Nghiên cứu chè

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 Nguồn gốc cây chè Các công trình nghiên cứu và khảo sát trước đây cho rằng nguồn gốc của cây chè là vùng cao nguyên Vân nam Trung quốc, nơi có điều kiện khí hậu ẩm ướt quanh năm. Theo các tài liệu của Trung quốc thì cách đây 4.000 năm người Trung quốc đã biết dùng chè làm dược liệu, sau đó mới dùng chè để uống. Năm 1823, R.Bruce phát hiện những cây chè dại lá to ở vùng Atxam (Ấn Độ) từ đó các học giả người Anh cho rằng quê hương của cây chè là ở Ấn Độ chứ không phải ở Trung quốc. Những công trình nghiên cứu của Dejmukhatze (1961-1976) về phức catechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất catechin giữa các loại chè được trồng và mọc hoang dại đã nêu lên luận điểm về sự tiến hoá, trên cơ sở đó xác minh nguồn gốc cây chè. Dejmukhatze kết luận rằng những cây chè cổ xưa mọc hoang dại tổng hợp chủ yếu là (-)epi catechin và (+)epi catechin galat, ở chúng phát triển chậm khả năng tổng hợp (-)epigalo catechin và galat của nó để tạo thành (+) galo catechin. Khi nghiên cứu các cây chè dại ở Việt nam, ông cũng nhận thấy, chúng tổng hợp chủ yếu là (-)epi catechin và (+)epi catechin galat (chiếm 70% tổng số các loại catechin). Khi những cây chè dại được di thực lên phía Bắc, chúng thích ứng dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có các thành phần catechin phức tạp hơn. Từ sự biến đổi sinh hoá của các lá cây chè mọc hoang dại và các cây chè được trồng trọt, chăm sóc, Dejmukhatze cho rằng, nguồn gốc của cây chè chính là ở Việt Nam.[3] Hiện nay chè được phân bố khá rộng trong những điều kiện tự nhiên rất khác nhau, từ 30 độ vĩ nam đến 45 độ vĩ bắc, là những nơi có điều kiện tự nhiên khí hậu khác xa vùng nguyên sản. Những thành tựu khoa học của các nhà chọn giống Liên Xô (cũ), Trung quốc, Nhật Bản, Đài Loan đã tạo ra rất nhiều giống chè mới có khả năng thích ứng với các điều kiện khí hậu khác nhau, tạo nhiều triển vọng cho nghề trồng chè trên thế giới. 1.2 Giới thiệu về hợp chất tannin 1.2.1 Định nghĩa tannin Tannin là những hợp chất tự nhiên thuộc nhóm polyphenol phổ biến trong thực vật. Chúng có vị chát, có tính thuộc da. Có nghĩa là có khả năng liên kết với protein của da tạo thành cấu trúc bền vững với quá trình thối rữa. Phân tử lượng tannin khoảng 500 - 5.000. Thuật ngữ " Tannin" sử dụng trong công nghiệp sinh học và thực phẩm để chỉ tất cả những polyphenol tự nhiên có vị chát, song không phải các chất này có khả năng thuộc da thật sự. Tính chất này chỉ có với các hợp chất cao phân tử có phân tử lượng lớn từ 1.000 - 5.000. Các phân tử có phân tử lượng thấp hơn chỉ có vị chát không có tính thuộc da, để phân biệt người ta gọi là "tannin thực phẩm", "tannin chè". 1.2.2 Cấu trúc hoá học và phân loại 1.2.2.1 Cấu trúc hoá học Cấu trúc của tannin phức tạp được chia làm 2 loại: - Tannin thuỷ phân được (tannin pyrogallic). - Tannin không thuỷ phân được (tannin pyrocatechic). Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của tannin 1.2.2.2 Phân loại a, Tannin thuỷ phân được (Tannin pyrogalic = galotannin). Khi thuỷ phân bằng axit hoặc bằng enzim tannase giải phóng ra phần đường thường là glucose, có khi là những loại đường đặc biệt (hamamelose ). Phần không đường là các axit. Axit hay gặp là axit gallic. Các axit gallic có thể nối với nhau để tạo thành axit digallic, trigallic. Ngoài axit gallic còn gặp các axit khác như axit ellagic, axit luteolic Phần đường và phần không đường nối với nhau bằng cầu nối este (không phải cầu nối axetal) nên người ta coi tannin loại này là những pseudoglycosid. Axit gallic Axit digallic Hình 1.2 : Cấu trúc của axit gallic và axit digallic b, Tannin không thuỷ phân được (Tannin ngưng tụ, tannin pyrocatechic). Dưới tác dụng của axit hoặc emzim dễ tạo thành chất đỏ tannin gọi là phlobaphen không tan (Sản phẩm của sự trùng hợp hoá và oxy hoá) hay là phlobatannin. Trong cấu trúc của các tannin loại này còn có các đơn vị catechin hoặc epicatenchin hoặc gallocatenchin. Sự ngưng tụ thường xảy ra ở dây nối carbon – carbon, ví dụ giữa C8 của catechin và C4 của epicatechin tạo thành dimer. Catechin Epicatechin Hình 1.3: Cấu trúc của Catechin và Epicatechin 1.2.3 Tính chất của tannin 1.2.3.1 Tính chất vật lí - Tannin hầu như không tan trong các dung môi kém phân cực, tan được trong cồn loãng, glycerin, aceton, tốt nhất là nước nóng. - Tannin có dạng bột vô định hình, màu vàng nhạt hay vàng nâu nhạt, mùi đặc biệt, vị chát xít. - Khi thuỷ phân tannin pyrogallic trong môi trường axit thu được axit gallic. 1.2.3.2. Tính chất hoá học - Có tính axit. - Gây tủa một số muối kim loại (sắt III clorid, chì acetat…), alcaloid, albumin, gellatin. - Tạo nhiều dây nối hydro với mạch polypeotid của protein Có thể dựa vào kết tủa với muối sắt để xác định tannin trên vi phẫu. 1.3 Giới thiệu về enzim tannase [27] 1.3.1 Lịch sử phát triển Scheele tìm thấy sự xuất hiện của axit gallic trong dịch chiết từ mụn cây vào năm 1786 (Knudson, 1913)[19]. Robiquet phỏng đoán rằng có một loại vi sinh vật đã lên men và tiếp sau đó nó đã tiết axit gallic bên trong các mụn cây đó. Loraque cho rằng sự hình thành axit gallic từ axit tannic là sản phẩm của một loại vi sinh vật hoặc do quá trình oxi hoá. Để hỗ trợ cho giả thuyết này ông đã tìm ra thêm một số cơ chất có độc tính gây ức chế quá trình hình thành axit gallic từ axit tannic trong các mụn cây đó. Vanteighem là người đầu tiên chứng minh rằng sự hình thành của axit gallic là do hoạt động của một loại nấm mốc. Ông tuyên bố rằng loài vi sinh vật này là nấm mốc Penicillium glaucum và loài nấm mới được ông đặt tên là Aspergillus niger. Ông bắt đầu nuôi bề mặt và dịch thể để đánh giá khả năng phân giải của axit tannic. Frenchbach đã nuôi Aspergillus niger trên môi trường Raulin dịch thể với nguồn đường được thay thế bằng axit tannic và đã tách chiết được enzim tannase từ loại nấm này vào năm 1901 (Knudson,1913)[19]. Các nghiên cứu mở rộng đầu tiên về đặc tính, nguồn gốc, ứng dụng, phạm vi sử dụng, cơ chế phản ứng và độ đặc hiệu của tannase đã được tiến hành bởi nhóm tác giả Fernbanch, Pottevin, Dykerhoff, Ambruter, Thom và Raper vào đầu của thế kỷ XX. Những nghiên cứu này hơn nữa còn cho thầy rằng tannase là một enzim có thể biến đổi và có thể được tổng hợp trong quá trình lên men trạng thái rắn do nấm sợi Aspergillus và Penicillium. Ứng dụng của tannase để sản xuất axit gallic từ các nguyên liệu chứa tannin đã sớm được phát hiện. Năm 1960, tannase được tách và tinh chế từ thực vật và nấm bởi Madhavakrishna - Bose và Dhar – bose. Một công ty của Nhật Bản đã tiến hành thanh lọc và nghiên cứu đặc tính của Aspergillus sinh tannase. Họ cũng đã phát triển một thử nghiệm quang phổ để xác định của hoạt động tannase, trước đây dựa trên phương pháp chuẩn độ. Trong đầu những năm bảy mươi, một số bằng sáng chế đã được công bố cho các ứng dụng tiềm năng của tannase trong ngành công nghiệp thực phẩm và nước giải khát (Van de Lagemaat và Pyle, 2006)[36]. Nhiều nghiên cứu về các nguồn, khảo nghiệm, ứng dụng, sự cố định, phương pháp lọc, và đặc tính của tannase diễn ra trong những năm 1980. Các nghiên cứu chỉ ra rằng ngoài hình thành từ nấm sợi, tannase cũng được tìm thấy trên động vật (Lekha và Lonsane, 1997)[23] và vi khuẩn (Deschamps et al, 1983)[12]. Sau đó phương pháp săc kí đã được phát triển để xác định / phát hiện hoạt tính của tannase (Jean et al, 1981)[17]. Việc sản xuất tannase từ nguồn vi khuẩn được tập trung phát triển từ năm 1990 trở đi. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng lợi thế của quá trình lên men trạng thái rắn để sản xuất tannase từ nguồn nấm mốc. Hatamoto et al. (1996)[16] là người đầu tiên tái bản trình tự và khuếch đại bộ gen có hoạt tính sinh tannase để kích thích hoạt tính chuyển hoá sinh tannase trong Aspergillus oryzae. Osawa và Walsh (1993)[26] đã phát triển một phương pháp khảo nghiệm nhanh chóng và đơn giản để sàng lọc nấm sinh tannase ngoại bào phục vụ cho sản xuất. 1.3.2 Cấu trúc Hình 1.4 : Quá trình thủy phân axit tannic của enzim tannase 1.3.3 Vi sinh vật sinh tannase Trên 140 năm nghiên cứu đã phát hiện ra nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tannase, nổi bật là vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Một số loài động vật cũng có khả năng sinh tannase. Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự trao đổi vi sinh vật trong cơ thể động vật là nguyên nhân sinh tannase chứ không phải là do loài động vật đó. Nấm sợi: Các loài nấm sợi thuộc các chi Aspergillus và Penicillium được sử dụng rộng rãi cho việc sản xuất tannase. Đa số các công trình nghiên cứu đã sử dụng những nhóm này như: Aspergillus awamori Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Penicillium notatum, Penicillium islandicum, Penicillium digitatum, Penicillium citrinum Penicillium glabrum và Penicillium restrictum… Nấm men : Có vài báo cáo về sản xuất tannase từ nấm men như: Candida ssp., Pichia ssp., Debaryomyces hansenii… Vi khuẩn : Các báo cáo về khả năng sinh tannase từ vi khuẩn được thực hiện từ trước những năm 1980. Trong 25 năm gần đây, khoảng một chục các báo cáo đã được công bố về tannase vi khuẩn và khoảng 25 vi khuẩn sinh tannase mạnh đã được phân lập. Deschamps et al, (1983)[12] phân lập một số các chủng vi khuẩn sinh tannase có thể sử dụng axit tannic như nguồn carbon duy nhất. Họ đã có thể sản xuất tannase