫn tơi thực hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên Bộ môn Cơng nghiệp Dược, Bộ mơn Vi Sinh-Sinh Học phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm Tôi xin cảm ơn TS Phan Văn Kiệm, Viện Khoa học Công nghệ giúp đỡ thời gian làm đề tài Cũng này, xin cảm ơn tới ban giám hiệu thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiên thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Tôi xin cảm ơm gia đình bạn bè giúp đỡ ủng hộ tơi q trình học tập thực đề tài cao học Với điều kiện thời gian tiến hành thực nghiệm nhiều hạn chế, chắn đề tài nhiều thiếu sót Tơi mong nhận nhiều ý kiến đóng góp thầy giáo bạn bè để đề tài hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn Hà nôi, ngày 30 tháng 11 năm 2009 Học viên Hoàng Thị Thùy Hương DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT 2,4-DPC 2,4- Dichlorophenol ATCC American Type Culture Collection ADN Acid Deoxyribonucleic Ha Hairy (có lơng) HPLC High-performed Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IR Infrared (hồng ngoại) ISP International Streptomyces Project L-DAP L-Diaminopimelic acid L-DOPA L-diaminopimelic acid MT Môi trường PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase RA Rectinaculiaperti (xoắn đơn, móc câu) RF Rectiflexibiles (thẳng uốn cong) ARN Acid Ribonucleic s Spirales (xoắn) Sm Smooth (nhẵn) Sp Spiny (có gai) UY Ultra violet (tử ngoại) V Veriable (thay đổi) vsv Vi sinh vật w White (màu trắng) Wa Warty (có mụn nhỏ) WY White-Yellow (màu trắng - vàng) Y Yellow (màu vàng) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các đặc trưng Streptomyces 21.123 Streptomyces galỉlaeus 29 Bảng 3.2: Hoạt tính kháng sinh Streptomyces 21.123 loại môi trường: 30 Bảng 3.3: Hoạt tính dịch lọc kháng sinh Streptomyces 21.123 môi trường 1, 2, dịch thể: 32 Bảng 3.4: Kết hoạt tính kháng sinh dạng chủng thu chọn lọc ngẫu nhiên: .33 Bảng 3.5: Hoạt tính kháng sinhcủa dạng chủng sau đột biến lần 1: .35 Bảng 3.6: Hoạt tính kháng sinhcủa chủng đột biến lần 2: 36 Bảng 3.7: Hoạt tính kháng sinhcủa chủng đột biến lần 3: 38 Bảng 3.8: Hoạt tính kháng sinhcủa chủng CLTN đột biến: 40 Bảng 3.9: Kết chiết kháng sinh dung môi hữu (DMHC) pH khác nhau: 42 Bảng 3.10 : Kết sắc ký lớp mỏng B subtilis: 43 Bảng 3.11: Kết hoạt tính kháng sinh phân đoạn sau chạy sắc ký cột silicagel: 44 Bảng 3.12: Kết sắc ký lóp mỏng phân đoạn có hoạt tính kháng sinh với hệ dung mơi 3’ 45 Bảng 3.13: Hoạt tính kháng sinh phân đoạn chạy sắc ký cột oxit nhôm: 46 Bảng 3.14: Kết sắc ký lớp mỏng phân đoạn kháng sinh sắc ký lỏng cột (vi khuẩn kiểm định: p mirabilis) : 47 Bảng 3.15: Các đặc trưng phổ NMR chất so với actinomycin D 51 MUC LUC • • MỤC L Ụ C ĐẶT VẤN Đề Chương TỎNG QUAN 1.1 Xa khuẩn 1.1.1 Đặc điếm sinh học Xạ khuấn: .3 1.1.2 Phân loại Streptomyces 1.1.2.1 Phân loại định tên Streptomyces theo ISP: ỉ 1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 1.1.2.3 Phân loại sổ (Numerical taxonomy) 1.1.2.4 Phân loại định tên theo phương pháp giải trình tự gen: 1.1.3 Sinh tong hợp khảng sinh Xạ khuấn: 1.2 Sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 10 ỉ 2.1 Lên men sinh tong hợp kháng sinh 10 1.2.2 