CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
3.3. Nghiên cứu định tên khoa học của Streptomyces 183.224
Mục đích: Bước đầu phân loại định tên khoa học của xạ khuẩn phân lập được.
Nuôi cấy Streptomyces 183.224 trên các môi trường ISP, đối chiếu với các đặc điểm phân loại của xạ khuẩn Streptomyces albidus, kết quả được giới thiệu trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Các đặc điểm phân loại của Streptomyces 183.224 và Streptomyces albidus theo ISP [18]
Đặc điểm Streptomyces
183.224
Streptomyces albidus Màu khuẩn ty khí sinh YW (trắng vàng) YW
Màu khuẩn ty cơ chất 1 1
Sắc tố melanin 0 0
Sắc tố hòa tan 1 1
Chuỗi bào tử RF (thẳng, hơi cong) RF
Bề mặt bào tử Sm (phẳng, nhẵn) Sm
L-Arabinose ± +
D-Xylose ± ±
Inositol ± ±
D-Mannitol + +
D-Fructose ++ +
Rhamnose ‒ ‒
Saccarose ± ±
Raffinose ± ±
Nhận xét: Streptomyces 183.224 có 12/14 (88,71%) đặc điểm giống với Streptomyces albidus. Như vậy Streptomyces 183.224 gần giống với S.
albidus, cần nghiên cứu thêm để có thể kết luận một cách chính xác.
3.4. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên
Mục đích: Chọn dạng chủng có hoạt tính KS cao trong quần thể.
Kết quả: Kết quả chính chọn lọc ngẫu nhiên được giới thiệu trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên Streptomyces 183.224
Dạng chủng
S.flexneri B.Cereus Dạng chủng
S.flexneri B.Cereus
(mm) s
(mm) s
(mm) S
(mm) s 1 18,51 0,72 21,43 0,42 16 20,04 1,05 21,46 0,34 4 19,91 0,64 21,49 0,65 19 20,73 0,52 21,39 0,67 5 21,43 0,47 23,15 0,60 20 20,37 0,41 21,72 0,10 6 18,82 1,51 20,10 0,08 21 20,35 0,37 21,81 0,78 9 21,53 1,08 21,89 0,66 24 18,97 1,19 20,36 0,73 11 19,89 0,21 21,29 0,77 26 20,25 0,39 21,33 0,47 15 17,86 0,26 21,92 0,40 30 21,65 0,62 22,87 0,45 Nhận xét: Các dạng chủng 5, 9, 30 cho hoạt tính KS cao nhất, cấy giữ lại để tiến hành đột biến cải tạo giống.
3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1
Mục đích: Tạo biến chủng có khả năng siêu tổng hợp KS.
Chọn dạng chủng 5 để đột biến bằng ánh sáng UV. Các kết quả chính được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5: Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 1
Biến chủng
S. flexneri B. cereus
(mm) S
% biến đổi hoạt
tính
(mm) s % biến đổi hoạt tính
4 23,26 1,33 108,34 21,77 0,82 108,58
7 20,68 1,57 96,32 17,77 0,70 88,63
8 22,39 0,42 104,29 20,04 1,22 99,95
11 22,80 0,46 106,19 21,35 0,97 106,48
13 21,63 1,00 100,79 21,19 1,15 105,69
16 24,67 1,16 114,90 26,92 0,80 134,26 17 23,36 0,99 108,80 24,04 1,86 119,90
24 20,47 1,40 95,34 24,14 0,85 120,40
27 23,43 1,53 109,13 22,57 1,11 112,57
28 22,79 0,35 106,15 21,84 1,47 108,93
30 24,44 0,06 113,83 22,69 0,73 113,17 Chứng 21,47 0,14 100,00 20,05 0,97 100,00 Nhận xét: Sau đột biến lần một tỷ lệ sống sót là: 1,54%, hoạt phổ của dạng chủng 5 có thay đổi, tăng trên cả B. cereus và S. flexneri. Chọn được các biến chủng tốt để đột biến cải tạo giống lần 2 là các biến chủng 16, 17, 30.
3.6. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2
Mục đích: Tạo biến chủng có khả năng tổng hợp KS cao hơn.
Chọn biến chủng 16 gây đột biến bằng ánh sáng UV. Kết quả chính thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6: Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 2
Biến chủng
S. flexneri B. cereus
(mm) s % biến đổi hoạt tính
(mm) s % biến đổi hoạt tính
1 23,45 0,66 102,54 25,90 0,14 113,10
2 23,63 0,68 103,32 24,77 0,26 108,17
4 24,48 0,38 107,04 26,39 0,43 115,24
6 23,53 0,44 102,89 25,26 0,40 110,31
7 24,09 0,04 105,33 26,49 0,16 115,68
9 23,11 0,34 101,05 25,51 0,76 111,40
10 23,35 0,25 102,10 25,54 0,11 111,53
11 21,99 0,62 96,15 26,16 0,71 114,24
12 21,39 0,54 93,53 26,49 0,96 115,68
13 20,37 0,23 89,07 25,97 0,75 113,41
15 23,27 0,31 101,75 26,50 1,41 115,72
17 23,05 1,14 100,79 25,09 0,75 109,56
25 22,84 0,85 99,87 23,44 1,35 102,36
26 23,22 0,59 101,53 24,14 0,39 105,41
Chứng 22,87 0,28 100,00 22,90 0,67 100,00 Nhận xét: Sau đột biến cải tạo giống lần 2 bằng tia UV, % sống sót là 0,95%, chọn các biến chủng 4, 7, 15 có hoạt tính sinh KS cao để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.7. Kết quả lên mem sinh tổng hợp kháng sinh
Chọn môi trường lên men tốt nhất:
Mục đích: Chọn MT lên men để Streptomyces 183.224 sinh KS tốt nhất.
