Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 183 224

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN ĐÌNH TÚ NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.224 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN ĐÌNH TÚ NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.224 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi Sinh – Sinh Học Trường Đại Học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo ThS. Lê Thị Thu Hương, người đã tận tình giúp đỡ tôi từ những bước đầu tiên cho tới khi tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi Sinh – Sinh Học, Bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi xin gửi lời cảm ơn đến ban Giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều sai sót. Tôi rất mong được sự góp ý của các thầy cô, các bạn để khóa luận hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 10, tháng 5, năm 2014 Sinh viên ĐOÀN ĐÌNH TÚ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh 2 1.1.3. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 4 1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh 4 1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 5 1.2.1. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 5 1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 6 1.2.3. Phân loại xạ khuẩn 7 1.3. Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 8 1.4. Tuyển chọn, cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn 8 1.4.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 8 1.4.2. Đột biến cải tạo giống 8 1.4.3. Bảo quản giống xạ khuẩn 9 1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9 1.6. Chiết tách và tinh chế sản phẩm 10 1.7. Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh 11 1.7.1. Phổ hồng ngoại 11 1.7.2. Phổ tử ngoại 12 1.7.3. Phổ khối 12 1.8. Một số nghiên cứu liên quan 12 1.8.1. Quy tắc sinh tổng hợp kháng sinh thiopeptid Cyclothiazomycin bằng cách phiên mã chuỗi SHJG8833 của Streptomyces hygroscopicus 5008. 12 1.8.2. Sự kích hoạt và bất hoạt các chất chuyển hóa thứ cấp ở Streptomyces albus và Streptomyces lividans sau khi chuyển đổi với cosmids có chứa các cụn gen thienamycin từ Streptomyces cattleya……13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.1.1. Nguyên vật liệu 15 2.1.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ: 18 2.2. Nội dung nghiên cứu: 19 2.3. Phương pháp thực nghiệm: 19 2.3.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn: 19 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống: 19 2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán: 20 2.3.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 21 2.3.5. Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 21 2.3.6. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV 21 2.3.7. Phương pháp lên men mẻ 23 2.3.8. Phương pháp xác đinh độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh trong dịch lên men 23 2.3.9. phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ 23 2.3.10. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 24 2.3.11. phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 25 2.3.12. Phương pháp xác định kháng sinh tinh khiết thu được 25 2.3.13. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP 25 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 28 3.1. Kết quả thử hoạt tính của Streptomyces 183.224 khi phân lập 28 3.2. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp và VSV kiểm định 28 3.3. Nghiên cứu định tên khoa học của Streptomyces 183.224 29 3.4. Kết quả quá trình chọn lọc ngẫu nhiên 30 3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 31 3.6. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 32 3.7. Kết quả lên mem sinh tổng hợp kháng sinh 33 3.8. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 34 3.9. Kết quả chọn dung môi chiết xuất kháng sinh 35 3.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 37 3.11. Kết quả sắc ký cột 38 3.12. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và sơ bộ xác định các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 1. Kết luận Error! Bookmark not defined. 2. Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid 2’-deoxyribonucleic CW Thành tế bào – Cell wall DMHC Dung môi hữu cơ ĐB Đột biến Gr Gram IR Hồng ngoại – Infrared ISP International Streptomyces project KS Kháng sinh L-DAP L-diaminopimelat MTdt Môi trường dịch thể MTth Môi trường thích hợp TB Tế bào TĐC Trao đổi chất VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại – Ultraviolet B. cereus Bacillus cereus S. flexneri Shigella flexneri Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm SK Sắc ký DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật kiểm định Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 3.1: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 183.224 trên 6 vi khuẩn khi phân lập Bảng 3.2: Hoạt tính KS của Streptomyces 183.224 trên 7 môi trường Bảng 3.3: Các đặc điểm phân loại của Streptomyces 183.224 và Streptomyces albidus theo ISP Bảng 3.4: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên Streptomyces 183.224 Bảng 3.5: Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 1 Bảng 3.6: Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 2 Bảng 3.7: Kết quả chọn môi trường lên men Bảng 3.8: Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt Bảng 3.9: Ả nh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và sau 5 ngày Bảng 3.10: Ả nh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh Bảng 3.11: Kết quả thử dịch chiết kháng sinh bằng 5 DMHC Bảng 3.12: Chiết kháng sinh bằng ethylacetat ở pH 7, chiết lặp 3 lần Bảng 3.13: Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi Bảng 3.14: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Bảng 3.15: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 3-15. Bảng 3.16: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2. Bảng 3.17: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 1-10. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh Hình P1: Hình dạng chuỗi bào tử Streptomyces 183.224 Hình P2: Hình dạng bề mặt bào tử Streptomyces 183.224 Hình P3: Thử hoạt tính KS các biến chủng sau CLNN bằng phương pháp khối thạch (VSV kiểm định B. cereus) Hình P4: Thử hoạt tính KS các phân đoạn sau chạy cột lần 1 bằng phương pháp khoanh giấy lọc (VSV kiểm định B. cereus) Hình P5: Lên men chìm xác định biến chủng để lên men tốt nhất Hình P6: Kết quả đo Phổ UV-VIS 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhà vi khuẩn học người Anh Alexander-Flemming và Howara Walter Florey, Ernst Boris Chaen đã mở ra kỷ nguyên mới cho ngành y học – công nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng trong điều trị bệnh nhờ phát minh ra penicillin. Nhưng hiện nay do tình trạng lạm dụng kháng sinh và nhiều nguyên nhân khác đã dẫn tới nguy cơ vi khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng. Do đó, đi kèm với các biện pháp sử dụng kháng sinh an toàn, hợp lý thì việc nghiên cứu sản xuất ra kháng sinh mới có nhiều đặc tính ưu việt thực sự rất cần thiết. Cùng với việc tạo ra kháng sinh bằng con đường tổng hợp và bán tổng hợp thì việc tìm ra kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật vẫn giữ một vị trí vô cùng quan trọng. Chi Streptomyces gồm nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc, đặc tính kháng khuẩn. Một số loài còn có khả năng kháng tế bào ung thư và HIV. Bởi vậy mà hiện nay, ở Việt Nam đang phân lập và nghiên cứu rất rộng rãi. Sản xuất kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật đặc biệt phù hợp với định hướng phát triển công nghiệp dược nước ta. Do vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183.224” với mục tiêu: - Phân loại, định tên khoa học của Streptomyces 183.224 theo ISP. - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất. - Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được. [...]... 1:10 Các bình lên men lắc ở nhiệt độ 28±0,1oC, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120 giờ Sau đó lọc hoặc li tâm, rồi thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch  Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: Các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích cho việc sinh tổng hợp kháng sinh Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương... Novobiocin 5 Kháng sinh dị vòng chứa N 6 Kháng sinh dị vòng chứa O 7 Các kháng sinh nhân thơm 4 1.1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh [6] Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí nghiệm Nhân giống quy mô thí nghiệm Nhân giống trong thiết bị nhân giống Lên men tổng hợp kháng sinh Dịch lên men Lọc, ly tâm Sinh khối Dịch lọc Chiết bằng dung môi hữu cơ Dịch chiết sinh khối Dùng cột trao đổi ion… Dịch chiết... rộng: Kháng sinh phải bao hàm cả các chất tổng hợp bằng phương pháp hóa học có tác dụng diệt khuẩn như các dẫn chất quinolon (pefloxacin, norfloxacin…) [7] 1.1.2 Phân loại kháng sinh Có nhiều cách khác nhau để phân loại các kháng sinh: phân loại theo nguồn gốc (kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên, kháng sinh bán tổng hợp) , theo phổ tác dụng (phổ rộng hay hẹp), theo cơ chế tác dụng (ức chế tổng hợp vách tế... Hitachi U-1900; máy đo phổ IR: Impact 410NicoLet; máy đo phổ khối (MS): Xevo-TQMS 2.2 Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu định tên khoa học, phân lập xạ khuẩn từ đất Cải tạo chủng xạ khuẩn ban đầu  Nghiên cứu lên men, chiết xuất, tinh chế kháng sinh  Nghiên cứu một số đặc tính của kháng sinh do chủng xạ khuẩn sinh ra 2.3 Phương pháp thực nghiệm 2.3.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn  Lấy đất ở cách bề mặt... bào, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nucleic, thay đổi tính thấm màng tế bào, ức chế tổng hợp acid folic), theo cấu trúc hóa học… Song cách phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho các nhà nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được công thức hóa học của nó Các chất kháng sinh được phân... kiểm soát toàn bộ quy trình, tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao  Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn [10]  Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung, lên men bán liên tục, lên men liên tục [14] 1.6 Chiết tách và tinh chế sản phẩm  Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Tùy theo đặc trưng của loài mà KS được tiết... Đóng gói Sản phẩm đóng gói Hình 1.1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 1.1.4 Ứng dụng của kháng sinh  Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh dùng điều trị các bệnh do vi khuẩn, vi nấm gây ra Đặc biệt, một số kháng sinh còn được dùng trong hóa trị liệu ung thư [14] 5  Ngoài lĩnh vực y học: Kháng sinh còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác  Trong chăn nuôi: Kháng sinh được dùng để điều trị các bệnh cho... I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh Định nghĩa hẹp truyền thống: Kháng sinh là những hợp chất hóa học do sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus…) hay cả tế bào ung thư, ở nồng độ thấp [6] Định nghĩa rộng: Kháng. .. men sinh tổng hợp kháng sinh Có 2 phương pháp lên men chính:  Lên men bề mặt: Trong phương pháp này, vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng 10  Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi hỏi thiết bị phức tạp  Nhược điểm: Khó cơ giới hóa, tự động hóa, khó vô trùng, tốn diện tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng môi trường thấp [6]  Lên men. .. Genetic Elements [17] Để tạo ra các biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định hướng các gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp TB trần Sau khi chịu tác động của các tác nhân đột biến, phần lớn các VSV chết Trong số các biến chủng sống sót có biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp KS . TÚ NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183. 224 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN ĐÌNH TÚ NGHIÊN. TÚ NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183. 224 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi Sinh – Sinh Học Trường. sinh vật đặc biệt phù hợp với định hướng phát triển công nghiệp dược nước ta. Do vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183. 224 với mục tiêu: