Nghiên cứu sản xuất sản phẩm rau quả muối chua ở quy mô lớn

Từ hai chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ sản phẩm rau cải bẹ muối tự nhiên theo phương pháp truyền thống và một chủng Lactococcus lactic sử dụng trong quá trình lên men tạo axit lactic từ rỉ đường mía Việt Nam

MỞ ĐẦU

Rau quả là những thức ăn thiết yếu của con người Rau quả cung cấp cho con người những thành phần quan trọng như: protein, lipit, vitamin, muối khoáng, axit hữu cơ, chất thơm và chất xơ Rau quả được sử dụng dưới hai hình thức là rau quả ăn tươi, xào hoặc nấu và rau quả muối chua Đời sống ngày càng cao thì nhu cầu về rau quả càng phong phú và đa dạng, đủ về số lượng, tốt về chất lượng và an toàn đối với con người

Rau quả muối chua là những sản phẩm chế biến từ rau quả, bằng cách làm cho đường có sẵn trong nguyên liệu hoặc đường bổ sung thêm vào chuyển hóa thành axit lactic do quá trình lên men lactic bởi các vi khuẩn lactic Axit lactic và các sản phẩm khác của quá trình lên men lactic tạo cho sản phẩm rau quả muối chua hương vị đặc trưng Ngoài ra axit lactic có khả năng ức chế hoạt động của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng sản phẩm do đó rau quả muối chua có thể bảo quản lâu ngày Vì vậy có thể nói rau quả muối chua là nhu cầu không thể thiếu được của người dân Việt Nam

Các sản phẩm rau quả muối chua như rau cải bẹ, cà muối, su hào muối, bắp cải muối đó là những sản phẩm truyền thống được nhân dân ta sử dụng từ rất lâu đời, nó phù hợp với khẩu vị và món ăn của người Việt Nam Những nguyên liệu dùng để muối chua như cải bẹ, cà pháo, cà bát, su hào, bắp cải đều

là những nguyên liệu có thể trồng quanh năm, năng suất cao, dễ trồng và thời gian trồng ngắn

Hiện nay ở nước ta các sản phẩm rau quả muối chua chủ yếu được sản xuất ở mức độ thủ công, lên men tự nhiên và mới bắt đầu sản xuất công nghiệp ở qui mô nhỏ Do đó năng suất thấp, chất lượng không đồng đều, có độ rủi ro cao, thời gian sử dụng ngắn Vấn đề đặt ra hiện nay là phải tạo ra những sản phẩm rau quả muối có chất lượng ổn định, đồng đều, có thời gian bảo quản lâu và sản xuất

với năng suất lớn Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tôi đã đi sâu “ Nghiên cứu sản xuất sản phẩm rau quả muối chua ở quy mô lớn”

Mục tiêu chính của chúng tôi là :

1/ Từ hai chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ sản phẩm rau cải bẹ muối tự

nhiên theo phương pháp truyền thống và một chủng Lactococcus lactic sử dụng

trong quá trình lên men tạo axit lactic từ rỉ đường mía Việt Nam , chọn ra chủng thích hợp nhất cho quá trình muối chua các sản phẩm rau quả.

2/ Ứng dụng chủng vi khuẩn lactic đã chọn trong quá trình muối chua rau quả

Nghiên cứu đưa ra qui trình công nghệ tối ưu cho quá trình sản xuất các sản

phẩm rau quả muối chua

3/ Nghiên cứu phương pháp thích hợp để bảo quản những sản phẩm rau quả muối chua

PHẦN I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1 Khái quát tình hình sản xuất và tiêu thụ rau quả muối chua trên thế giới và ở Việt Nam

Sự lên men lactic được ứng dụng rộng rãi trong đời sống hàng ngày cũng như trong nông nghiệp, trong công nghiệp, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm Từ rất lâu co người đã sử dụng những sản phẩm của quá trình lên men lactic như sữa chua, phomat, hải sản muối và các sản phẩm rau quả muối chua Khác với các sản phẩm khác, sản phẩm rau quả muối chua chủ yếu được sản xuất ở qui mô gia đình trong điều kiện thủ công Hiện nay một số nước đã đưa việc sản xuất các sản phẩm trên ở qui mô công nghiệp, đi đầu là Nhật Bản, Hàn Quốc, Philipine và Thái Lan Còn ở châu Âu, công nghệ lên men lactic được ứng dụng với những nguyên liệu rau quả như bắp cải, dưa chuột, ôliu, cà rốt, cà chua, tảo biển Theo số liệu năm 1992 mỗi năm người Pháp sử dụng 47.000 tấn bắp cải muối có giá trị 200 triệu Frăng, được sản xuất ở 51 xí nghiệp Bảng sau đưa ra sự đánh giá tương quan về sản xuất bắp cải và bắp cải muối ở Pháp từ năm 1985 đến năm 1992 [1]:

Bảng 1 : Tương quan về sản xuất bắp cải và bắp cải muối ở Pháp

Bảng trên cho thấy lượng bắp cải muối có biến động nhưng không đáng

kể và chiếm khoảng 50% tổng sản lượng bắp cải của Pháp

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về các sản phẩm rau quả lên men Như Pederson(1930 - 1960) nghiên cứu về quá trình lên men của bắp cải, năm

1971, ông nghiên cứu về quá trình lên men của suplơ Niketic, Aleksic và các cộng sự đã nghiên cứu quá trình lên men ở cà rốt, Beltran- Edeze, Fernandez nghiên cứu về cà chua, Huber và Dupuy (1994) về tảo Aubert (1985) và

Schoneck (1988) đã đưa ra kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu sự lên men tự nhiên của cà rốt, dưa chuột, củ cải, củ cải đường, hành Nhờ những nghiên cứu này mà ở châu Âu các sản phẩm rau quả lên men đã được sản xuất ở qui mô công nghiệp[1]

Châu Mỹ và châu phi sản xuất và tiêu thụ các sản phẩm rau quả muối chua ít hơn so với châu Á và châu Âu Các sản phẩm chính của họ như dưa muối của châu Mỹ và gari của châu Phi [1]

Ở Việt Nam, dưa muối có thể được coi là sản phẩm truyền thống của dân tộc Từ giữa thế kỷ 18 đến giữa thế kỷ 19 nhân dân ta đã tiếp thu kinh nghiệm của người Hoa làm ra dưa muối từ các loại rau, củ, quả Có hai loại dưa - dưa muối xổi thường dùng các loại rau cải non, các loại củ, quả cắt nhỏ, ngâm trong dấm có thể ăn ngay sau khi muối một thời gian ngắn, còn loại thứ hai là dưa muối để lâu dùng các loại cải bẹ, cà, hành, dưa chuột, xơ mít Cách muối truyền thống thường rất đơn giản, rau củ rửa sạch, để ráo nước cho nguyên liệu hơi héo rồi xếp vại, thêm muối, đường, gia vị, giữ được trong thời gian tương đối dài từ vài ngày đến vài tuần, một số loại như cà muối mặn có thể để được hàng tháng

Các sản phẩm rau, củ, quả muối được sản xuất quanh năm, mùa đông, mùa xuân có cải bẹ muối, hành muối, bắp cải muối còn mùa hè, mùa thu có cà muối, dưa chuột muối Các sản phẩm trên được tiêu thụ với số lượng lớn tuy nhiên chủ yếu được sản xuất ở qui mô gia đình Một số sản phẩm như dưa chuột muối, cà muối, hành muối đã bắt đầu được sản xuất ở một số nhà máy, ở qui mô bán công nghiệp nhưng số lượng không đáng kể

Trong những năm gần đây ở nước ta đã có một số công trình nghiên cứu

về quá trình lên men lactic của một số loại rau quả chủ yếu là dưa chuột và bắp cải Tuy nhiên những công trình nghiên cứu về các sản phẩm rau quả muối chua còn chưa nhiều và chưa thật sự đi sâu [7], [9],[11]

I.2 Công nghệ muối chua rau quả

Rau quả muối chua là sản phẩm chế biến từ rau quả, bằng cách làm cho chất đường có sẵn trong rau quả hoặc đường bổ sung thêm vào chuyển hóa thành axit lactic, do quá trình lên men lactic bởi các vi sinh vật lactic Axit lactic

và các sản phẩm khác của quá trình lên men lactic tạo cho sản phẩm một hương

vị đặc trưng Axit lactic tạo thành trong quá trình lên men lactic làm giảm pH

của sản phẩm do đó có khả năng ức chế được sự hoạt động của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng sản phẩm vì thế các sản phẩm rau quả muối chua có thể bảo quản dài ngày.

