kỹ thuật bảo tồn nguồn gen thực vật invitro

A. ĐẶT VẤN ĐỀNguồn gen được ví như là một trong các tài nguyên thiên nhiên tái tạo được, có tầm quan trọng đặc biệt sánh ngang với tài nguyên đất và nước. Trong khi nhiều nước trên thế giới và các tổ chức quốc tế tập trung bảo tồn nguồn gen thì ở Việt Nam nguồn tài nguyên di truyền này đang đứng trước thách thức do các hệ sinh thái bị phá vỡ và tốc độ tuyệt chủng của các loài động vật, thực vật ngày càng tăng, sự thâm canh nông nghiệp không hợp lý dẫn đến nguồn gen động, thực vật đang dần bị xói mòn, mất mát với tốc độ rất nhanh. Các giống cây trồng vật nuôi quý của Việt Nam đang có nguy cơ thoái hóa, thậm chí là biến mất.Thực hiện bảo tồn nguồn gen là việc cần thiết phục vụ cho khai thác, sử dụng có hiệu quả quỹ B. NỘI DUNGgen và các nguồn gen quý hiếm, đặc hữu.I. Ý nghĩa của việc bảo tồn nguồn gen.II. Phương pháp bảo tồn nguồn gen từ trước đến nayIII. Cách bảo quản nguồn gen TV invitroIV. Ưu, nhược điểm của bảo quản nguồn gen TV invitoV. Khả năng ứng dụngVI. Công trình nghiên cứuBảo tồn là gì? Theo định nghĩa của IUCN(1991): “Bảo tồn là sự quản lý, sử dụng của con người về sinh quyển nhằm thu được lợi nhuận bền vững cho thế hệ hiện tại trong khi vẫn duy trì tiềm năng để đáp ứng những yêu cầu và nguyện vọng của thế hệ tương lai” . Khái niệm bảo tồn sinh học (Biological Conservation): là biện pháp đặc biệt để duy trì và bảo vệ động thực vật quý hiếm và có nguy cơ tuyệt củng.Như vậy việc bảo tồn nguồn gen nói chung và nguồn gen thực vật nói riêng là rất quan trọng. Bảo quản nguồn gen thực vật là duy trì sự phong phú đa dạng di truyền trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung để làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng chúng một cách hợp lí cho hiện tại và trong tương lai Bảo quản nguồn gen thực vật invitro là giải phóng công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản nguồn gen thực vật nhất là với cây nhân giống vô tính và có hạt mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nội dung trình bày

Các giống cây trồng vật nuôi quý của Việt Nam đang có nguy cơ thoái hóa, thậm chí là biến mất.

 Thực hiện bảo tồn nguồn gen là việc cần thiết phục vụ cho khai thác, sử dụng có hiệu quả quỹ gen và các nguồn gen quý hiếm, đặc hữu.

4

•

Ưu, như

ợc điể m

IV

•

Khả nă

ng ứ

ng dụng

VI

•

Công trì

nh nghi

ên cứu

B NỘI DUNG

Bảo tồn là gì?

 Theo định nghĩa của IUCN(1991): “Bảo tồn là sự quản lý, sử dụng của con người về sinh quyển nhằm thu

được lợi nhuận bền vững cho thế hệ hiện tại trong khi vẫn duy trì tiềm năng để đáp ứng những yêu cầu và nguyện vọng của thế hệ tương lai”

 Khái niệm bảo tồn sinh học (Biological Conservation): là biện pháp đặc biệt để duy trì và bảo vệ động thực vật quý hiếm và có nguy cơ tuyệt củng.

I Ý nghĩa của việc bảo tồn nguồn gen

 Như vậy việc bảo tồn nguồn gen nói chung và nguồn gen thực vật nói riêng là rất quan trọng

Bảo quản nguồn gen thực vật là duy trì sự phong phú đa dạng di truyền trong loài, giữa các loài

và trong hệ sinh thái nói chung để làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng chúng một cách hợp lí cho hiện tại và trong tương lai

 Bảo quản nguồn gen thực vật invitro là giải phóng công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản

nguồn gen thực vật nhất là với cây nhân giống vô tính và có hạt mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và

II PHƯƠNG PHÁP BẢO TỒN NGUỒN GEN TỪ TRƯỚC ĐẾN NAY

1.Bảo tồn nội vi (In-situ)

2 Bảo tồn chuyển vị (Ex-situ)

1 Bảo tồn

In-situ

Là hình thức bảo quản nguồn gen tại chỗ, tại vùng chúng thường được trồng, được tồn tại trong điều kiện sinh thái tự nhiên

Đối tượng: cây sinh sản vô tính,

cây hoang dại, cây thân gỗ nhiệt đới, cây có múi: cam, quýt, bưởi

Đối tượng: cây sinh sản vô tính,

cây hoang dại, cây thân gỗ nhiệt đới, cây có múi: cam, quýt, bưởi

Các dạng bảo tồn là: bảo tồn trong trang trại, bảo tồn trong

vườn gia đình, xây dựng các vườn quốc gia,…

Các dạng bảo tồn là: bảo tồn trong trang trại, bảo tồn trong

vườn gia đình, xây dựng các vườn quốc gia,…

là cơ sở vững chắc cho việc

bảo vệ tổng thể tài nguyên

đa dạng sinh học và bảo vệ

môi trường sinh thái.

là cơ sở vững chắc cho việc

bảo vệ tổng thể tài nguyên

đa dạng sinh học và bảo vệ

môi trường sinh thái.

II PHƯƠNG PHÁP BẢO TỒN NGUỒN GEN TỪ TRƯỚC ĐẾN NAY

Xây dựng vườn quốc gia Bảo tồn vườn gia đình

VD về các dạng bảo tồn in-situ

9

Tuy nhiên, sự đa dạng di truyền luôn luôn bị đe dọa trong khi bảo

tồn Exsitu.Đó là do bảo tồn giống dạng “ngủ” trong các kho lạnh

không duy trì được quá trình tiến hóa trong môi trường tự nhiên.

- Là phương pháp cổ điển

- Cho phép bảo tồn số lượng giống lớn và an toàn.

Là bảo quản hoặc duy trì quần thể ở nơi khác với nơi mà chúng sinh

ra, tiến hóa và thích nghi.

 Bảo quản trên vườn ươm

 BQ hạt trong kho lạnh

III CÁCH BẢO QUẢN NGUỒN GEN THỰC VẬT INVITRO

Kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật invitro là 1 trong các phương thức bảo quản nguồn gen có vai trò quan trọng vì bảo quản trong một không gian hẹp nhưng có thể lưu giữ được khối lượng lớn cá thể, điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp có hiệu quả đối với cây trồng nhân giống vô tính và hạt cây dễ mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và độ ẩm thấp.

Kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật invitro là 1 trong các phương thức bảo quản nguồn gen có vai trò quan trọng vì bảo quản trong một không gian hẹp nhưng có thể lưu giữ được khối lượng lớn cá thể, điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp có hiệu quả đối với cây trồng nhân giống vô tính và hạt cây dễ mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và độ ẩm thấp.

Bảo quản nguồn gen thực vật invitro

Bảo quản sinh trưởng tối thiểu

Bảo quản sinh trưởng tối thiểu

Bảo quản ngừng sinh trưởng

tạm thời Bảo quản ngừng sinh trưởng

tạm thời

1 Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu

 Nguyên lí: mẫu được bảo quản trong điều kiện bảo quản sao cho tốc độ sinh trưởng của mẫu giảm tới mức tối thiểu.

 Đặc điểm:

- Kéo dài giữa 2 lần cấy chuyển nhờ ức chế sinh trưởng mẫu cây để giảm đến mức tối thiểu chi phí trong quá trình bảo quản.