từ bốn chủng sử dụng tannin từ hạt dẻ và quan sát thấy rằng axit gallic là sản phẩm phân hủy duy nhất. Từ thể kỉ 19 trở đi, đã có sự tập trung mạnh vào việc sản xuất tannase bởi các loại vi khuẩn. Một số chủng đang được sử dụng như: Bacillus plumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Pseudomonas solanaceaum, Lactobacillus ssp., Enterococcus faecalis… Một vài loài vi khuẩn trong đường tiêu hoá của động vật hoang dã đã được tuyển chọn và thuần hoá để sản xuất tannase. Những vi khuẩn này được tách từ phân của gấu túi, dê, bò và con người. Thực vật : Nguồn tannase đã được báo cáo có mặt trong nhiều loài thực vật chứa tannin phong phú, chẳng hạn như Terminalia chebula (myrobolan) trái cây, Caesalpinia (div - Divi) quả, lá Angeissus latifolia (dhawa) và vỏ cây Cassia fistula (Konnam) và Acacia arabica (Babul). Tannase thực vật được tìm thấy là kém ổn định hơn so với các nguồn vi khuẩn và tách chiết khó khăn hơn (Lekha và Losane, 1997)[23]. 1.3.4 Điều kiện nuôi cấy Các loại nấm có nhiều sợi như Aspergillus và Penicillium được sử dụng phần lớn để sản xuất tannase. Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng nấm sợi. Các báo cáo về nguồn thu tannase từ vi khuẩn và nấm men có rất ít. 1.3.4.1 Phương pháp nuôi cấy Vi sinh vật sinh tannase được nuôi trên bề mặt dịch thể (SmF) và bề mặt lên men rắn (SSF) để nấm sợi phát triển. Vi khuẩn và nấm men được nuôi cấy riêng trong môi trường SmF. Trong sự giới hạn vị trí và đặc tính của enzim, năng suất thu được có lẽ không khả quan được như các phương pháp khác. Những nghiên cứu so sánh của Lekha và Losane (1994)[22] và Aguilar et al., (2001b)[6] chỉ ra rằng hiệu suất sinh Aspergillus sp., của môi trường SSF cao hơn SmF. Lekha và Losane (1994)[22] cũng chỉ ra rằng lượng enzim thu được từ vi sinh vật nuôi trong môi trường SSF cao hơn hẳn so với môi trường SmF. Các enzim thu được từ môi trường SSF cho nhiệt độ và pH ổn định hơn. 1.3.4.2 Cơ chất và môi trường nuôi cấy Tất cả các kĩ thuật nhân tạo hoặc bán nhân tạo đều được sử dụng để sản xuất chế phẩm tannase. Bradoo et al., (1997)[11] báo cáo về việc sử dụng môi trường Czapeck với một lượng rất nhỏ tannic axit lắc trong bình tam giác để nuôi Aspergillus japonicus. Các nồng độ axit tannic khác nhau ( 0,5 – 10%) trong từng môi trường là nguồn cacbon duy nhất. 2% (w/v) axit tannic cho hiệu suất thu enzim cao nhất. Họ cũng có thể bổ sung thêm vào môi trường một lượng nhỏ đường (0,2% w/v) trong các loại đường như: arabinose, fructose, galactose, xylose, lactose, sucrose, carboxy methyl celluose, bột mì vào môi trường nuôi cấy thu enzim. Nhưng họ cũng lưu ý không dùng đường glucose quá nhiều vì sẽ làm giảm hiệu suất thu enzyme. Nồng độ glucose tối thích là 1%. Seth và Chand (2000)[33] đã sử sụng môi trường nuôi cấy có chứa muối vô cơ và axit tannic để nuôi Aspergillus awamori và kết quả đạt được rất khả quan. Nồng độ axit tannic dao động từ 2,5 – 4,5 % (w/v) , và 3,5 % là nồng độ tối ưu. Saxena (2004)[32] đã sử dụng bột chebulic myrobalan ( 32%) thay cho axit tannic trong thí nghiệm của họ để nuôi các chủng Penicillium. Họ cũng lạc