I.2.1 Nguyên liệu dùng muối chua rau quả

Có thể sử dụng rất nhiều loại nguyên liệu để sản xuất ra các sản phẩm rau quả muối chua như cải bẹ, dưa chuột, cà chua, cà, bắp cải, cải trắng, su hào, hành, cà rốt, tảo Mỗi một quốc gia và vùng khác nhau lại có những sản phẩm rau quả muối chua truyền thống đặc trưng Sau đây là một số nguyên liệu dùng muối chua thường sử dụng :

I.2.1.1 Cải bẹ

Tên khoa học là : Brassica campestrus L hay còn gọi là nhóm cải dưa, gồm các giống cải như cải Đông Dư, cải bẹ Nam (cải mào gà), cải Hà Lưỡng, cải Lạng Sơn, cải tàu cuốn

Đặc điểm của nhóm cải bẹ là có lá to, lá rất lớn, một cây có thể nặng từ 2-3 kg, thời gian sinh trưởng dài thường từ 120 - 160 ngày Tuy nhiên hiện nay một số giống cải mới như cải Đông Dư thì thời gian sinh trưởng ngắn chỉ khoảng

30 - 45 ngày, thường được trồng từ tháng 6 đến tháng 9 Cải có bộ rễ ăn nông trên tầng đất màu, bộ lá khá phát triển, to bản nhưng chịu hạn kém và dễ bị sâu bệnh phá hoại [3], [24], [25]

Hiện nay có rất ít những công trình nghiên cứu về rau cải bẹ Theo Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi [24] thì thành phần của rau cải bẹ như sau:

Bảng 2 : Thành phần của rau cải bẹ, %

Nước Protein Đường Chất Tro Vitamin, mg%

Khác với các loại rau quả khác cải bẹ chỉ có một ứng dụng duy nhất là muối dưa, rất ít khi dùng nấu canh hay xào nấu Dưa cải bẹ là một trong những sản phẩm muối chua phổ biến nhất ở nước ta Độ già của rau tốt nhất ở mức độ bánh tẻ, mới chớm có hoa, không sử dụng dưa quá già hay quá non Nên sử dụng

cây dưa có bẹ, khối lượng trung bình mỗi cây từ 1 - 2 kg với hàm lượng đường trung bình trong nguyên liệu từ 2 - 2,5%

I.2.1.2 Dưa chuột

Dưa chuột muối là một trong những sản phẩm rau muối chua phổ biến nhất trên thế giới Dưa chuột là một loại rau ngắn ngày thuộc họ bầu bí , vụ chính từ tháng 3 đến tháng 5 Dưa chuột có ba loại chính là loại nhỏ, loại trung bình và loại lớn Dưa chuột dùng để muối chau cần phải là dưa non, hạt nhỏ, ít ruột thịt quả trắc, vỏ mỏng, buồng hạt của quả không lớn và chưa già Để sản phẩm có chất lượng tốt nguyên liệu cần tươi tốt, thời gian từ lúc thu hái đến lúc đưa vào sử dụng không nên quá 24 h Kích thước quả dưa và hàm lượng đường trong dưa ảnh hưởng lớn đến chất lượng của sản phẩm Trong giống dưa quả nhỏ hàm lượng đường cao hơn so với dưa quả to Vì vậy giống dưa quả nhỏ cho sản phẩm có chất lượng cao hơn giống dưa quả to Dưa chuột dùng muối chua có hàm lượng đường không thấp hơn 2%[7]

I.2.1.4 Bắp cải

Bắp cải là một cây rau được trồng và sử dụng nhiều ở nước ta Không phải tất cả các loại bắp cải đều có thể sử dụng để muối chua Để muối chua cần dùng loại nguyên liệu có hàm lượng đường cao và mô lá không quá giòn để sản phẩm đỡ gẫy nát Độ chín kỹ thuật của bắp cải biểu hiện ở chỗ: lá cuốn thật chặt, hàm lượng chất khô khoảng 10% trong đó bao gồm 4 - 5% đường, 1 - 2% protein để tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển thuận lợi Bắp cải chứa nhiều vitamin C (26 - 60 mg%) và trong quá trình muối chua vitamin ít bị tổn thất Dùng bắp cải to lợi hơn vì tỷ lệ phế liệu thấp hơn so với bắp cải nhỏ Không dùng bắp cải quá non, quá già hoặc bị sâu bệnh Bắp cải tươi được lưu vài ngày trong kho thông gió tốt để bắp cải hơi héo, khi cắt nhỏ đỡ dập nát Trước khi muối cắt bỏ những lá xanh và lá khuyết tật Có thể tận dụng lõi bắp cải vì trong

lõi có chứa nhiều đường và axit ascorbic Sau đây là thành phần chính của một

số loại bắp cải được trồng ở Việt Nam :

Bảng 3 : Thành phần hóa học của một số loại bắp cải (%)

Đường saccaroz a

Chất xơ

Protein Tro Axit

ascorbic, mg%

Bắp cải

trắng 4,9-14.0 2,0-5,7 0,0-1,2 0,4-1,3 0,6-2,7 0,6-0,7 20-94Bắp cải

đỏ 8,8-10,4 3,7-5,2 0,0-0,9 0,9-1,2 1,4-1,6 0,7 33-64

I.2.1.5 Cà chua

Cà chua là một loại quả có thể sử dụng tất cả các độ chín khác nhau để muối chua như : cà chua xanh, cà chau ương, cà chua chín nhưng phải muối riêng từng độ chín khác nhau Sau khi đã loại bỏ những quả khuyết tật và không hợp quy cách, cà chua được phân cỡ rồi rửa sạch và tiến hành muối trong những thùng hoặc vại

I.2.2 Phương pháp muối chua truyền thống (muối chua tự nhiên)

Các sản phẩm rau quả muối chua là những sản phẩm truyền thống, nó được nhân dân ta sử dụng từ rất lâu Năm 1829 cải trắng đã được trồng ở nghiên cứu ta và là tiền thân của những loại cải ngày nay Từ giữa thế kỷ 18 đầu thế kỷ

19, nhân dân ta đã tiếp thu kinh nghiệm của người Hoa về sản xuất và chế biến một số loại như cải thìa, cải bẹ dùng để muối dưa hoặc làm ca-la thầu [3] Bên cạnh sản phẩm chủ yếu là dưa cải bẹ nhân dân ta còn sử dụng rất nhiều loại nguyên liệu khác nhau để muối dưa như cà bát, cà pháo, cải bắp, hành, quả sung, quả trám, su hào, xơ mít, rau cần Mỗi loại nguyên liệu cũng như mỗi vùng miền đều có một cách thức muối chua riêng Nhưng nhìn chung phương pháp muối chua rau quả truyền thống được thực hiện như sau: tùy từng loại nguyên liệu mà lựa chọn độ non già khác nhau Trong muối chua truyền thống nhân dân ta thường sử dụng gia vị để muối kèm với nguyên liệu như : khi muối

cà thường cho thêm một chút tỏi hoặc giềng, khi muối dưa cải bẹ thì cho hành hoặc kiệu, khi muối bắp cải thì cho hành, rau răm hoặc rau cần Các gia vị có rất nhiều vai trò trong quá trình muối chua như làm tăng hương vị và giá trị cảm

quan cho sản phẩm, tăng hàm lượng đường cho dưa, một số loại gia vị có tác dụng ức chế một số vi sinh vật lạ Nguyên liệu được lựa chọn, cắt bỏ những phần già, dập nát hoặc sâu bệnh Theo như kinh nghiệm của nhân dân nguyên liệu thường được để héo bằng cách phơi nắng một thời gian, cũng có thể muối nguyên liệu tươi mà không cần để héo

Sau đó nguyên liệu và gia vị được rửa sạch, để ráo, sau đó xếp vại Dịch dùng muối chua bao gồm nước, muối, có thể bổ sung đường hoặc không Tùy từng loại sản phẩm và nhu cầu thói quen của người sử dụng mà lượng muối dùng cho muối chau có thể khác nhau, thường từ 3-10% so với nguyên liệu Lượng dịch cho vào thường gần bằng hoặc ngập nguyên liệu Dịch pha xong được rót vào vại đã chứa sẵn nguyên liệu Sau đó nén vỉ, đậy lại, một số sản phẩm cần phải nén với một lực lớn như su hào muối, cà muối

Tùy từng sản phẩm mà nồng độ muối cho vào, nhiệt độ môi trường bên ngoài mà thời gian muối khác nhau: thường đối với dưa cải bẹ, cà pháo, muối với nồng độ muối với nồng độ thấp thì sau 3-5 ngày là được Còn những sản phẩm như su hào muối, dưa chuột, cà bát thì lâu hơn Thông thường các sản phẩm muối chua truyền thống thường chỉ sử dụng trong một thời gian ngắn, tuy nhiên có một số những sản phẩm đặc biệt như nhút (làm từ xơ mít) ở miền Trung, cà muối mặn ở một số vùng ở miền Bắc có thể bảo quản trong thời gian vài tháng

Nói chung các sản phẩm muối chua theo phương pháp truyền thống thường có chất lượng không ổn định, không đồng đều, mức độ hư hỏng lớn, thời gian bảo quản ngắn Và chỉ sản xuất ở quy mô gia đình nên năng suất thấp

I.2.3 Muối chua ở quy mô công nghiệp

Trên thế giới hiện nay đặc biệt ở một số nước châu Á các sản phẩm rau quả muối chua đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp như [11]:

1/ Dưa chua Nhật Bản (Takana Zuke) : Làm từ nguyên liệu chính : lá rau cải 80 85%, ớt đỏ 0,5%, muối 15 20% Trong đó trên 90% sản phẩm này được sản xuất trên qui mô công nghiệp

2/ Dưa chua Triều Tiên (Baechô Kim Chi): Có thành phần nguyên liệu

là cải trắng 90%, hành 2,0%, ớt 2,0%, gừng 0,5%, muối 2,5-3% Hàng năm sản

xuất khoảng 800.000 tấn trong đó trên 90% sản xuất ở qui mô công nghiệp, chỉ khoảng 10% sản xuất theo phương pháp thủ công.

3/ Dưa chua Thái Lan (Pak gaad dong) : Được làm từ lá rau cải đắng 90%, muối 8%, nước cháo gạo 2% Sản xuất khoảng 4,6 triệu tấn/ năm nhưng chủ yếu sản xuất theo phương pháp thủ công

4/ Trái cây muối chua của Philipine (Byrong prutas) Nguyên liệu: trái cây100%, muối 2,25-2,5%, đường 1% Trong đó trên 90% là sản xuất thủ công và khoảng 10% được sản xuất công nghiệp

Còn ở Việt Nam thì các sản phẩm rau quả muối chua chủ yếu được sản xuất thủ công ở quy mô gia đình chỉ có một số sản phẩm được sản xuất ở quy mô bán cơ giới

Trong công nghiệp, đặc biệt ở các nước châu Âu thì quá trình muối chua các sản phẩm rau quả được tiến hành trong những bể có thể tích lớn, quá trình lên men lactic diễn ra ở nhiệt độ thấp, thời gian dài Có thể làm tăng chất lượng sản phẩm bằng cách sử dụng chủng vi sinh vật lên men lactic thuần khiết được đưa vào dưới dạng dịch men, được phun đều lên trên bề mặt của từng lớp nguyên liệu trong bể muối Để điều chế dịch men sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết, không sinh hơi và nấm men mà các cơ sở chế biến nhận về dưới dạng lỏng chứa trong các chai thủy tinh Điều chế dịch men bằng cách nhân giống các chủng vi sinh vật thuần khiết, nấm men và vi khuẩn phải được nhân giống riêng sau đó mới trộn lại với nhau

Môi trường dùng điều chế dịch men thường là nước dưa cũ và dịch chiết bắp cải (đối với muối bắp cải còn đối với các sản phẩm khác có thể thay thế bằng loại môi trường khác) Sau ngày thứ ba hoặc thứ tư tính từ ngày bắt đầu muối, lấy nước ra khỏi bể muối Không nên lấy nước dưa ở thời điểm muộn hơn vì khi

đó nước dưa chỉ còn lại ít chất dinh dưỡng do các vi sinh vật đã sử dụng để lên men lactic Nếu nước lấy ra ở bể chưa đủ số lượng cần thiết thì bổ sung thêm nước với tỷ lệ 1:1 và cho thêm đường với tỷ lệ 1% so với tổng lượng nước dưa

và nước lã Lọc rồi đun sôi sau 1 giờ để tiệt trùng Canh bắp cải được điều chế bằng cách nấu bắp cải tươit nước, cứ 100 lít nước nấu với 20-25 kg bắp cải Khi bắp cải đã nhừ lọc lấy nước để pha với nước dưa

Để loại trừ vi sinh vật lạ phát triển thì môi trường cần được tiệt trùng bằng hơi nước ở 105-1100C trong thời gian 30-40 phút Sau đó môi trường được

đổ vào thùng gỗ làm nguội xuống 35 0C rồi cho vào thùng 1% dịch men thuần khiết, khuấy đều rồi để 3 ngày ở 25-300C Sau khi đã nhân giống vi khuẩn và nấm men riêng rẽ thì trộn lẫn với nhau và cho vào bể muối nguyên liệu theo tỷ lệ 1,25% (trong đó gồm 1% dich vi khuẩn và 0,25% dịch nấm men)

Sau khi lên men lactic đạt đến nồng độ axit lactic cần thiết thì tiến hành hạ nhiệt độ để quá trình lên men xảy ra chậm, tránh tổn thất axit, vitamin C làm cho sản phẩm có chất lượng tốt hơn Sau đó sản phẩm thường được bảo quản ở nhiệt

độ thấp trong thời gian dài Khi sử dụng chủng vi sinh vật thuần khiết trong quá trình muối chua rau quả thì sản phẩm thu được có chất lượng ổn định, có thể bảo quản trong thời gian dài [7]

I.2.4 Các giai đoạn của quá trình lên men lactic

Quá trình lên men lactic trong các sản phẩm rau quả muối chua có thể phân ra làm ba giai đoạn Trong giai đoạn đầu do muối ăn gây áp suất thẩm thấu lớn nên đường và các chất dinh dưỡng khác trong nguyên liệu được khuyếch tán vào trong nước và các vi sinh vật bắt đầu hoạt động Trên bề mặt của nước muối xuất hiện các bọt khí đó là do hoạt động của một số vi khuẩn coli và một số vi sinh vật có khả năng sinh khí khác Chủng vi khuẩn lactic phát triển chủ yếu

trong thời kỳ này là Leuconostoc mesenteroides Đó là loại cầu khuẩn có khả

năng sinh axit lactic và sinh khí, sự tích tụ axit lactic trong giai đoạn này là thấp

Trong giai đoạn thứ hai, các vi khuẩn lactic phát triển mạnh mẽ và axit lactic được tích tụ nhiều, phần lớn các vi khuẩn gây thối bị ức chế vì độ pH của môi trường giảm xuống 3-3,5 Thời kỳ này là thời kỳ quan trọng của quá trình lên men lactic vì sản phẩm tích tụ được lượng axit lactic cao và có hương vị đặc trưng của sản phẩm

Trong thời kỳ thứ ba, khi axit lactic đã tích tụ với lượng lớn thì ngay bản thân vi khuẩn lactic cũng bị ức chế Khi đó các nấm men và nấm mốc có khả năng phát triển mạnh làm giảm chất lượng sản phẩm vì chúng có khả năng phân hủy axit lactic mạnh Vì vậy cần ngăn chặn giai đoạn này bằng cách bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ thấp hoặc ở điều kiện yếm khí [7]

I.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic là nồng độ muối ăn, hàm lượng đường trong sản phẩm (đường có sẵn trong nguyên liệu và đường bổ sung thêm vào), độ pH của sản phẩm, hệ vi sinh vật trong sản phẩm và nhiệt độ môi trường

Dung dịch muối ăn với nồng độ tương đối cao sẽ ức chế sự phát triển của các vi sinh vật lạ và cả vi khuẩn lactic Khi tiến hành muối chua rau quả cần tạo điều kiện cho các vi khuẩn lactic phát triển và ức chế các vi sinh vật lạ Do vậy cần sử dụng nồng độ muối không quá cao : thường sử dụng muối ăn với nồng độ 4-6% hoặc nước muối với nồng độ 6-10%

Đường trong quá trình muối chua rau quả là nguồn tạo axit lactic Trong trường hợp đường trong nguyên liệu không đủ thì hàm lượng axit lactic tích tụ trong sản phẩm cũng không đạt mức yêu cầu Khi đó sản phẩm có hương vị kém

và dễ bị hư hỏng trong quá trình bảo quản Vì vậy khi muối chua cần chọn loại nguyên liệu có hàm lượng đường đạt mức yêu cầu và khi cần thì phải bổ sung thêm đường

Độ axit trong sản phẩm cũng ảnh hưởng lớn tới quá trình muối chua vì các

vi sinh vật rất nhạy cảm đối với pH môi trường (pH tối ưu của vi khuẩn lactic là 5,5- 6,5) Trong quá trình lên men của rau quả muối chua axit lactic tích tụ với hàm lượng 0,5% cũng đã ức chế hoạt động của nhiều vi sinh vật lạ gây ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men Khi tích tụ axit lactic với hàm lượng cao (1-2%) thì ngay cả các vi khuẩn lactic cũng bị ức chế và do đó quá trình lên men lactic bị kìm hãm Nồng độ axit lactic giới hạn đạt được trong quá trình lên men lactic phụ thuộc vào lượng đường có sẵn trong nguyên liệu , ồng độ muối, nhiệt

độ lên men và loại vi khuẩn lactic Tuy nhiên axit lactic không ức chế hoạt động của một số nấm men nấm mốc

Nhiệt độ lên men ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và tới chất lượng sản phẩm Ở nhiệt độ 0-40C thì sự lên men lactic không bị đình chỉ mà chỉ diễn ra chậm Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại vi khuẩn lactic là 35-420C, nhưng nhiệt độ này cũng kích thích sự phát triển của nhiều vi sinh vật lạ

Sự lên men lactic cần tiến hành trong điều kiện yếm khí Phần lớn các vi khuẩn lactic hoạt động trong điều kiện yếm khí tùy tiện, tức là phát triển không nhất thiết phải có mặt của oxy không khí Một số loài trong chúng cũng bị giảm hoạt động khi có mặt của oxy không khí [7].

I.2.6.Các biện pháp làm chủ quá trình lên men

I.2.6.1 Làm chủ chất lượng ban đầu của nguyên liệu

Lượng vi sinh vật ban đầu của nguyên liệu là một nhân tố quan trọng Rửa rau cho phép loại bỏ một phần vi sinh vật và những cặn bẩn Theo Hasan và các cộng sự(1993), một sự chiếu xạ thích hợp đối với nguyên liệu trước khi lên men

sẽ tạo điều kiện thuận lợi hơn cho sự phát triển của vi khuẩn lactic - loại vi khuẩn chịu được chiếu xạ tốt hơn so với các loại khác Tuy nhiên biện pháp này còn ít được sử dụng do giá thành cao Có thể xử lý nhiệt đối với nguyên liệu trước khi muối khi đó cũng làm giảm được một phần vi sinh vật có trong nguyên liệu Mặt khác thời gian tồn trữ của nguyên liệu trước khi muối cũng ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm Theo Andersson và các cộng sự (1990) cà rốt lên men ngay sau khi thu hoạch, sẽ bảo quản được lâu hơn cà rốt lên men sau khi thu hoạch 6 tháng được bảo quản ở 20C [1]

I.2.6.2 Thay đổi các điều kiện lên men

Một phương pháp khác để làm chủ quá trình lên men là thay đổi các điều kiện lên men: thay đổi nồng độ đường, nồng độ muối khác nhau, tìm điều kiện nhiệt độ thích hợp, axit hóa, tạo môi trường yếm khí thích hợp, cải thiện tính đệm Ví dụ như thêm canxi axetat cho phép một mặt tăng tính đệm của môi trường mặt khác đảm bảo sự phân hủy hoàn toàn lượng đường [1]

I.2.6.3 Sử dụng chủng vi khuẩn lactic thuần khiết

Hiện nay, ở các nước phương Tây việc sử dụng chủng vi khuẩn thuần khiết vào quá trình sản xuất các sản phẩm lên men rau quả là rất phổ biến Lựa chọn chủng vi khuẩn này dựa trên các chỉ tiêu sau:

- Phát triển nhanh

- Tạo lượng axit nhanh

- Đảm bảo sự lên men đường hoàn toàn, tránh sự lên men phụ bởi nấm men.