Chiết tách, tỉnh chế 13 1.2.3 Cải tạo giống v s v 16 Chương ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 18 2.1.Nguyên liệu .18 2.1.1 Vỉ sinh vậ t 18 2.1.2 Hóa chất sinh phẩm 18 2.1.3 Thiết b ị .19 2.1.4 Môi trường 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp phân loại Streptomyces 21.123 theo ISP 20 2.2.2 Phương pháp giữ giống ống nghiêm 21 2.2.3 Phương pháp sàng lọc ngâu nhiên 22 2.2.4 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằngphưomgpháp khuếch tản 22 2.2.5 Lên men sinh tong hợp kháng sinh 24 2.2.6 Phương pháp đột biến ánh sáng u v .24 2.2.7 Phương pháp lên men gián đoạn 25 2.2.8 Phương pháp chiết kháng sinh dung môi hữu 25 2.2.9 Thu bột kháng sinh phương pháp cất quay 25 2.2.10 Phương pháp tỉnh chế kháng sinh sắc k ỷ 26 2.2.11 Xác định cấu trúc phân tử kháng sinh phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) phổ khối (MS) 27 2.2.12 Định tên khoa học Streptomyces phương pháp sinh học phân tử 27 Chương KẾT QUẢ 29 3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA STREPTOMYCES 21.123 29 3.1.1 Đặc điếm phân loại theo ISP 29 3.1.2 Khả sinh tong hợp khảng sinh chủng Streptomyces 21.123 môi trường khác .30 3.2 NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH 32 3.2 ỉ Kết chọn lọc ngẫu nhiên .32 3.2.2 Kết đột biến nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 21.123 34 3.2.3 Kết chọn lọc biến chủng cỏ khả sinh tong hợp kháng sinh tốt môi trường dịch thể: 39 3.3 CHIẾT XUẤT VÀ BƯỚC ĐẦU TINH CHÉ KHÁNG SINH TỪ DỊCH LỌC .41 3.3 ỉ Chiết kháng sinh dung môi hữu 41 3.3.2 Sắc ký lớp mỏng thăm dò thành phần kháng sinh từ dịch lọc 43 3.3.3 Kết tỉnh chế khảng sinh sắc ký cột 43 3.4 KẾT QUẢ CÁC PHÓ VÀ BIỆN GIẢI CẤU TRÚC THÀNH PHẦN KHÁNG SINH CHÍNH CỦA STREPTOMYCES 21.123 48 3.4.1 Phổ hồng ngoại 48 3.4.2 Phổ khối cộng hưởng từ hạt nhân: 49 3.4 ĐỊNH TÊN STREPTOMYCES 21.123 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN T Ử : 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 ĐẶT VẤN ĐÈ • Tác dụng kháng sinh phát năm 1928, nhiên, việc sản xuất penicillin phải tới đầu năm 40 kỷ 20 Đây bước ngoặt lịch sử nhân loại nói chung y học nói riêng, mở kỷ nguyên việc phòng chữa bệnh nhiễm trùng Cho đến nay, cấu bệnh tật thay đổi, bệnh nhiễm trùng không chiếm tỷ lệ cao trước việc nghiên cứu kháng sinh đề tài hấp dẫn Cùng với lạm dụng kháng sinh, việc kháng thuốc trở nên phổ biến, thêm vào phát sinh nhiều bệnh virus vi khuẩn gây nên: bệnh SARS - hội chứng viêm phổi cấp, bệnh cúm H5N1 liên quan đến gia cầm, bệnh liên cầu có nguồn gốc từ lợn, cúm H]Ni, việc nghiên cứu kháng sinh có vai trò quan trọng [17] Giai đoạn đầu kỷ nguyên kháng sinh, nấm (với kháng sinh: penicillin, greseofulvin ) vi khuẩn (gramicidin) ý, sau phát minh streptomycin, chloramphenicol, tetracyclin macrolid, ý lại chuyển sang loài Streptomyces Trong năm 50 60 phần lớn kháng sinh (-70%) phát từ loài Hai thập kỷ tiếp theo, số lượng kháng sinh từ xạ khuẩn gia tăng, chiếm 20-30% Từ đầu năm 90, kháng sinh từ nấm vi khuẩn gia tăng, tỷ lệ kháng sinh từ xạ khuẩn giảm xuống [1], [4], [26] Ngày nay, có giảm sút tỷ lệ, sản phẩm sinh học có nguồn gốc xạ khuẩn chiếm 