quan cho rằng chế phẩm tannase sử dụng loại tannin trong tự nhiên này phù hợp với việc nuôi cấy lắc trong bình tam giác. 4- 12% ( w/v) lượng bột này dược sử dụng để bổ sung vào môi trường và 11,6% (w/v) là nồng độ thích hợp nhất. Lekha và Losane (1994)[22] đã sử dụng đường từ bã mía trong môi trường lên men rắn để nuôi Aspergillus niger PKL104. Đường trong bã mía được cung cấp vào môi trường dinh dưỡng có chứa 6% (w/v) axit tannic. Aguilare et al., (2001b)[6], đã báo cáo về việc sử dụng bọt Polyurethane cấp vào môi trường lên men rắn của Aspergillus niger. Môi trường trao đổi chất được sử dụng này có chứa nồng độ axit tannic lên đến 20% (w/v) . Nồng độ tối ưu của axit tannic trong môi trường này là 10% (w/v). Hơn nữa, họ còn sử dụng đường glucose với nồng độ 0,65 – 20% (w/v) để cung cấp cho môi trường dinh dưỡng có chứa 2,5% (w/v) axit tannic. Họ cho rằng các chất dị hoá được tích tụ mạnh mẽ hơn trong quá trình tổng hợp tannase là nhờ đường glucose được cung cấp vào môi trường. Ramirez-Coronel et al., (2003)[28] đã báo cáo về việc sử dụng bọt Polyurethane để cung cấp vào môi trường nuôi Aspergillus niger. Họ đã sử dụng môi trường dinh dưỡng có chứa muối khoáng và 0.1% (w/v) axit tannic . Sabu et al., (2005)[29] sử dụng lõi cây cọ và bột nghiền từ hạt me làm cơ chất bổ sung vào môi trường lên men rắn để thúc đẩy quá trình tạo tannase của Aspergillus niger [...]... năng xuất tối đa Qua đó giúp cho người trồng chè thu hoạch chè với năng suất cao, chất lượng chè đồng đều Có rất nhiều hình thức đốn chè khác nhau : Đốn tạo hình, đốn phớt, đốn lửng, đốn đau, đốn trẻ lại Đốn đau trước, đốn phớt sau Đốn tạo hình chè con trước, đốn chè trưởng thành sau Trên cơ sở như vậy chúng ta thấy sản lượng chè đốn hàng năm của các vùng trồng chè là rất lớn Qua tìm hiểu thì hiện nay... chè CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguồn vi sinh vật và thiết bị 2.1.1 Nguồn vi sinh vật Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu được phân lập từ các mẫu đất trồng chè ở Hoà Bình, Phú Thọ và các chủng đang được lưu giữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật – ĐHQGHN (VTCC) 2.1.2 Thiết bị, hoá chất và môi trường Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng thiết bị và hoá chất... nông dân trong vùng chè kỹ thuật chăm sóc và hái chè để có chất lượng cao là hết sức quan trọng Từ đó chúng ta mới có thể xây dựng vùng chè sạch Đặc biệt là quy trình đốn chè, sau mỗi vụ thu hoạch, việc tiến hành đốn rất quan trọng bởi nó ảnh hưởng trực tiếp tới sản lượng ra búp của lứa sau đồng thời tiến hành đốn giúp cho cây chè có tán đồng đều, tạo thuận lợi tới việc thu hái chè bằng máy đạt năng... năng sinh enzim tannase trên lá chè khô với các mức độ khác nhau, có chủng sinh tannase tốt nhưng khả năng phân hủy chè kém Chủng HB6.1 có khả năng sinh enzim tannase cao và đồng thời phân hủy lá chè tốt được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo 3.1.2.3 Khả năng sinh các enzim ngoại bào của chủng HB6.1 Cấy chủng HB6.1 vào môi trường Czapeck, bổ sung tannic axit 1% và 1% chè khô Sau 48h nuôi cấy lắc 150... hoạt tính tannase và khả năng phân hủy chè như phương pháp của mục 2.2.4 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập và tuyển chọn 3.1.1 Phân lập Từ các mẫu đất trồng chè ở Hoà Bình, Phú Thọ, cùng các chủng vi sinh vật có sẵn tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật – ĐHQGHN, chúng tôi tiến hành phân lập và cấy trên môi trường phân lập chứa dịch chiết lá chè ở nhiệt độ 30 oC, sau 4 ngày Kết quả... tannase cao nhất được sử dụng để nuôi trên chè khô để xác định khả năng phân huỷ lá chè 3.1.2.2 Khả năng phân huỷ lá chè Các chủng vi sinh vật được nuôi lên men xốp trên 10g lá chè khô trong bình tam giác 250 ml, độ ẩm 50% Sau 1 tuần tiến hành chiết dịch nuôi để định lượng enzim và kiểm tra khối lượng Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.2 : Bảng 3.2 Khả năng phân huỷ lá chè khô STT Nấm sợi 1 2 3 4 5 6 7 8 9... nấm sợi, lắc trong 24h-48h) - Sau 7 ngày thu các bình chè : + Mỗi bình cho nước với tỉ lệ 40(ml) nước : 10(g) chè + Nghiền bằng thìa để chè nhuyễn vào nước sau đó cho lên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút để enzyme trong chè hoà tan hoàn toàn vào nước + Sau 1h li tâm 8.000 vòng/phút/10 phút, thu dịch chiết enzyme, và định lượng hoạt độ tannase + Bã chè thu được rửa sạch và sấy khô ở 105oC/4h rồi cân... khoáng để làm tăng độ ẩm cho môi trường rắn Hiệu suất tốt với môi trường vỏ café Belur et al (2010) [10] đã có nghiên cứu cho rằng môi trường nhũ tương với nguồn nito hữu cơ cho hiệu suất cao hơn nguồn nito vô cơ khi họ tiến hành tách chủng Serratia ficaria DTC Selwal et al (2010) đã có nghiên cứu cho thấy chủng Pseudomonas aeruginosa III B 8914 có hiệu suất sinh tannase cao hơn các chủng Phylanthus emblica... rằng nhiệt đọ tối đa để sinh tổng hợp tannase của Bacillus lichiniforms KBR6 là 35 oC Mondal et al , (2001) đã nghiên cứu thấy nhiệt độ tối ưu của Bacillus cereus KBR9 là 40oC trong khi Lactobacillus sp ASR-S1 sinh tổng hợp tannase tốt nhất ở 30oC (Sabu et al , 2006) Selwel et al., (2010) nghiên cứu thấy nhiệt độ tối ưu để sinh tổng hợp tannase của Pseudomonas aeruginosa III B 8914 là 37 oC 1.3.4.4 pH... ASA Specilaenzyme GmbH (Đức) 1.4 Tình hình sử dụng phế thải chè làm phân bón hữu cơ Sau hơn thời gian trở thành thành viên của tổ chức WTO, cũng như các ngành kinh tế khác, ngành chè nước ta có thêm nhiều cơ hội và thách thức Và thách thức lớn nhất là chất lượng sản phẩm Chất lượng là cánh cửa để chè Việt Nam bước ra thị trường thế giới Để chè thành phẩm có chất lượng tốt thì 30% phụ thuộc vào chế biến . giúp cho cây chè có tán đồng đều, tạo thuận lợi tới việc thu hái chè bằng máy đạt năng xuất tối đa. Qua đó giúp cho người trồng chè thu hoạch chè với năng suất cao, chất lượng chè đồng đều LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguồn vi sinh vật và thiết bị 2.1.1 Nguồn vi sinh vật Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu được phân lập từ các mẫu đất trồng chè ở Hoà Bình, Phú Thọ. quốc. Những công trình nghiên cứu của Dejmukhatze (1961-1976) về phức catechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất catechin giữa các loại chè được trồng và mọc