- Trong thời gian bảo quản mô và tế bào thực vật vẫn tiếp tục sinh trưởng nhưng với tốc độ rất chậm

- Thời gian bảo quản sinh trưởng tối thiểu có thể kéo dài một vài năm

 Đối tượng: Bảo quản ngắn hạn các cây nhân giống vô tính in vitro ( chuối, dứa, khoai tây…), mẫu dưới dạng phôi , chồi, mầm,

cây con…

 Các tác nhân dùng ức chế sinh trưởng

 Nhiệt độ thấp: giảm nhiệt độ của phòng nuôi cấy.

 Chất ức chế sinh trưởng: bổ sung vào môi trường nuôi cấy axit abcisic(ABA), Clo cholin clorit (CCC)

 Các chất gây áp suất thẩm thấu: bổ sung vào môi trường nuôi cấy manitol, sorbitol, saccarose…

 Thay đổi điều kiện nuôi cấy như: giảm cường độ chiếu sáng, giảm nồng độ oxy….

 Sau bảo quản :

- Cần chuyển mẫu vào môi trường mới pha chế  đặt trong điều kiện tối thích trong 1 thời gian ngắn nhằm kích thích sự tái sinh trưởng trước khi bắt đầu một chu kỳ bảo quản mới

- Xác định thời gian tối đa an toàn cho từng loại cây trồng trong quá trình bảo quản sinh trưởng tối thiểu.

 Ví dụ: bảo quản sinh trưởng tối thiểu cây khoai tây

- Thời gian chuẩn bị mẫu: 8 tuần - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ

- Cường độ ánh sáng : 1500 lux - Thời gian bảo quản : 2 năm

- Độ ẩm 60-70% - Nhiệt độ: 10 độ C

Chuẩn bị mẫu Đánh giá sâu bệnh Tạo vật liệu khởi đầu

Cấp phát và trao đổi nguồn gen

Tái sinh tạo cây hoàn

chỉnh

Tái sinh tạo cây hoàn

chỉnh

Trẻ hóa nguồn gen

Trẻ hóa nguồn gen

Tái sinh tạo cây hoàn

Sơ đồ phương pháp bảo quản

sinh trưởng tối thiểu

Sơ đồ phương pháp bảo quản

sinh trưởng tối thiểu

2 PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN NGỪNG SINH TRƯỞNG TẠM THỜI

2 PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN NGỪNG SINH TRƯỞNG TẠM THỜI

 Môi trường bảo quản :Nitơ lỏng

 Mẫu: phôi hợp tử, mô sẹo, tế bào huyền phù, mầm ngủ, đỉnh ngọn….

 Thời gian: 20-30 năm hoặc lâu hơn (trong thời gian bảo quản tế bào, mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng)

 Trước khi bảo quản: cần được xử lý để tránh sự tạo các tinh thể nước trong tế bào gây chết mẫu

 Sau thời gian bảo quản: khi lấy ra được phá băng ở nhiệt độ 37-40oC, mẫu được phục hồi sinh trưởng, hoàn chỉnh tiếp tục nuôi cấy tạo cây

Quy trình bảo quản

Tách mẫu

Tách mẫu nuôi cấy in vitro đang ở pha tăng trưởng mạnh để đưa vào bảo quản

Xử lý chống đông cho tế bào, mô của mẫu cấy

(Bằng dung dịch 5-10% prolin, manitol 3-6% có bổ sung chất chống đông là dung dịch DMSO 1M + glycerol 1M + đường saccarose )

Bảo quản mẫu

Nhiệt độ -196oC trong nitơ lỏng

Xử lý lạnh

Xử lý đến nhiệt độ đông băng ổn định của tế bào chất (-30 : -40 oC)

Chuẩn bị mẫu

Làm lạnh sơ bộ (-30oC)

Làm lạnh sơ bộ (-30oC)

Bảo quản lạnh trong Nitơ lỏng

(-1960C)

Bảo quản lạnh trong Nitơ lỏng

(-1960C)

Làm tan nhanh

Tái sinh mẫu cấy

Tái sinh tạo cây hoàn chỉnh

Trẻ hóa nguồn gen

Trẻ hóa nguồn gen

Tái sinh cây hoàn chỉnh

Vườm ươm Đồng ruộng Đánh giá biến dị

Sơ đồ phương thức bảo quản ngừng

sinh trưởng tạm thời

Sơ đồ phương thức bảo quản ngừng

sinh trưởng tạm thời

Mẫu bảo quản trong nitơ lỏng Bình chứa nitơ lỏng

IV ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT BẢO QuẢN NGUỒN GEN THỰC VẬT

INVITRO

Đảm bảo độ an toàn và sạch bệnh cao,

có khả năng tạo quần thể cây đồng nhất với số lượng lớn.