45% tổng số chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học, 10000 chất (trong 34% từ Streptomyces, 11% từ xạ khuẩn hiếm) xạ khuẩn chiếm phần quan trọng sản xuất kháng sinh Trong số kháng sinh chất có hoạt tính sinh học tương tự biết (khoảng 22500) có 1% (khoảng 150) sử dụng trực tiếp người làm thuốc thú y, sử dụng nông nghiệp Trong điều trị người khoảng 100 chất, nhiều từ xạ khuẩn [6 ], [26] Viêt Nam nước có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho phát triển v s v nói chung xạ khuẩn nói riêng Từ trước đến nay, ngành công nghiệp dược phẩm nước phải nhập hoạt chất kháng sinh Tiến tới công nghiệp dược phẩm tự chủ việc nghiên cứu sản xuất nguyên liệu quan trọng Đó lí chúng tơi chọn đề tài ’’Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 21.123 ” với mục tiêu sau: • Định tên loài cho Streptomyces 21.123 phương pháp sinh học phân tử • Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 21.123 • Chiết tách, tinh kháng sinh Streptomyces 21.123 từ dịch lên men • Nghiên cứu số tính chất kháng sinh: phổ hồng ngoại, tử ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân Chương TỎNG QUAN 1.1 Xa khuẩn 1.1.1 Đặc điểm sinh học Xạ• khuẩn: • • Xạ khuẩn nhóm vi khuẩn đặc biệt Chúng có khuấn lạc khơ đa sơ có dạng hình phóng xạ khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh nấm Vì xạ khuẩn có cấu trúc nhân nguyên thuỷ vi khuẩn khác, chiều ngang sợi nhỏ vi khuẩn, có tài liệu gọi chúng nấm tỉa không hợp lý Xạ khuẩn phân bố rộng rãi tự nhiên, số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU- colony-forming unit) xạ khuẩn lg đất thường đạt tới hàng triệu Trên mơi trường đặc đa số xạ khuẩn có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) khuẩn ty chất (substrate mycelium) Nhiều loại có khuẩn ty chất có loại (như chi Sporichthyà) lại có khuẩn ty khí sinh [2], [7] Giữa khuẩn lạc thường thấy có nhiều bào tử màng mỏng gọi bào tử trần (conidia hay conidiospores) Nếu bào tử nằm bào nang (sporangium) gọi nang bào tử hay bào tử kín (sporangiospores) Bào tử xạ khuẩn sinh đầu số khuẩn ty theo kiểu hình thành vách ngăn (septa) Các chuỗi bào tử trần bào tử (như Thermoactinomyces, Saccharomonospora, Promỉcromonospora, Mỉcromonospora, Thermomonosspora ), có bào tử (như Mỉcrobispora), chuỗi ngắn (như Nocardia, Pseudonocardia, Streptoverticillỉum, Sporichthya, Actinomadura, Microtetraspora, Streptoalloteichus, Glycomyces, Amycoỉata, Amycolatopsỉs, Catellatospora, Microellobosporỉa ), chuỗi dài (như Streptomyces, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Kỉbdeỉosporangium, Kitasatosporia, Saccharothrỉx, nhiều loài Nocardỉa, Nocardỉoỉdes, Pseudonocardia, E-t CU w I g cn rH Ộ I on r-j y Q Ọ I rH d Ej 00 o cn ẼH w w Q Phụ lục 18: Phổ 13c NMR chất Phụ lục 19: Phổ HSQC chất -*r Phụ lục 20: Phổ HSQC chất Phụ lục 21: Phổ HSQC chất STR1-CDC13-HSQC Phụ lục 22: Phổ HSQC chất STR1-CDC13-HMBC Phụ lục 23: Phổ HMBC chất STR1-CDC13-HMBC A m ẩU ppm 125 130 135 140 145 150 155 160 165 [-170 Ì7S -180 105 -190 195 -200 205 21Ị 8 7 Phu• luc 24: Phổ HMBC chất • 5 5 Phu luc 25: Phổ HMBC chất STR1-CDC13-HMBC Phu luc 26: Phổ HMBC chất STR1-CDC13-HMBC —I—■ —•—