KỸ THUẬT QUANG PHỔ tử NGOẠI KHẢ KIẾN UV VIs

ĐÈN DÙNG CHO VÙNG TỬ NGOẠI Đèn Deuterium  Deuterium bị kích thích điện ở áp suất thấp tạo ra phổ phát xạ liên tục trong vùng tử ngoại  Bóng đèn làm bằng thạch anh vì thủy tinh hấp th

KỸ THUẬT QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN UV-

Vis

THIẾT BỊ VÀ HIỆU

CHUẨN

Bộ Y Tế Viện Kiểm Nghiệm

Thuốc TP.Hồ

Chí Minh

1.1.5 Hệ thống quang học

1.2 Máy quang phổ thông thường

1.3 Máy quang phổ diode array

1.4 Cấu hình

1.4.1 Kiểu một chùm tia

1.4.2 Kiểu hai chùm tia

1.4.3 Kiểu Split-beam

1.4.4 Kiểu Dual-wavelength

II CÁC VẤN ĐỀ KỸ THUẬT

THƯỜNG GẶP VÀ BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC TRONG VIỆC ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN VÀO KIỂM NGHIỆM THUỐC

III HIỆU CHUẨN

IV VẬN HÀNH

Một số khái niệm cơ

Bươcù sóng (): khoảng cách ngắn nhất giữa 2 dao động cùng pha Đơn vị nm = 10 -9

m.

 Tíhh chất hạt

 Bức xạ điệän từ là những hạt mang năng lượng gọi là photon lan truyền với vận tốc ánh sáng E = hc/

Một số khái niệm cơ

bản

 Bức xạ vùng UV-Vis (tia tử ngoại, ánh sáng nhìn thấy) chia thành 3 vùng nhỏ:

 Vùng tử ngoại chân không (UV xa): = 50-200 nm

ít sử dụng trong kiểm nghiệm vì:

•- Có năng lượng khá lớn, khi va chạm gây vỡ liên kết trong phân tử

•- Bị hấp thụ mạnh bởi hầu hết dung môi và oxy của không khí

•- Bị hấp thụ bởi thạch anh (dùng làm cốc đo)

 Vùng tử ngoại gần (UV gần): = 200-340 nm

 Vùng khả kiến (Vis): = 340-800 nm

•

THIẾT BỊ

Máy quang phổ tử ngoại khả

kiến UV-Vis

CÁC THÀNH PHẦN CHÍNH

CỦA MÁY UV-Vis

ĐÈN NGUỒN (LAMP) (1)

ĐẶC ĐIỂM CỦA NGUỒN SÁNG LÝ

TƯỞNG

 Cường độ sáng hầu như không thay

đổi và đủ mạnh ở mọi bước sóng trong vùng tử ngoại khả kiến.

 Độ nhiễu thấp

Cần dùng ổn áp để ổn định cường độ bức xạ của đèn nguồn

ĐÈN DÙNG CHO VÙNG

TỬ NGOẠI

Đèn Deuterium

 Deuterium bị kích thích điện ở áp

suất thấp tạo ra phổ phát xạ liên tục trong vùng tử ngoại

 Bóng đèn làm bằng thạch anh vì

thủy tinh hấp thụ mạnh ánh sáng ở vùng bước sóng dưới

350 nm

 Cho cường độ sáng đạt yêu cầu

sử dụng liên tục trong vùng tử

ngoại (từ 200 đến 340 nm)

 Cho cực đại bức xạ hữu ích trong

vùng khả kiến (từ 656,0 đến 656,2 nm) được dùng để kiểm tra độ đúng của bước sóng máy quang phổ.

 Nhiễu gây hạn chế đến hiệu

năng của máy.

 Thời gian bán hủy (cường độ

đèn giảm chỉ còn phân nửa so với giá trị lúc mới lắp đặt) xấp xỉ 1.000 giờ.

ĐÈN DÙNG CHO VÙNG KHẢ

KIẾN

Đèn Tungsten

 Sợi đốt làm bằng wolfram Chất liệu

làm bóng bằng thủy tinh Nhiệt độ

sợi đốt hoạt động là 2.870 K.

Đèn Tungsten/Halogen

 Có một lượng nhỏ iod bên trong vỏ

đèn bằng thạch anh chứa sợi đốt

wolfram

 Nhiệt độ sợi đốt hoạt động gần

3.500 K.

 Sự phân bố năng lượng phụ

thuộc vào nhiệt độ Ở vùng khả kiến, năng lượng đèn thay

đổi theo điện thế hoạt động Do

vậy cần thiết dùng ổn áp

Đặc điểm

 Cho cường độ sáng đạt yêu cầu sử dụng trên một phần

vùng tử ngoại và toàn bộ

vùng khả kiến (từ 340 đến 900

SO SÁNH ĐÈN TUNGSTEN VÀ

ĐÈN TUNGSTEN/HALOGEN

 Tuổi thọ của đèn tungsten/halogen cao hơn gấp đôi so với đèn tungsten

 Ở đèn Tungsten, tungsten bị thăng hoa dưới tác dụng của nhiệt độ cao làm sợi đốt bị mòn dần theo thời gian và bị đứt để lại vết đen trên đầu bóng đèn.

 Kết quả là tuổi thọ đèn bị

giảm

 Ở đèn Tungsten-Halogen, iod

phản ứng với hơi

dưới tác dụng của nhiệt độ cao

tạo thành hợp chất WI 2

 Chất này (WI 2 ) ngưng tụ trên

sợi đốt giải phóng

đốt không bị mòn, gia tăng tuổi

thọ đèn

ĐÈN XENON

 Tạo ra những bức xạ có cường

độ lớn bằng cách cho dòng điện điqua bầu khí xenon

 Cho phổ liên tục từ 250 - 600 nm.

BỘ PHẬN TẠO ÁNH SÁNG

ĐƠN SẮC (MONOCHROMATOR) (2)

 Các thành phần quang học

của một bộ phận tạo ánh sáng đơn sắc bao gồm: khe vào (1), kính chuẩn trục (2), bộ phận tán sắc gồm lăng kính hay cách tử (3), mặt phẳng hội tụ (4), khe ra (5).

 Tạo ra ánh sáng với các bước

sóng khác nhau được tán sắc

ở những góc khác nhau

 Bộ phận này dùng để

chọn từ nguồn sáng một ánh sáng đơn sắc có bước sóng mong muốn đi qua một khe ra thích hợp.

 Bộ phận tán sắc: có 2

loại thông dụng là lăng kính và cách tử.

LĂNG KÍNH (PRISM)

Đặc điểm

 Tạo ra ánh sáng nhiều màu sắc như cầu vồng từ ánh sáng mặt trời

 Cấu tạo đơn giản và rẻ tiền nhưng cho góc tán xạ không tuyến tính và phụ thuộc nhiệt độ.

Nhược điểm của lăng kính

 Phổ cho bởi lăng kính không

tuyến tính về bước sóng.

 Lăng kính hấp thụ một phần

năng lượng ánh sáng khi đi qua nó.

 Góc tán xạ phụ thuộc nhiệt

độ.

 Phải tạo ra cơ chế quay lăng

kính tương đối phức tạp để có thể kiểm tra bước sóng từ thang đo.

 Phần bị rạch không phản

chiếu ánh sáng, phần còn lại đóng vai trò một gương phẳng gồm nhiều gương riêng biệt nhau

 Aùnh sáng chiếu tới phần mạ

nhôm không bị rạch này sẽ bị phản xạ trở lại theo những góc khác nhau tùy thuộc vào bước sóng của chúng

 Các tia phản xạ sẽ giao thoa

với nhau tạo nên vân nhiễu xạ có bước sóng khác nhau

 Khi quay cách tử, ta thu được ở khe ra các vân có bước sóng khác nhau.

 Cách tử phản xạ ánh

sáng ở những bậc khác nhau nên phải dùng kính

lọc để chỉ cho ánh sáng của bậc ánh sáng phản xạ mong muốn đến đầu dò

CÁCH TỬ LÕM (CONCAVE

GRATINGS)

 Được tạo thành trên bề mặt lõm

 Cho phép thiết kế một bộ tạo

ánh sáng đơn sắc mà không cần bộ phận chuẩn trục phụ trợ,

gương hội tụ vì bề mặt lõm có thể phân tán rồi và tập trung bức xạ

ở khe ra

 Loại này có ưu điểm là giá rẻ,

sự giảm thiểu các bề mặt quang học làm gia tăng mức năng lượng của bộ tạo ánh sáng đơn

sắc chứa cách tử lõm.