Khả năng tái tạo, phục hồi các nguồn gen đã biến mất trong

tự nhiên

Có thể bảo quản được lâu dài với số lượng lớn và ổn định

Hạn chế khả năng mất nguồn gen, nhất là các nguồn gen có nguy cơ xói

mòn cao, các loài có nguy cơ bị tuyệt chủng.

Ưu điểm

Nhược điểm

Chi phí bảo quản lớn Đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và trang thiết bị hiện đại

Có khả năng tạo ra biến dị Soma với tần số biến dị khác nhau và ít lặp lại

1

2

3

21

1 Trong nông nghiệp.

-. Duy trì và nhân nhanh các giống cây trồng, đáp ứng được nhu cầu về một khâu rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp Công tác giống chủ yếu bao gồm các khâu thu thập nguồn gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo, tuyển chọn, thử nghiệm giống và nhân giống cao trong trồng trọt

-. Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nên ngày nay phần lớn các côngviệc này được thực hiện một cách khá thuận lợi và nhanh chóng

- Nhân giống ổn định chất lượng, năng suất cao phẩm chất tốt

VD: Các cây trồng chuyển gen, con lai F1…

- Tạo giống sạch bệnh chống chịu với môi trường

VD: khoai tây sạch virus, hoa lily sạch bệnh

V KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BẢO QuẢN NGUỒN GEN THỰC VẬT INVITRO

22

2 Trong công nghiệp

- Duy trì và nhân nhanh các giống hoa cây cảnh phục vụ cho thị trường.

VD: Nhờ nuôi cấy mô vào sản xuất các giống hoa như: tuylip, đồng tiền, hoa ly ở Hà Lan Sản xuất hoa lan ở Trung Quốc, đồng tiền ở Việt Nam, Cẩm Chướng …

nghiệp theo quy mô công nghiệp: Bạch đàn, keo…

23

3.Trong y học

Ứng dụng sản xuất nhanh sinh khối các cây dược liệu bằng thu sinh khối callus hoặc thể huyền

phù

VD: nhân nhanh sâm Triều Tiên…nhân sâm Ngọc Linh

- Phục tráng các giống cây quý hiếm nằm trong sách đỏ

VD: Cây sưa - Dallbergia tonkinensis, cây lan hài đỏ quí nhất Việt Nam

- Khắc phục các hiện tượng bất thụ trong lai xa

- Bảo quản nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm

- Lưu trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài ở nhiệt độ thấp mà không mất tính toàn thể của tế bào

- Làm cơ sở cho các kỹ thuật di truyền khác là khâu cuối cùng cho các công tác đánh giá giống

VI CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

(cây Vanilla planifolia)

Vanilla planifolia thuộc họ lan, thân dây leo

 Là giống cây trồng quan trọng trong công nghiệp sản xuất hương vị và cũng là giống mang tính thương

mại nhất thuộc họ lan

 Cây được trồng khắp các nước, đặc biệt là vùng nhiệt đới

 Không chỉ bị đe dọa bởi nạn phá rừng mà Vanilla planifolia còn đối mặt với nhiều loại bệnh khác do các

loại nấm gây ra như Phytophthora meadii, Fusarium oxysporum, Calospora vanillae

1 Giới thiệu

Vi nhân giống chắc chắn sẽ giúp phát triển một số lượng lớn cây sạch bệnh, cùng với việc bảo tồn giống cây trước khi nó tuyệt chủng

là một điều cần thiết và cũng là một cách lý tưởng để có thể tìm ra nhiều phương pháp ex-situ.