- Các tế bào vi khuẩn phải có khả năng lắng tốt, lọc nhanh để dễ dàng loại bỏ

nếu cần thiết

- Có khả năng giữ được hoạt tính sau khi bảo quản [1]

I.2.7 Một số biện pháp bảo quản sản phẩm rau quả muối chua

Sau khi sản phẩm đạt được hàm lượng axit lactic và chất lượng như mong muốn thì sản phẩm cần phải được bảo quản để tránh sự phá hỏng của nấm men nấm mốc Tốt nhất nên bảo quản sản phẩmtrong kho lạnh có nhiệt độ 0-10C Trong điều kiện không có kho lạnh thì có thể

sử dụng chất bảo quản hoặc bằng cách tạo điều kiện yếm khí cho sản phẩm Có thể sử dụng axit sobic, các muối của nó hoặc axit benzoic, các muối của nó để bảo quản các sản phẩm rau quả muối chua Nồng

độ chất bảo quản thường từ 0,07-0,1%, với nồng độ này không những chống lại được sự phá hoại của nấm men nấm mốc mà còn giữ được hương vị và màu sắc tự nhiên của sản phẩm Tạo điều kiện yếm khí cao cho sản phẩm bằng cách phủ lên trên lớp sản phẩm một màng polyetylen rồi đổ nước muối lên trên vừa tạo điều kiện yếm khí cho sản phẩm vừa làm vật nén cho sản phẩm Cũng có thể bảo quản sản phẩm bằng tia tử ngoại nhưng giá thành sẽ cao

Cũng có thể bảo quản các sản phẩm rau quả muối chua trong các bao bì bảo quản Hai loại bao bì phổ biên là bao bì thủy tinh và bao bì PE Khi đóng lọ thì cần tách sản phẩm khỏi nước muối Đem lọc nước muối để loại bỏ những vụn bẩn, loại bỏ kết tủa tanin protein và một phần vi sinh vật có trong nước Sản phẩm được xếp vào lọ, có thể có các gia vị kèm theo sau đó rót nước vào và ghép nắp Cũng có thể loại bỏ nước dưa cũ đi mà thay vào đó dịch pha mới Trong trường hợp bảo quản trong bao bì thì có thể thanh trùng sản phẩm để kéo dài thời gian bảo quản [7], [27]

I.3 Vi khuẩn lactic và quá trình lên men lactic

Axit lactic (CH3CHOHCOOH) được sử dụng từ rất lâu để bảo quản và chế biến thực phẩm Axit này lần đầu tiên được phát hiện ra từ sữa bò lên men bởi nhà bác học Thụy Điển Carl Wilhelm Scheele năm 1780 và được coi là axit sữa Trong thời gian từ năm 1857 đến 1876 Pasteur đã chỉ ra rằng tất cả các quá trình lên men đều do tác dụng của vi sinh vật, mỗi dạng lên men đều do một loại

vi sinh vật gây ra Ông cũng chứng minh được quá trình làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic [10] Năm

1878, Joseph Lister lần đầu tiên phân lập được một loại vi khuẩn lactic đặt tên là

Bacterium lactic (hiện nay gọi là Streptococcus lactic), về sau các nhà khoa học

liên tiếp phân lập được các lạo vi khuẩn lactic khác nhau Năm 1919, Orla Iencen là người đầu tiên nghiên cứu, phân loại có hệ thống các vi khuẩn lactic Tiếp đó các nhà khoa học người Đức và Thụy Sĩ G.Muler và A.Ostervalder đã nghiên cứu tỉ mỉ các thay đổi hoa sinh trong các loại “rượu vang bị bệnh” Ông

đặt tên cho các loại nghiên cứu được là Bacterium mannitôpeum, Bacterium graccile, Bacterium intermedium, Micrococcus acidovorax, Micrococcus variococcus Tuy nhiên việc định tên này chưa được nghiên cứu một cách đầy

đủ Sau các nhà khoa học này còn có rất nhiều nhà khoa học khác nghiên cứu về

vi khuẩn lactic trong các loại sản phẩm khác nhau như thịt , rượu vang, sữa [22]

Tất cả các vi khuẩn lactic đều có những đặc tính chung: là vi khuẩn Gram dương, không chuyển động, không tạo bào tử, hô hấp yếm khí hoặc yếm khí tùy tiện Chúng đều đòi hỏi nguồn dinh dưỡng tổng hợp chứa axit amin, peptit, vitamin, muối, axit béo, đường có khả năng lên men Vi khuẩn lactic lên men đường để tạo ra năng lượng cần thiết cho sự phát triển của chúng Nhờ quá trình lên men đường được chuyển hóa thành axit lactic, etanol, axit axetic và dioxyt cacbon trong trường hợp lên men dị hình [15]

I.3.1 Phân loại vi khuẩn lactic

Có rất nhiều cách phân loại khác nhau, vi khuẩn lactic có thể được phân loại theo các yếu tố sau:

- Theo lượng sản phẩm tạo thành [12]:

+ Vi khuẩn lactic lên men đồng hình: lên men đồng hình là con đường lên men tạo ra 70 - 90% axit lactic Vi khuẩn lactic lên men đồng hình có thể được

chia thành hai nhóm đó là Streptococcus và Lactobacterium.

+ Vi khuẩn lên men lactic dị hình: lên men lactic dị hình là con đường lên men ngoài axit lactic tạo thành còn có các sản phẩm như axit axetic, CO2 và etanol Trong đó axit lactic chiếm khoảng 40%, axit sucxinic chiếm 20%, etanol

và axit axetic chiếm 10% còn các chất khí chiếm khoảng 20% Tỷ lệ này thay đổi ít hay nhiều tùy thuộc vào loại vi khuẩn và điều kiện môi trường Một số loài

lên men lactic dị hình như Bacterium coli, Lactobacillus casei

- Theo nhiệt độ phát triển [12]:

+ Nhóm ưa ấm: nhiệt độ thích hợp từ 25-30oC, ví dụ như Lactobacillus casei

+ Nhóm ưa nhiệt : nhiệt độ thích hợp 40 44oC, như Lactobacillus bulgaricus, Steptococcus thermophilus.

+ Nhóm ưa lạnh : nhiệt độ thích hợp từ 0-15oC

- Nhu cầu về oxy [12]:

+ Yếm khí tùy tiện: Có thể phát triển trong cả điều kiện yếm khí và hiếu khí tuy mhiên phát triển mạnh hơn trong điều kiện yếm khí Phần lớn vi khuẩn lactic thuộc loại này

+ Yếm khí : không thể phát triển được trong điều kiện hiếu khí

- Đặc điểm hình thái [10], [15]:

+ Hình cầu : Steptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Aerococcus, Leuconostoc

+ Hình que : Lactobacillus và Carnobacterium

Ngoài ra vi khuẩn còn được phân loại theo các đặc điểm sinh lí sinh hóa, đặc điểm về cấu trúc, đặc điểm về miễn dịch

I.3.2 Đặc điểm về hình thái

Các giống vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Ngoài ra hình dạng và kích thước của tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi của tế bào [10], [22] Những tế bào hình cầu, hình ôvan thường có đường kính khoảng 0,5-2

µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài Các giống Steptococcus, Lactococcus, Vagococcus và Enterrococcus được tạo thành từ những tế bào hình ôvan sắp xếp thành chuỗi, giống Leuconostoc được tạo thành từ những tế bào

hình thấu kính (hình hột đậu lăng) sắp xếp thành cặp hay thành chuỗi, các giống

Pediococcus, Aerococcus, Tetragenococcus được tạo thành từ những tế bào hình cầu ghép nối bốn tế bào Giống Atôpbium lại có hình dạng thay đổi theo từng

chủng : có thể hình cầu nhỏ, hình thấu kính, hình gậy hay hình trung gian của các loại trên [10].

Những tế bào hình que cân đối có kích thước từ 0,5-2µm chiều rộng và

1-10µm chiều dài, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài Theo Orla

Jensen, giống Lactobacillus có thể chia làm ba loài :Thermobacterium (lên men

đồng hình chặt chẽ) được tạo thành từ những tế bào hình que dài, riêng biệt hay được sắp xếp thành những chuỗi rất dài hoặc ở dạng chuỗi xoắn, loài

Streptobacterium (lên men dị hành tùy tiện) được tạo thành từ những tế bào hình

que ngắn đôi khi có dạng cong, sắp xếp thành chuỗi ngắn hoặc rất dài, loài

Betabacterium (lên men dị hình chặt chẽ) nói chung được tạo thành từ những tế bào rất ngắn, thẳng, sắp xếp riêng biệt Giống Carnobacterium được tạo thành từ

những tế bào mà chiều dài của chúng thay đổi theo tuổi [10]

Những tế bào hình que không cân đối điển hình là Bifidobacterium

Chúng được tạo thành từ những tế bào hình que sần sùi, phân nhánh tạo thành hình ngôi sao, hình giàn đậu, hình chữ V [10]

Thành phần môi trường cũng như sự có mặt của oxy có ảnh hưởng lớn tới hình dạng tế bào Trong môi trường có hàm lượng etanol cao sẽ làm cho chiều dài tế bào dài ra Mặt khác etanol còn kìm hãm sự phân chia tế bào mạnh hơn so với sự sinh trưởng Thực tế là trong môi trường có etanol trực khuẩn lactic sẽ dài

ra, mảnh hơn, còn cầu khuẩn thì bảo tồn được hình dạng của mình [22]

I.3.3 Đặc điểm sinh lí sinh hóa

I.3.3.1 Sự hấp thụ chất dinh dưỡng qua màng tế bào

Đối với tất cả các vi sinh vật, sự hấp thụ và chuyển hóa các chất dinh dưỡng là một chức năng quan trọng đảm bảo cho sự phát triển của chúng Phần lớn các chất trong môi trường tự nhiên đều là các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử lớn, chúng phải được phân cắt để các vi khuẩn sử dụng Các hợp chất hữu cơ này có thể xâm nhập vào khoảng không bên trong tế bào bằng sự vận chuyển bị động hoặc chủ động qua màng tế bào - giới hạn phân chia tế bào

vi khuẩn với môi trường Vận chuyển bị động không phụ thuộc vào sự chuyển hóa, nó liên quan đến năng lượng tiêu thụ và và chênh lệch nồng độ giữa mỗi

thành phần Vận chuyển chủ động thì ngược lại (Desmazeaud và Roisart, 1994; Olmos, 1997).

Hệ thống chuyển đổi chủ động được thực hiện nhờ những màng trung gian, các màng này tham gia điều hòa sự chuyển hóa và cân bằng nội tế bào Những màng trung gian này vận chuyển chất dinh dưỡng nhờ hoạt động của enzim permeaza hay enzim photphotransferaza Năng lượng được tạo thành, một phần là năng lượng được tạo ra từ sự thủy phân ATP thành ADP + Pi (dưới tác dụng của enzim ATPaza có ái lực cao đối với cơ chất), phần khác bởi sự tổ hợp điện thế qua màng và sự chênh lệch điện hóa học của proton qua màng Phần lớn các vi sinh vật đều có sự chênh lệch điện hóa học của proton qua màng tế bào chất, bên trong có tính kiềm còn bên ngoài có tính axit Vì thế sự vận chuyển proton từ bên trong tế bào ra ngoài có thể gắn liền với các hợp chất từ môi trường bên ngoài vào bên trong tế bào và ngược lại với nguyên lí chênh lệch nồng độ (Tseng và montville, 1993) Trong trường hợp sự vận chuyển được thực hiện bởi enzim photphotransferaza các phân tử cơ chất chịu sự phosphoryl hóa nhờ sự xúc tác của một nhóm enzim ở màng tế bào, tế bào sử dụng PEP như một nguồn năng lượng Hệ thống PEP- photphotransferaza (PEP-PTS) có tác động chính đến sự chuyển đường ở vi khuẩn lên men đồng hình [15]

I.3.3.2 Cơ chế chuyển hóa đường

Lên men lactic được thực hiện dựa vào một chuỗi các phản ứng oxy hóa khử mà nguyên liệu ban đầu là gluccoza, chất tạo thành cuối cùng là axit pyruvic hoặc axetyl-CoA, những chất trung gian chuyển đổi electron là NAD+/ NADH,

H+ kết hợp với những phản ứng hydro hóa Năng lượng được tạo ra từ phản ứng dehydro hóa hoặc những tác động nối hoặc cắt các liên kết photpho của cơ chất được sử dụng để tổng hợp ATP Mặt khác PEF - tiền cơ chất photpho hóa axit pyruvic tác động vào ATP như một nguồn năng lượng trong sự vận chuyển cơ chất và trong sự đồng hóa hay sinh tổng hợp các đại phân tử lại là thành phần chính của cấu trúc tế bào vi khuẩn Tùy theo loài vi khuẩn và các điều kiện của môi trường sự chuyển hóa glucoza có thể theo con đường đồng hóa, dị hóa hay con đường của các vi khuẩn bifido [15]

I.3.3.3 Một số các quá trình chuyển hóa khác của các vi khuẩn lactic.

Ngoài các quá trình chuyển hóa ở trên vi khuẩn lactic còn có thể có các quá trình chuyển hóa sau:

Vi khuẩn lactic gây ra quá trình chuyển hóa malolactic trong lên men rượu vang, axit malic được chuyển hóa thành axit lactic.

C4H6O5 C3H6O3 + CO2

Năng lượng cần thiết cho quá trình lên men malolactic là rất nhỏ Để phân hủy 1 gam axit malic chỉ cần 0,1 - 0,2 gam glucoza Biến đổi axit malic thành axit qua giai đoạn trung gian hình thành axit pyruvic nhờ enzim maloic Enzim này tạo thành và bị ức chế tùy theo trong môi trường có nhiều hay ít axit malic Sau đó axit pyruvic tạo thành axit axetat - salyxalic rồi được khử trực tiếp bàng enzim decacboxylaza [22]

Ngoài ra vi khuẩn lactic còn có thể phân hủy protein do chúng có hệ enzim proteinaza và peptinaza Trong quá trình thủy phân protein diễn ra sự tích

tụ axit amin (asparagin, glyxin, serin, axit glutamic, treonin, tyrozin, valin, phinylanalin, isoleusin) và các peptit Khả năng thủy phân protein biểu thị ở nhóm vi khuẩn hình cầu, nhóm trực khuẩn lactic ưa nhiệt hay chi phụ

Steptobacterium Giống Lactobacillus có hoạt tính thủy phân protit lớn hơn các vi khuẩn lactic khác, chảng hạn như Lactobacillus có thể chuyển hóa 25- 30% cazein thành dạng hòa tan trong khi đó Steptococcus lactic và Steptococcus cremoris chỉ thực hiện được 15-17%.

Quá trình thủy phân protein của vi khuẩn lactic được thực hiện bởi hệ enzim proteaza nội bào và ngoại bào Người ta đã phát hiện thấy sự có mặt của proteaza trong dịch lọc trong (không còn tế bào vi khuẩn) của môi trường nuôi

cấy Steptococcus lactic và Lactobacillus bulgaricus (Van der Zant, Nelson,

1954) Trong khi đó các enzim proteaza nội bào của nhiều loại vi khuẩn lactic khác lại giữ vai trò quyết định trong quá trình thủy phân protein, ví dụ như

Steptococcus cremoris và Lactobacillus helveticus (Ohmiya, Stato 1972) Sự

thủy phân protein đặc biệt được thúc đẩy khi trong môi trường có mặt một số ion kim loại, đặc biệt là Mg2+, Mn2+, Co2+, và pH = 5,5-6 Người ta đã sử dụng các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính thủy phân protit cao để bổ sung vào thành phần giống dùng để áp dụng vào sản xuất hàng loạt các sản phẩm từ thịt, cá, sữa Đặc biệt người ta đã xác định rõ vai trò quan trọng của vi khuẩn lactic khi thủy phân protein trong quá trình làm chín phomat Theo Ohmiya, Stato trong một gam phomat có chứa 109 tế bào vi khuẩn lactic, khi phomat tự phân trong quá trình làm chín sẽ sinh ra một lượng proteaza có hoạt tính 0,022 đơn vị (tính theo mật

độ quang OD280) trong khi hoạt tính của rinin trong cùng điều kiện chỉ là 0,018 Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng các sản phẩm chuyển hóa từ axit amin có vai trò chính trong việc tạo ra hương vị đặc trưng cho sản phẩm [23].

Hoạt tính lipaza có nhiều ở chủng thuộc các giống cầu khuẩn và trực khuẩn Chế phẩm lipaza thu nhận được từ dịch chiết không tế bào vi khuẩn dễ dàng thủy phân những triglyxerit đơn giản [22]

I.3.3.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất dinh dưỡng rất phức tạp Không một đại diện nào của nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH+

4 [5] Mặc dù đường cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho sự chuyển hóa vi khuẩn lactic vẫn đòi hỏi các nhân tố phát triển khác như vitamin, axit amin, lipit, những chất này phải có trong môi trường lên men [5]

a) Nguồn các bon

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit như: glucoza, lactoza, maltoza, saccaroza Các nguồn cacbon này được sử dụng làm nguồn năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ khác như axit citric, malic, pyruvic, fumaric,axetic [23]

Tuy nhiên các loài vi khuẩn khác nhau đòi hỏi các nguồn cacbon khác nhau Khi không có mặt các cơ chất cacbon, vi khuẩn lactic sẽ sử dụng nguồn năng lượng từ các axit amin như glutamic, arginin, tyronin.Khi đó sẽ xảy ra quá trình decacboxyl hóa và tạo thành CO2 [22]

b) Nguồn nitơ

Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiều loại axit amin khác nhau vì vậy chúng cần môi trường có sẵn nguồn nitơ để đảm bảo sự phát triển của mình Ví dụ như

Lactobacillus sake không thể phát triển được nếu thiếu các axit amin sau:

glycin, phenylalanin, histidin, methionin, valin, prolin, theonin, tyrosin và arganin (Lauret và cộng sự, 1996) [15]

Axit amin có thể được đồng hóa dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzim proteaza và peptidaza ngoại hay nội bào Vi khuẩn lactic cũng có thể đồng hóa các axit amin cần thiết cho sự phát triển của chúng từ nguồn nitơ phức tạp như dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt, pepton, trypton Đây cũng chính là

nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp thì khó có thể sử dụng nguồn nitơ này vì nó rất tốn kém [15].

vi khuẩn lactic có thể thay đổi khi trong môi trường có chứa các axit amin hoặc axit béo và dizoxylribosit Nhu cầu về axit foleic nếu sử dụng môi trường có chứa tất cả các axit amin : timin, timidin, kiềm purin [22] Trực khuẩn lactic cần rất nhiều loại vitamin Tất cả các giống trực khuẩn đều cần đến pantothenate canxi ( vitamin B5) và niacin(vitamin B3) và có những đòi hỏi khác nhau đối với các vitamin khác Theo Ruiz- Barba và Jimenez- Diaz (1995) axit nicotinic, pantothenitic, biotin và vitamin B6 đều rất cần thiết cho sự phát triển của chủng

Lactobacillus Plantarum Sự thiếu vitamin B12 (cobalamin) có thể làm giảm sự tổng hợp ADN kéo theo sự thay đổi hình thái, tế bào có thể mảnh hơn Mặc dù

có rất nhiều các nghiên cứu khác nhau về nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic tuy nhiên họ đều có quan điểm chung rằng nhóm vitamin B rất cần thiết để kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic

Nhu cầu về vitamin còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như điều kiện nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường Chẳng hạn nếu thay đổi nhiệt độ khoảng 3-4oC thì nhu cầu trao đổi riboflavin với môi trường

bên ngoài của Lactobacillus helveticus thay đổi khoảng 25%.

d) Các hợp chất vô cơ

Để đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn lactic cần phức hợp các chất cô cơ như đồng, sắt, mangan, natri, kali , photpho, lưu huỳnh, magiê đặc biệt là mangan Chính mangan ngăn cản sự tự phân của tế bào, tham gia vòa cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzim, giải độc các tế bào khỏi sự có mặt của oxy Mn2+ thay thế dioxyt dimustaza để thải các gốc O2-,, mặt khác mangan còn tham gia ổn định cấu trúc riboxom[22]

I.3.3.5 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất

a) Ảnh hưởng của oxy

Nói chung các vi khuẩn lactic chịu được môi trường giàu oxy Nhưng một vài loài (sống trong đường tiêu hóa của động vật) là yếm khí nghiêm ngặt Khi

có mặt của oxy các loài này không có khả năng photphoryl hóa, tổng hợp cytochrom, tổng hợp enzim Một số tác giả lại cho rằng nhờ vào flavo-protein oxy hóa hay peroxi hóa, các loài yếm khí nghiêm ngặt cũng có thể thực hiện quá trình photphoryl hóa khi có mặt của oxy nhưng không quá nhiều

Các loài vi khuẩn có phản ứng khác nhau với độ hiếu khí của môi trường thậm chí còn đối nghịch nhau Trong điều kiện yếm khí nghiêm ngặt chỉ có trực khuẩn lên men dị hình bắt đầu phát triển còn trực khuẩn lên men dị hình sinh trưởng giảm 10%, lên men giảm 23% Các cầu khuẩn lên men dị hình, lên men arabinoza đạt tối ưu trong sinh trưởng ở điều kiện yếm khí, còn các loài không

sử dụng được pentoza thì phát triển kém trong điều kiện này

b) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Người ta phân chia vi khuẩn thành ba nhóm theo giới hạn nhiệt độ phát triển của chúng (Desmazeaud và Roissanrt, 1994)

- Nhóm ưa lạnh là những vi sinh vật phát triển ở nhiệt độ dưới 7-10oC

- Nhóm ưa ấm là những vi sinh vật mà nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng là trên nhiệt độ môi trường (20 oC) và dưới nhiệt độ cơ thể con người (37 oC) Lactobacillus thuộc nhóm này.

- Nhóm ưa nhiệt là những vi sinh vật mà nhiệt độ phát triển tối thích cử chúng trên 40 oC

Đối với vi khuẩn lactic nhiệt độ giới hạn của chúng là từ 5-55 oC, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 20-45 oC Còn đối với thực khuẩn thể nhiệt độ này chỉ khoảng 30-37 oC [15]

c) Ảnh hưởng của pH

Hoạt động của vi khuẩn lactic chịu tác động mạnh của pH Nếu pH không thích hợp vi khuẩn lactic có thể bị ức chế, phát triển kém, hay bị tiêu diệt [22] Chính vì vậy trong quá trình lên men lactic, khi axit lactic tích lũy đủ lớn thì ức chế luôn cả hoạt động của vi khuẩn lactic (pH<3,8) [1] Nói chung quá trình lên

men sẽ dừng lại khi pH đạt giá trị 4,0 Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì pH thích hợp khác nhau, dao động trong khoảng từ 4,5-6,5 Sự liên quan giữa pH đến hiệu suất lên men của vi khuẩn lactic còn là vấn đề mà các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu Theo Giraud và cộng sự (1991) đối với vi khuẩn

Lactobacillus plantarum A6, sự giảm pH sẽ làm giảm sự chuyển hóa cơ chất d) Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu.

Màng tế bào của vi khuẩn Gram dương là màng bán thấm nên nồng độ muối có ảnh hường rất lớn đến khả năng phát triển của tế bào Nếu trong môi trường có nồng độ muối lớn tế bào sẽ bị mất nước, chịu trạng thái khô sinh lí, co nguyên sinh chất và sẽ bị chết nếu kéo dài Ngược lại nếu nồng độ muối trong môi trường thấp, nước sẽ xâm nhập vào trong tế bào làm áp lực tăng lên Vi khuẩn lactic có thể bị ức chế nếu nồng độ muối >5%, tuy nhiên một số loài có khả năng chịu được nồng độ muối cao hơn Có thể tăng khả năng chịu áp suất thẩm thấu của vi khuẩn lactic nếu bổ sung ion K+, gluxit hoặc axit amin [22], [10]

I.3.4.Quá trình lên men lactic

Vi khuẩn lactic sử dụng đường như một nguồn năng lượng và tạo thành axit lactic Tùy theo loài vi khuẩn và các điều kiện của môi trường, sự chuyển hóa glucoza có thể theo con đường đồng hóa, dị hóa hay con đường của vi khuẩn bifido (lên men đồng hình hay dị hình) [15]

I.3.4.1 Lên men đồng hình (Embden- Meyerhoff- Parnas)

Những vi khuẩn lên men đồng hình chuyển hóa một phân tử glucoza để tạo thành hai phân tử axit pyruvic, hai phân tử ATP và NADH,H+ Axit pyruvic được khử thành axit lactic Vi khuẩn lên men đồng hình chuyển hóa glucoza thành axit lactic với hiệu suất 70-95% và theo phản ứng sau:

Glucoza + 2Pi + 2 ADP 2 axit lactic + 2ATP

Trong quá trình lên men đồng hình tồn tại sự chuyển đổi và photpho hóa đồng thời glucoza bởi chất trung gian PEP - PTS Glucoza - 6 - photphat được tích tụ và được lên men tiếp tục thành axit lactic Fructo - 1,6 - diphotphat aldolaza là chất cần thiết cho con đường lên men đồng hình Một số loài vi

khuẩn lactic lên men đồng hình như; Steptococcus (Sc Mutan, Sc.thermophilus),

Enterococcus (Ec Faecalis), Lactococcus (Lc lactic) ,Lactobacillus ( Lb Casei,

Lb Plantarum), Peliococcus [15], [19].

I.3.4.2 Lên men dị hình theo con đường pentoza photphat

Những vi khuẩn lactic lên men đường tạo ra ít hơn 1,8 mol axit lactic từ 1 mol đường và tạo ra etanol, axit axetic, CO2 được gọi là những vi khuẩn lên men

dị hình Phản ứng tổng quát được viết như sau:

1 glucoza + Pi + ADP 1 axit lactic + 1 etanol + 1 CO2 + 1 ATP

2 C6H12O6 C3H6O3 + C4H6O4 + C2H4O2 + C2H5OH + CO2 + Q glucoza axit lactic axit sucxinic axit axetic etanol

Những vi khuẩn lên men dị hình không chứa enzim fructo diphosphat aldolaza và triose - photphat isomeraza [15], [22] Trong quá trình lên men này axit pyruvic được biến một phần thành aldehyt axetic và CO2, kết quả của quá trình chuyển hóa aldehyt axetic và axit pyruvic là axit sucxinic, axit axetic, etanol được tạo thành Trong lên men dị hình 40% đường được lên men để tạo thành axit lactic, axit sucxinic 20%, axit axetic10%, etanol 10% và CO2 20%

I.3.4.3 Lên men của vi khuẩn lactic bifidobacterium hay co đường F6P photphocetolaza

Nhóm vi khuẩn bifido (Bf bifidum, Bf breve, Bf longum) tạo thành một

nhóm vi khuẩn lactic Gram dương, yếm khí chặt chẽ, không tạo bào tử Những

vi khuẩn này nói chung có hình gậy không cân đối và có trong hệ vi sinh vật trong ruột Do không có aldolaza và chỉ có một lượng nhỏ photphofructokinaza nên chúng chuyển hóa 1 mol glucoza thành 1 mol axit lactic, 1,5 mol axit axetic, 2,5 mol ATP và không tạo thành CO2 Con đường chuyển hóa này được coi là độc lập với con đường lên men đồng hình và dị hình [15]

I.3.5 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic và quá trình lên men lactic

Từ khi được phát hiện bởi nhà bác học Thụy Điển Carl Wilhelm Sheele năm 1780, vi khuẩn lactic và quá trình lên men lactic đã lôi cuốn sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học vì những ứng dụng rộng rãi của chúng Những năm gần đay, sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học đã mở ra rất nhiều

triển vọng cho việc ứng dụng vi khuẩn lactic vào lĩnh vực thực phẩm cũng như rất nhiều ngành nghề khác.

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn lactic

và những ứng dụng của chúng Ở nước ta có thể kể đến một số những nghiên cứu như: vai trò của nhóm vi khuẩn lactic trong quá trình chế biến nem chua (Vũ Hồng Thắng, 1998), chế biến phụ phẩm thủy sản bằng phương pháp lên men vi sinh vật làm thức ăn trong chăn nuôi (Lê Văn Liên, Phạm Thị Thoa, Nguyễn Thị Phụng, 1999) nghiên cứu cố định tế bào vi khuẩn lactic , ứng dụng vào trong sản xuất sữa chua (Trần Mạnh Thắng), nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới

sự phát triển và hoạt độ phân giải axit malic của Leuconostoc oenos LF01 dùng

trong lên men phụ rượu vang, sử dụng vi khuẩn lactic sản xuất kitin, nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic từ nguồn cacbon hydrat, nghiên cứu một số đặc điểm sinh lí sinh hóa và thăm dò khả năng ứng dụng chủng Lactobacillus SP vào bảo quản cá (Phan Thị Hồng Thảo, 2000), nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn lactic thuần khiết vào chế biến rau cải bẹ muối chua (Võ Nhân Hậu, 2002)

Trên thế giới có rất nhiều những công trình nghiên cứu về ứng dụng của

vi khuẩn lactic trong sản xuất và bảo quản các sản phẩm từ thịt, cá, sữa, các loại rau quả, củ, hạt cũng như tác động của vi khuẩn lactic và axit lactic đối với cơ thể con người Từ những công trình nghiên cứu trên đã có rất nhiều các sản phẩm lên men lactic được tạo thành, được sản xuất ở quy mô công nghiệp đem lại hiệu quả kinh tế cao [10],[15]

Nói đến vi khuẩn lactic trước hết phải nói đến những ứng dụng của nó trong những sản phẩm truyền thống như rau quả muối chua, sữa chua, phomat, xúc xích, tôm chua, nem chua Chúng không những có tác dụng bảo quản nhờ vào khả năng lên men lactic chuyển hóa đường thành axit lactic làm giảm pH môi trường, ức chế các vi sinh vật khác phát triển mà còn tạo ra các sản phẩm có tính chất và hương vị đặc trưng Trong một số trường hợp khác người ta bổ sung chủng vi khuẩn lactic thuần khiết vào để điều khiển quá trình lên men lactic Dưới đây là một vài ứng dụng của vi khuẩn lactic trong một số lĩnh vực thực phẩm:

Bảng 4 : Một vài sản phẩm thực phẩm được sản xuất theo phương pháp lên men lactic (Theo J.M.Jay.Modern Food Microbiology, 3 rd ed New York: Van Nostran Reinhod, 1986) [23]

Sản phẩm Nguyên liệu

ban đầu Vi sinh vật lên men Nơi sản xuất

Từ sữa

Steptococcus sp Toàn thế giới

Lactobacillus bulgaricus Toàn thế giới

Kumis Sữa ngựa tươi Lactobacillus bulgaricus

Kim chi Rau cải và các

loại rau khác Vi khuẩn lactic Triều tiênÔliu muối

chua

Ô liu xanh Leuconostoc mesntoroides

Lactobacillus plantarum Toàn thế giới

Dưa bắp cải Bắp cải Leuconostoc mesntoroides

Lactobacillus plantarum Toàn thế giới

mạch đen

Bột lúa mì đen Leuconostoc mesntoroides Thụy Sĩ và

các vùng khác

Axit lactic tạo thành từ vi khuẩn lactic được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực của công nghiệp thực phẩm

Bảng 5 : Ứng dụng hiện nay của vi khuẩn lactic và muối lactat trong công nghiệp thực phẩm ( theo Thiery Payot, 1998) [22].

Các sản phẩm Ứng dụng trong công nghiệp thực

phẩm

Axit L (+) lactic Chất diệt vi sinh vật, thức ăn muối

Axit L (-) lactic Gia vị, giữ hương vị

Axit DL lactic Điều chỉnh pH, dung môi

Lactat canxi Gia vị, chất ổn định, chất làm bền, bổ

sung dinh dưỡng, chất làm đặcLactat kali Giữ hương vị, gia vị, làm ẩm, điều chỉnh

pHLactat sắt Bổ sung dinh dưỡng cho sữa mẹ

Lactat natri Giữ hương vị, gia vị, làm ẩm, điều chỉnh

pH, chất nhũ hóaSteoryl - 2 - lactylat canxi Chất bao gói bột mì và bột khoai tây

thủy phân

Steoryl lactylat natri

Chất bao gói bột mì và bột khoai tây thủy phân, chất nhũ hóa, chất ổn định, chất thay thế sữa và crem

Este lactyl của axit béo Chất nhũ hóa, chất dẻo, chất điện hoạt

Este lactyl của axit béo với

glyxerin và propylenglycol

Chất nhũ hóa, chất dẻo, chất điện hoạt

Este glyxero - lacto với

các axit béo

Chất nhũ hóa, chất dẻo, chất điện hoạt

Ngoài ra trong lĩnh vực dược phẩm, các muối lactat có vị trí rất quan trọng Axit lactic được sử dụng đặc biệt dưới dạng các este (metyl, etyl hay iso propyl lactat) hoạt tính quang học như là chất trung gian để tổng hợp phân tử đối xứng Lactat natri được dùng làm dung môi thẩm tích thận và lactat canxi, lactat magie dùng để bù đắp cho sự thiếu hụt các chất khoáng này trong cơ thể

PHẦN II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Nguyên vật liệu - hoá chất - thiết bị nghiên cứu

II.1.1 Nguyên liệu

- Chủng giống vi khuẩn: Một chủng vi khuẩn lactic thuần khiết Lactococcus lactis của Viện Thực Phẩm và hai chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ dưa

muối tự nhiên

- Rau: + Giống rau cải bẹ Đông Dư được trồng ở xã Chiến Thắng, huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên Đây là giống cải bẹ có nguồn gốc từ xã Đông Dư, huyện Gia Lâm chuyên dùng để muối dưa và được trồng phổ biến ở phía bờ Bắc sông Hồng

+ Các loại nguyên liệu khác như cà pháo, cải thảo, dưa chuột được mua từ chợ Bách Khoa

II.1.2 Hoá chất

Các hoá chất được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

+ Các loại đường: Glucoza, saccharoza, Việt Nam

+ Cao thịt (Extrait de viande) - Biokar Dianogstique, Pháp

+ Cao men ( Extrait de levure) - Biokar Dianogstique, Pháp

+ Axetat Natri CH3COONa (REACHIM, Liên Xô cũ)

+ Dipotassium hydrogen phosphate KH2PO4 (Trung Quốc)

+ Amonium citrat (Chemapol, Tiệp Khắc cũ)

+ Sulffat Magiê ngậm bẩy phân tử nước MgSO4.7H2O (Reanal, Hungary)

+ Sulffat Mangan ngậm bốn phân tử nước MnSO4.4H2O (Trung Quốc)

+ Pepton (Trung Quốc)

+ Thạch (Việt Nam)

+ Tween 80 (Merck, CHLB Đức)

+ Bromocresol tía (Trung Quốc)

+ Axit sulfanilic và α-naphtylamin (Trung Quốc)

+ Kali xitrat (Trung Quốc)

+ Dinatri hydro photphat Na2HPO4

+ Kalinitrat KNO3 (Trung Quốc)

+ Natri hydroxit, kali hydroxit, bạc nitrat, kali cromat, tinh bột, dung dịch I2, Việt Nam

II.1.3 Thiết bị

- Kính hiển vi quang học OLYPIUS Model CHD Nhật Bản

- Máy đo pH (744 pH Meter), Ω METROHM, Thuỵ Sỹ

- Cân điện tử PB 303, METTRER TOLEDO, Thuỵ Sỹ

- Cân điện tử SPB 54, SCALTEC, Canada

- Micropipette Model P220, GILSON, Pháp

- Tủ ấm Liên Xô

- Chiết quang kế N1, Atago, Nhật Bản

- Máy đo OD 6300, JENWAY, Anh

- Nồi hấp 3850M, Tuttnauer, Đức

- Máy ly tâm

I.1.4 Môi trường nuôi cấy

* Môi trường MRS (Deman, Rogosa, Sharpe, 1960), g/l:

*Môi trường giá đỗ (GĐ): 200g giá đỗ + 1000ml nước, đun sôi trong 30phút, lọc lấy dịch trong, bổ sung nước đủ 1000ml Thêm 20g đường saccharoza, chỉnh

pH = 6.5, khử trùng ở 1150C trong 15phút

II.2 Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Nội dung và trình tự nghiên cứu:

1/ Đánh giá chất lượng nguyên liệu rau cải bẹ

Cải được rửa sau hai lần nước, để ráo và xay bằng máy xay (lượng cải được xay có tỉ lệ đồng đều giữa lá, bẹ và ngọn) Lấy cải đã xay làm mẫu để phân tích các chỉ tiêu:

a/ Xác định thành phần hoá lí

- Hàm lượng chất hoà tan

- Hàm lượng nước trong nguyên liệu

- Kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí

- Kiểm tra tổng số nấm men, nấm mốc

2/ Phân lập và chọn chủng

a/ Chúng tôi tiến hành muối dưa tự nhiên, lấy nước dưa vừa muối để phân lập chủng vi khuẩn lactic

b/ Nghiên cứu hai chủng phân lập được cùng với một chủng Lb lactis Các đặc

điểm hình thái học và tế bào học

+ Quan sát khuẩn lạc

+ Soi tiêu bản sống+ Nhuộm tiêu bản+ Xác định khả năng di động+ Xác định khả năng tạo bào tử+ Nhuộm Gram

- Các đặc điểm sinh lí, sinh hoá

+ Kiểu hô hấp+ Nhiệt độ phát triển+ Khả năng chịu mặn

+ Khả năng phát triển ở các pH khác nhau

Từ các đặc điểm đã xác định trên đặt tên cho từng chủng phân lập được, loại

bỏ chủng không thích hợp

c/ Khảo sát khả năng chịu mặn của ba chủng, sử dụng các chủng này để muối chua rau cải bẹ rồi từ đó chọn được chủng thích hợp cho quá trình muối chua các sản phẩm rau quả

3/ Ứng dụng chủng vi khuẩn đã chọn để muối chua rau cải bẹ

4/ nghiên cứu, chọn những điều kiện bảo quản thích hợp

- Chọn bao bì bảo quản

- Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gia thanh trùng tới thời gian bảo quản và chất lượng sản phẩm

II.2.2 Các phương pháp nghiên cứu

1/ Xác định hàm lượng chất hoà tan

Hàm lượng chất hoà tan được xác định bằng chiết quang kế (Refractometer).Dịch rau, quả sau khi lọc ép được khuấy đều và lấy 1 - 2 giọt nhỏ vào chiết quang

kế, đọc chỉ số trên chiết quang kế, đơn vị đo là 0Bx ở 200C

2/ Xác định hàm lượng nước trong nguyên liệu theo phương pháp sấy

Nguyên tắc: nguyên liệu được sấy đến trọng lượng không đổi.Căn cứ vào

khối lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy, tính được hàm lượng nước trong nguyên liệu

Tiến hành: Lấy một chén nhôm hoặc sứ đem sấy ở 1050C đến trọng lượng không đổi, đặt chén trong bình làm khô đến khi nguội và cân chén (chính xác đến 0,001g) Sau đó cho vào chén 10g mẫu, sấy sơ bộ ở 500C trong 1giờ sau đó sấy ở

105oC Sau khoảng 3 h lấy ra cho vào bình hút ẩm và cân, rồi lại đặt trong tủ sấy tiếp khoảng 30 phút rồi lại đặt trong bình hút ẩm và cân Đến khi sai số giữa hai lần cân không quá 0,001 thì xem như quá trình sấy kết thúc

Tính kết quả:

X: Hàm lượng nước có trong nguyên liệu (%)

G1: Trọng lượng chén và mẫu trước khi sấy (g)

G2: Trọng lượng chén và mẫu sau khi sấy (g)

100

*1

2 1

G G

G G X

−

−

=

G: Trọng lượng chén không (g)

3/ Xác định hàm lượng đường tổng số theo phương pháp Graxianop

*Cơ sở của phương pháp : phương pháp dựa trên phản ứng:

2K3Fe(CN)6 + KOH 2 K4Fe(CN)6 + H2O + O

Tiếp theo oxy nguên tử sẽ oxy hóa đường tạo thành axit saccaric:

CH2OH(CHOH)4CHO + O COOH(CHOH)4COOH

ml, thêm vào 5 7 ml axit HCl đặc rồi thủy phân ở 75 80oC trong 5 phút Thủy phân xong đem trung hòa axit dư bằng dung dịch NaOH 30%, rồi thêm nước cất tới vạch định mức ta được dịch đường

- Xác định đường: Lấy 20ml Ferixianua kali 1% và 5ml KOH 2,5N cho vào bình tam giác, nhỏ thêm vài giọt xanh metylen, lắc đều, đun sôi trong 1 - 2 phút Sau đó dùng dung dịch đường để chuẩn tới khi màu xanh metylen chuyển sang vàng rơm

*Tính kết quả:

D: Hàm lượng đường trong mẫu (g/l)

V: Số ml dịch đường tiêu hao khi chuẩn hết 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1%a: Lượng glucose tương ứng với 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1%

4/ Xác định hàm lượng axit tổng số bằng phương pháp trung hòa

100

*

V a

D =

* Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp là dựa trên phản ứng trung hòa giữa axit

và kiềm Từ lượng kiềm tiêu hao, tính được lượng axit tổng số có trong mẫu

* Tiến hành

-Cân 5 - 10g mẫu, nghiền nhỏ bằng cối sứ, thêm vào khoảng 50ml nước cất và đun cách thuỷ ở nhiệt độ 700C -80oơtrong 30-45 phút Sau đó làm nguội tới nhiệt

độ thường rồi định mức đến thể tích 100ml bằng nước cất rồi đem lọc

-Lấy 50 ml nước cất nóng cho vào một bình tam giác 250 ml, thêm vài giọt phenolphtalein rồi dùng NaOH 0,1N đến màu hồng nhạt.Sau đó cho vào bình tam giác 20 ml dịch lọc rồi dùng dung dịch NaOH 0,1 N chuẩn đến màu tương tự

*Tính kết quả:

X: Lượng axit hữu cơ hoà tan trong mẫu (%)

a: Lượng NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml)

k: Lượng axit tương ứng với 1ml NaOH 0,1N

V: Thể tích mẫu pha loãng (ml)

v: Lượng dung dịch lấy để chuẩn độ (ml)

g: Khối lượng mẫu (g)

5/ Xác định hàm lượng Vitamin C

Hàm lượng vitamin C được xác định bằng phương pháp chuẩn độ Iod 0,01N.Cân 5 - 10 g nguyên liệu cho vào cối sứ nghiền nhỏ, cho vào khoảng 50ml HCL 2% và để trong bóng tối 10 phút để lượng axit ascocbic có trong nguyên liệu được hoà tan hoàn toàn Sau đó định mức đến 100ml bằng nước cất và đem lọc Lấy 20 ml dịch lọc, thêm vào vài giọt tinh bột 0,5%, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng

I2 0,01N tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh lam

a: Lượng dung dịch I2 0,01 N dùng để chuẩn độ (ml)

V: Thể tích mẫu pha loãng (ml)

0,00088: Lượng Vitamin C tương đương với 1ml I2 0,01N

v: Lượng dung dịch đem chuẩn độ (ml)

g: Khối lượng mẫu (g)

6/ Xác định hàm lượng muối

* Nguyên tắc: phương pháp dựa trên phản ứng sau:

AgNO3 + NaCl = AgCl + NaNO3

Khi phản ứng kết thúc thì lượng AgNO3 dư sẽ phản ứng với kali cromat và cho kết tủa màu đỏ gạch Nhờ đó ta nhận biết được điểm tương đương rõ nét hơn 2AgNO3 + K2CrO4 = Ag2CrO4 + AgNO3

* Tiến hành: Cân 5 - 10g mẫu, nghiền kỹ bằng cối sứ, định mức lên 100ml bằng

nước cất nóng, lắc đều và đem lọc Lấy 10ml dịch lọc cho vào bình tam giác, thêm vài giọt kali cromat10% sau đó đem chuẩn độ bằng AgNO3 0,1N đến khi dung dịch có màu đỏ gạch

v: Thể tích dung dịch đem chuẩn độ (ml)

g: Khối lượng mẫu (g)

* Nguyên tắc: Nuôi cấy một lượng sản phẩm nhất định trên môi trường đặc trong

hộp petri Sau một thời gian nuôi cấy nhất định, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc tương ứng Từ số khuẩn lạc trong hộp thạch tính được số vi sinh vật hiếu khí có trong mẫu cần phân tích

* Tiến hành : Sử dụng một lượng rau cải đã nghiền nhỏ, pha loãng, sau đó dùng

micropipet lấy 0,1 ml để nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng đựng trong hộp petri ở nhiệt độ 30 ± 10C trong điều kiện hiếu khí, thời gian 24 - 72h Đếm tất

cả số khuẩn lạc mọc trên đó

*Môi trường nuôi cấy, g/l:

Pepton 5 Thạch 15Cao men 2,5 Nước 1000mlGlucoza 4

* Tổng số vi sinh vật hiếu khí được tính theo công thức sau:

ΣC

N =

( n1 + 0,1 n2) d

ΣC : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

Số khuẩn lạc đếm được trong một đĩa phải nhân với hệ số 10 (quy cho 1 ml canh trường)

n1 :Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất

n2 : Số đĩa đếm được ở nồng độ pha loãng thứ hai

d : Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất

8/ Xác định tổng số nấm men nấm mốc

Xác định tổng số nấm men, nấm mốc tiến hành như đối với xác định vi sinh vật tổng số chỉ khác trong mối trường nuôI cấy có bổ sung tetracylin

9/ Phân lập vi khuẩn lactic

Dùng nước dưa đã muối hai ngày làm dung dịch gốc để pha loãng Pha loãng đến tỉ lệ thích hợp (thường ở độ pha loãng 10-6 - 10-7) Dùng pipet vô trùng

lấy 0,05ml dịch pha loãng nhỏ vào môi trường MRS đặc vô trùng đựng trong hộp petri Dùng que gạt vô trùng dàn đều trên môi trường Nuôi trong tủ ấm ở

300C trong 2 ngày Dùng que cấy đầu tròn lấy khuẩn lạc tách rời cấy vào môi trường MRS lỏng đựng trong ống nghiệm Cấy lặp lại 2 - 3 lần với vật liệu cấy lúc này là giống mọc từ khuẩn lạc tách rời đã thu nhận được từ lần 1 Cấy ra môi trường MRS nghiêng để giữ giống Mọi thao tác được tiến hành trong phòng cấy

vô trùng Các dụng cụ cũng yêu cầu vô trùng, tránh nhiễm tạp

10/ Cấy truyền và giữ giống

Dùng que cấy vòng lấy một ít khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm chứa dung dịch MRS lỏng Nuôi trong tủ ấm ở 30 ± 20C Sau 24h, dùng pipet vô trùng lấy 0,05 ml môi trường lỏng nhỏ vào chính giữa hộp petri đã chứa sẵn môI trường MRS Sau đó trang đều và nuôi trong tủ ấm cho khuẩn lạc phát triển Chọn khuẩn lạc riêng rẽ và cấy lên thạch nghiêng Giống được bảo quản ở ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 40C trong vòng 2 tháng Nếu muốn bảo quản lâu hơn có thể bảo quản trong dung dịch glyxerin 15 - 40% ở điều kiện lạnh sâu

11/ Nhân giống

Môi trường nhân giống là môi trường lỏng được chuẩn bị và thanh trùng trong bình tam giác Chủng vi khuẩn được lấy từ ống giống cấy vào ống nghiệm chứa10ml môi trường MRS lỏng đã khử trùng Sau 24 giờ phát triển thì cấy sang bình tam giác (tỉ lệ tiếp giống 10%) Tuỳ thuộc qui mô thí nghiệm mà có các cấp nhân giống thích hợp

12/ Quan sát khuẩn lạc

Hình dạng khuẩn lạc được nghiên cứu trên môi trường MRS Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch nghiêng cấy trích thẳng vào môi trường thạch chứa trong hộp Petri Nuôi trong tủ ấm ở 300C trong 2 ngày rồi tiến hành quan sát khuẩn lạc, miêu tả

13/ Soi tiêu bản sống

Dùng que cấy đầu tròn vô trùng lấy tế bào vi sinh vật từ canh trường lỏng giàn đều trong một giọt nước cất vô trùng đã nhỏ sẵn trên một phiến kính, đậy lamel Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần

15/ Nhuộm màu Gram

Việc nhuộm màu Gram được tiến hành với những tế bào còn non, thường

là các giống nuôi cấy một ngày đêm Thao tác nhuộm được tiến hành như sau: Nhỏ một giọt huyền phù vi khuẩn lên trên phiến kính, dàn đều Làm khô vết bôi trong không khí và cố định trên ngọn lửa Nhuộm vết bôi bằng tím gentian trong

1 - 2 phút, sau đó đổ thuốc nhuộm đi, xử lí bằng dung dịch Lugol trong 1 - 2 phút cho đến khi thẫm lại Đổ dung dịch Lugol đi rồi khử màu bằng etanol 96% trong 0,5 - 1,0 phút Rửa sạch tiêu bản bằng nước sau đó nhuộm bổ sung bằng dung dịch fuchsin Đợi tiêu bản khô thì quan sát bằng vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