HOLOGRAPHIC GRATINGS

 Kỹ thuật quang học tạo cách

tử trên bề mặt thủy tinh phẳng hay lõm bằng tia laser

 Kỹ thuật này cho phép tạo

các rãnh đồng đều về kích thước và hình dạng

 Cách tử loại này cho các phổ

không có ánh sáng lạc và

nhiễu (ghost).

 Tạo thành bằng cách chiếu

2 chùm tia laser giống nhau từ

1 góc thích hợp lên một bề mặt thủy tinh có tẩm chất cản quang

 Vân giao thoa tạo thành từ 2

chùm tia trên tăng nhạy chất cản quang làm cho nó tan rã để lại một cấu trúc có khắc vạch

 Sau đó phần còn lại được

mạ nhôm hoặc những chất phản xạ khác để tạo thành cách tử phản xạ

ƯU ĐIỂM CỦA CÁCH TỬ SO

VỚI LĂNG KÍNH

Cho độ phân giải tốt hơn

 Cho sự tán sắc tuyến tính

 Độ rộng của giải phổ là hằng

tính

 Cơ chế chọn bước sóng đơn

giản hơn

CÓNG ĐO VÀ NGĂN CHỨA

CÓNG ĐO (CELL & CELL HOLDER) (3)

CÓNG ĐO

 Được làm bằng chất liệu sao cho

ánh sáng trong vùng đo phải truyền qua (trong thực tế các loại cóng đo có độ truyền tối đa là khoảng 90% ở mọi bước sóng trong vùng UV-Vis)

 Trong vùng tử ngoại (dưới 350 nm)

dùng dùng cốc làm bằng thạch anh

hay silica (silic dioxid) nóng chảy

 Trong vùng khả kiến

dùng dùng cóng làm bằng thủy tinh silicat hoặc bằng chất dẽo (nhựa acrilic)

 Quang lộ cóng đo thông

thường nhất là 1 cm

 Ngoài ra còn có các

cóng đo có quang lộ từ 0,1 đến 10 cm dùng cho các nồng độ thích hợp mà không cần pha loãng tiếp theo.

KIỂU CÓNG ĐO TIÊU CHUẨN

 Phổ biến nhất là loại cóng đo

hình khối chữ nhật Quang lộ cốc

đo thông thường nhất là 1 cm

 Ngoài ra còn có các cóng đo

có quang lộ từ 0,1 đến 10 cm để dùng cho các nồng độ thích hợp mà không cần pha loãng tiếp theo.

 Nếu thể tích mẫu có giới hạn thì dùng cóng đo có cửa sổ.

MỘT SỐ KIỂU CÓNG ĐO ĐẶC

BIỆT

Microcell

Là loại cóng đo có cửa sổ rất nhỏ (có mặt cắt 2 x 2,5 mm) Chỉ cần lượng mẫu xấp

xỉ 60 l để đo

Ultra-microcell

Là loại dụng cụ đo mới thiết kế để đo thể tích mẫu cỡ microlit (2-5l) bao gồm một bộ phận tiếp hợp và một ống mao quản bằng silica nóng chảy quang lộ ngắn dùng một lần

 Cho trực tiếp mẫu đo vào

ống mao quản, sau đó cài vào bộ phận tiếp hợp Quang lộ giảm cho phép đo các mẫu có nồng độ cao mà

không cần pha loãng Aùp dụng để đo nồng độ và độ tinh khiết của AND va nồng độ protein.

Cốc đo kiểu dòng chảy liên tục

 Dùng trong trường hợp tự

động hóa như trong máy quang phổ ghép nối với máy đo độ hòa tan.

NGĂN CHỨA CÓNG ĐO (CELL

HOLDER)Ngăn chứa cóng đo để đo độ đục (Turbidity Cell Holder)

 Ngăn chứa cóng đo được dịch

chuyển ra xa detector so với vị trí bình thường và một khe đặt giữa mẫu và detector Khe này chỉ cho phép ánh sáng ló đi qua mẫu mà không cho ánh sáng tán xạ đến đến detector

Micro-Auto 12 Cell Holder

 Là loại ngăn chứa cóng đo

dùng trong sinh hóa để phân tích động học enzym Bao gồm các ngăn chứa cóng đo có thể tích tối thiểu 100 l và bộ phận điều hòa nhiệt độ bằng dòng nước hoặc kiểu Peltier.