2 Nguyên vật liệu

 Vật liệu nuôi cấy

 Đoạn thân mang chồi

 Điều chỉnh pH về 5.8, trong thời gian đó nấu chảy agar trong lò viba rồi trộn agar vào hỗn hợp.

 Khử trùng môi trường ở 1210 C ở 1atm trong 20 phút

2.1 Gieo hạt in vitro

Lấy một số quả vanilla trưởng thành từ 4-7 tháng Khử trùng bề mặt mẫu trong ethanol 95% trong tủ cấy vô trùng

Tách vỏ bên ngoài để lấy hạt giống và chuyển chúng vào môi trường nuôi cấy đã được vô trùng

Môi trường rắn hay lỏng đều có thể sử dụng cho sự nảy mầm và nuôi cấy Môi trường MS rắn có bổ sung 0.5mg/l kinetin, 20g/l scrose và được đặt

trên máy lắc với tốc độ 200rpm

Cấy những hạt đã nẩy mầm vào môi trường nhân giống, môi trường MS có bổ sung 1mg/l BA và 0.5mg/l IBA

Phương pháp thực hiện

2-Phương pháp thực hiện

27

2.2 Vi nhân giống

Cảm ứng tạo chồi in vitro và sự phát triển sau đó

2.3 Tạo rễ in vitro

Mỗi đốt thân chồi nuôi cấy có thể tạo rất nhiều rễ

Cảm ứng tạo rễ: cấy những đoạn chồi có chiều dài khoảng 2cm vào môi

trường MS cơ bản Trong vòng 3 ngày ta sẽ thấy được sự hình thành rễ.

 Để 1 khoảng thời gian để những đoạn chồi đã tạo rễ trở nên cứng cáp sau

đó mới chuyển ra ngoài vườn ươm hay tiếp tục làm nguyên liệu cho chu trình

nhân giống mới.

Nếu muốn tiến hành nhân giống ta tiếp tục cấy những đoạn chồi có 1 đốt

thân hoặc cắt những đoạn có nhiều đốt thân thành những đoạn nhỏ và tiếp tục

2.4 Cảm ứng tạo mô sẹo

Nuôi cấy mô, sau đó cắt các nguyên liệu nuôi cấy để

chuẩn bị cho quá trình cảm ứng tạo sẹo.

Cấy các mô cho môi trường MS có bổ sung 1mg/lBA và

0.5mg/lNAA

Ban đầu giữ cho mô cấy ở trong tối từ 2-5 ngày để cảm

ứng tạo sẹo

2.5 Tái sinh cây

 Cấy các mô sẹo mới hình thành vào môi trường MS có chứa 1mg/lBA và 0.5mg/l IBA Nuôi cấy cấp 2 trong môi trường MS

trong vòng 20 ngày.

 Mô sẹo sẽ phân hóa thành Protocorm, chồi có rễ trong khoảng 3-6 tháng.

 Tách rời và nuôi cấy các chồi phát triển tốt và có tạo rễ cho đến khi cứng cáp rồi đem ra ngoài vườn hay sử dụng làm nguyên

liệu cho quá trình nhân giống kế tiếp.

Các giai đoạn khác nhau của quá trình tái sinh cây thành mô sẹo

2.6 Sản xuất hạt nhân tạo

 Treo protocorm hay chồi ngọn(0,5-1cm) trong hỗn hợp chất cơ bản MS medium chứa

 Các hạt nhân tạo được sản xuất theo cách này có thể bảo quản trong 10 tháng trong

nước vô trùng ở22±2 0 C với tỉ lệ nẩy mầm 80%

 Cấy các hạt này vào môi trường nhân gống , môi trường MS có bổ sung 1mg/lBA và

0,5mg/l IBA

hột nhân tạo

2.7 Bảo quản phôi

a Bảo quản trung hạn invitro nhờ sự sinh trưởng chậm

Nguyên tắc

Có nhiều cách khác nhau để kéo dài sự sống của mô và cơ quan thực vật

Phương pháp tăng sinh trưởng chậm thích hợp cho mọi loại cây trồng được nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng hay chồi ngọn

Có 3 loại tăng trưởng chậm

 Nhân giống invitro với tăng khoảng cách giữa các lần cấy chuyển

 Giảm tăng trưởng

 Ngừng tăng trưởng

 Thực hiện

 Sự tăng trưởng chậm xảy ra trong môi trường nuôi cấy vanilla bằng cách giảm nguồn carbon, giảm nồng độ cơ bản của môi trường, bổ sung mannitol,

và giảm thiểu sự mất hơi nước chủ yếu để tăng khoảng cách giữa các lần cấy chuyền

 Chuyển chồi vanilla in vitro, dài 2cm, vào môi trường MS cơ bản chứa 15g/l sucrose và mannitol, đặc biệt không bổ sung chất điều hòasinh trưởng

thực vật

 Đậy kín chai chứa môi trường bằng nắp poly propylene hoặc parafilm giảm thiểu sự thoát hơi nước nhưng vẫn có thể trao đổi khí và duy trì chúng ở

22±20 C, chiếu sáng trong vòng 12h với cường độ ánh sáng dưới 35 µmol/m2/s

 Những chồi này sẽ sinh trưởng rất chậm, có thể bảo quản trong ống nghiệm từ 7 đến 10 năm, mỗi năm cấy chuyển 1 lần vào môi trường mới

 Đẻ chồi phát triển bình thường, chuyển cây con vào môi trường MS cơ bản chứa 1.0mg/l BA và 0.5mg/l IBA ở 22±20 C với cường độ ảnh sáng dưới

35 µmol/m2/s

b Bảo quản dài hạn bằng phương pháp đông sâu

 nguyên tắc: - Nguyên liệu: mô chưa phân hóa, phôi soma và tổ chức đỉnh sinh trưởng

- Phương pháp có tác dụng làm cho nước trong tế bào bị đông lại, tế bào không có nước để thực hiện các phản ứng sinh hóa

 Thực hiện:

 Tiền xử lý và làm khô

 Cẩn thận chọn những hạt nhỏ, tròn đều, đường kính từ 4-5mm

 Tăng nồng độ từng bước trong môi trường MS: tăng nồng độ sucrose lên 0.1,0.3,0.5,0.7 và 1.0M trong 5 ngày, mỗi ngày ứng với 1 nồng độ

 Làm khô những hạt đã được tiền xử lý trên giấy lọc vô trùng trong đĩa Petri 90mm và sấy khô trên đĩa mỏngtừ 1-10h ở nhiệt độ phòng

 Xác định thời gian sấy tối ưu bằng cách kiểm tra sự nảy mầm của hạt

 Kĩ thuật trữ lạnh

 Chuyển 10 hạt khô vào mỗi 2.0ml lọ đông sâu (cryo)

 Làm đông nhanh bằng cách cho trực tiếp lọ đông sâu (cryo )vào dd nito lỏng

 Mẫu có thể được dự trữ trong dd nito lỏng trong 10 năm

 Hóa lỏng, rã đông tái tạo thành cây hoàn chỉnh

 Hóa lỏng mẫu bằng cách nhúng trực tiếp lọ cryo vào nước ở 400 C trong vòng 5-10 phút

 Trồng những hạt đã được rã đông vào đĩa Petri chứa 25ml môi trường MS rắn gồm 30g/l sucrose, 1mg/lBAP và 0,5mg/l IBA, đặt trong tối 7 ngày đầu sau

đó chiếu sáng với cường độ 35 µmol/m2/s để cây mẹ phát triển Tốc độ hồi phục 50-70%

 Sau 2 tuần, chồi mọc lên từ vỏ hột nhân tạo được cấy chuyền vào môi trường MS cơ bản để giúp cho sự phát triển của chồi và hệ thống rễ và cuối cùng huấn luyện cây và chuyển ra vườn