Water circulated Cell Holder

 Là loại ngăn chứa cóng đo

duy trì được nhiệt độ bằng một dòng nước luân chuyển lấy từ máy điều nhiệt (Thermostat) Dùng trong phân tích enzym.

Micro-Auto 6 Tm Cell Holder

 Là loại ngăn chứa cốc đo

dùng trong sinh hóa để xác định t m (thermal melting point) của AND Bao gồm một bộ phận kiểm soát nhiệt độ kiểu Peltier, quạt làm nguội ngăn chứa cốc đo bằng không khí, bộ phận làm sạch hơi ngưng tụ trên thành cốc đo dùng khí nitrogen, hai điện cực hiệu năng cao Peltier, bộ phận đo nhiệt độ bằng cảm biến nhiệt.

DETECTOR (4)

Detector tế bào quang (Phototube)

 Là các ống thủy tinh hoặc silica được

tạo chân không với cathod là kim loại kiềm, anod tích điện dương

 Khi ánh sáng chiếu tới cathod, các

electron được tách ra và đi tới anod làm cho thế tăng lên tỉ lệ với cường độ ánh sáng

 Độ nhạy phổ của các tế bào xác

định bằng chất liệu cathod, với antimon/cesium từ 190 – 600 nm, vớo oxid cesium/bạc từ 600 – 1000 nm.

•

Detector ống nhân quang (Photomultiplier)

 Nguyên tắc hoạt động gần giống

tế bào quang nhưng có thêm bộ

khuếch đại bên trong làm cho loại

này có độ nhạy lớn hơn trên thang phổ rộng hơn

 Aùnh sáng gây ra sự bức xạ photon

từ photocathod, giống như trong tế

bào quang nhưng anod được sắp xếp thành dãy dynod có thể tăng lên không ngừng.

Detector silicon diod (Silicon

diode)

 Có hiệu năng cho toàn bộ

thang đo rộng, vững chắc, độ thô cao hơn ống nhân quang và không tiêu hao nhiều điện năng.

 Chuỗi diod là một tập hợp

các detector photodiod riêng biệt xếp đặt kề nhau trên tinh thể silicon tuyến tính trong ma trận tạo nên

 Mỗi diod có một tụ điện và

được nối với dòng đầu ra bằèng một cái ngắt

 Đầu tiên tụ điện được tích

một giá trị điện nhất định

 Khi photon thấm nhập vào

silicon, những phần mang điện tích tự do tạo thành để xả tụ điện

 Tụ điện lại được tích điện ở

những chu kỳ đặc trưng cho chu kỳ đo đối với mỗi chu kỳ quét

 Lượng điện cần để nạp cho tụ

điện tỉ lệ với số pho ton được phát hiện bởi mỗi diod hay nói cách khác tỉ lệ với cường độ sáng

 Phổ hấp thu thu được bằng

cách đo lường sự thay đổi cường độ sáng trên toàn khoảng bước sóng Thông thường detector chuỗi photodiod chứa 1024 detector photodiod riêng biệt.

HỆ THỐNG QUANG HỌC

(OPTICAL SYSTEM) (5)

 Sử dụng các thấu kính hay

gương lõm để tập trung ánh sáng Nếu dùng loại kính thông thường có thể bị sai lạc về màu sắc.

 Kính tiêu sắc kết hợp nhiều

loại kính với chỉ số khúc xạ khác nhau không gây ra hiện tượng sai lạc về màu sắc nhưng giá thành cao.

 Gương lõm rẻ hơn kính tiêu

sắc và cũng không bị sai lạc về màu sắc nhưng bề mặt nhôm dễ bị ăn mòn làm giảm hiệu năng.

 Trên mỗi bề mặt quang học

kể cả giao diện giữa các thành phần của kính tiêu sắc, 5 – 10 % ánh sáng thể hiện qua sự hấp thu hay phản chiếu

 Một máy quang phổ lý

tưởng phải thiết kế với bề mặt quang học tối thiểu.

MÁY QUANG PHỔ THÔNG

THƯỜNG  Aùnh sáng đa sắc từ đèn

nguồn tập trung ở khe vào của bộ tạo ánh sáng đơn sắc cho truyền qua một cách chọn lọc một dãy ánh sáng hẹp

 Dãy ánh sáng này đi qua mẫu, ló ra và đến detector

 Độ hấp thu của mẫu là hiệu giữa cường độ ánh sáng tới detector của mẫu trắng và mẫu thử

 Máy loại này thích hợp để

đo độ hấp thu ở một bước sóng trên phổ nhưng không thích hợp lắm khi đo những chất khác nhau ở những bước sóng khác nhau hoặc khi lấy phổ của một chất.

 Để làm được điều này,

bộ tạo ánh sáng đơn sắc phải xoay một cách cơ học gây ra sai số do độ tái lặp Quá trình thu nhận dữ liệu cần có thời gian.

MÁY QUANG PHỔ DIODE

ARRAY

 Aùnh sáng đa sắc từ đèn nguồn

đi qua mẫu rồi tập trung ở khe vào của bộ tạo ánh sáng đa sắc sau đó bị tán sắc trên dãy diode, mỗi diode đo một dãy hẹp của cả phổ.

 Kích thước của diode và khe vào

của bộ tạo ánh sáng đa sắc có liên hệ đến độ rộng dãy của ánh sáng phát hiện

 Mỗi diode thực hiện chức

năng như một khe ra của bộ tạo ánh sáng đơn sắc.

 Để giảm thiểu phản ứng

quang hóa, máy có cửa chập để chặn ánh sáng từ đèn nguồn cho tới tiến hành đo mẫu

 Máy loại này cho phép thu

nhận dữ liệu rất nhanh, độ tái lặp bước sóng rất tốt và độ tin cậy rất cao.

Ưu điểm

 Ghi phổ nhanh

 Dùng để nghiên cứu động

học

 Định tính và định lượng các

thành phần tách ra từ cột sắc ký

CẤU HÌNH

Kiểu một chùm tia

 Có thể là loại máy quang phổ

thông thường hoặc máy quang phổ dãy diode.

 Hệ thống quang học đơn giản nên có độ nhạy cao và giá thành hạ.

 Máy quang phổ đối chứng do Viện tiêu chuẩn và kỹ thuật quốc gia Hoa kỳ và phòng thí nghiệm vật lý quốc gia Anh quốc sử dụng là loại máy một chùm tia

 Máy quang phổ dãy

diode đặc biệt thích hợp cho cấu hình một chùm tia vì thu được phổ rất nhanh và khoảng thời gian đo giữa mẫu trắng và mẫu thử bị giảm đến mức tối thiểu

Kiểu hai chùm tia

 Chùm tia đi từ đèn nguồn

tới bộ tạo ánh sáng đơn sắc được tách ra thành hai chùm tia đơn sắc bằng nhau

do một bộ chắn sáng tự động xoay vài giây một phút (chopper), một chiếu tới mẫu đo, một chiếu tới mẫu đối chiếu

Kiểu split-beam

 Giống với loại máy 2 chùm tia nhưng

dùng bộ tách chùm tia (beam splitter) thay vì chopper để cho ánh sáng đi qua mẫu trắng và mẫu thử đồng thời để đến 2 detector riêng biệt giống nhau

 Với cấu hình này, mẫu trắng và mẫu

thử được đo đồng thời Hệ thống quang học cũng đơn giản hơn máy 2 chùm tia thực thụ

 Nhược điểm là hai detector có thể

không hoàn toàn đồng nhất nhau.

Kiểu dual-wavelength

 Cấu hình này cho phép đo ở

2 bước sóng đồng thời như khi nghiên cứu 2 phản ứng xảy

ra đồng thời bên trong mẫu

 Bộ tạo ánh sáng đơn sắc chứa 2 bộ phận tán sắc

 Máy loại này đắt hơn máy quang phổ thông dụng và được dần thay thế bằng máy quang phổ diode array có thể ghi phổ đồng thời ở nhiều bước sóng khác nhau.