Tiến hành lên men Streptomyces 183.224 trên các MT1, MT2, MT7 dt.
Các kết quả được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7: Kết quả chọn môi trường lên men
Môi trường S. flexneri B. cereus
(mm) s (mm) s
MT1 dt 21,72 0,48 20,10 0,94
MT2 dt 22,86 0,56 22,04 0,36
MT7 dt 17,82 0,78 16,14 1,02
Nhận xét: Kết quả lên men Streptomyces 183.224 trên MT2 dt có hoạt tính KS mạnh nhất nên chọn MT2 dt là MT lên men cho những thử nghiệm tiếp theo.
Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất:
Mục đích: Chọn dạng chủng, biến chủng lên men cho hoạt tính KS cao nhất.
Lên men các dạng chủng chọn được sau chọn lọc ngẫu nhiên và các biến chủng sau đột biến cải tạo giống. Kết quả được giới thiệu trong bảng 3.8.
Bảng 3.8: Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2 dt
Dạng - biến chủng S. flexneri B. cereus
(mm) s (mm) s
CLNN 1 19,22 0,26 19,72 0,91
CLNN 6 20,84 0,79 19,48 1,53
CLNN 10 21,62 0,51 18,84 0,13
ĐB1 16 23,24 0,76 24,12 0,50
ĐB1 17 20,02 0,23 21,34 0,43
ĐB1 30 18,84 0,81 21,38 0,41
ĐB2 4 22,72 0,59 22,14 0,92
ĐB2 7 20,12 1,47 20,86 0,64
ĐB2 15 21,26 0,65 22,64 0,72
Nhận xét: Biến chủng ĐB1 16 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất, chọn làm chủng lên men chìm lấy dịch cho những nghiên cứu sau.
3.8. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc
Mục đích: Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men dưới tác động của nhiệt độ và pH nhằm xác định điều kiện bảo quản, chiết tách, tinh chế KS.
Ảnh hưởng của pH: Kết quả được giới thiệu ở bảng 3.9.
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS
pH
S. flexneri B. cereus
1 ngày 5 ngày 1 ngày 5 ngày
(mm) s
(mm) s
(mm) s
(mm) s pH 3 19,04 0,28 19,27 0,59 21,22 1,30 22,13 0,39 pH 5 20,92 0,39 21,32 0,41 21,67 0,34 21,52 0,62 pH 7 21,68 0,37 21,77 1,02 22,19 0,34 22,77 1,02 pH 9 20,68 1,01 21,01 0,64 21,35 0,90 20,47 0,43 pH 11 21,58 2.42 19,14 0,28 21.24 0.92 20,13 0,41 Nhận xét: Hoạt tính của KS tăng giảm không đáng kể khi pH thay đổi, ở pH 7 hoạt tính kháng sinh là cao nhất. Nên bảo quản KS ở pH 7 để hoạt tính KS được giữ ổn định.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Kết quả được giới thiệu trong bảng 3.10.
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh
Thử nghiệm S. flexneri B. cereus
(mm) s (mm) s
Dịch lọc ở nhiệt độ thường 22,36 0,36 23,04 0,28 Dịch lọc đun sôi 10 phút 21,70 0,40 23,92 0,74 Dịch lọc đun cách thủy 30 phút 21,98 1,08 20,82 1,18 Nhận xét: KS tương đối bền với nhiệt, hoạt tính ít thay đổi khi đun dịch lọc dưới ngọn lửa đèn cồn và đun cách thủy.
3.9. Kết quả chọn dung môi chiết xuất kháng sinh
Mục đích: Xác định dung môi và pH chiết tối ưu.
Kết quả: Kết quả được trình bày trong bảng 3.11.
Bảng 3.11: Kết quả thử dịch chiết kháng sinh bằng 5
Dung môi
pH
S. flexneri B. cereus
Pha dung
môi Pha nước Pha dung
môi Pha nước
(mm) s
(mm) s
(mm) s
(mm) s
n-Butanol
3 22,38 0,98 12,16 0,96 23,72 0,80 11,30 0,56 5 23,56 0,76 12,44 0,52 23,16 0,10 12,58 0,12 7 23,26 0,66 13,20 0,70 23,74 0,42 12,84 0,40 9 21,74 0,40 13,02 0,50 23,70 0,28 12,98 0,22 11 22,80 0,96 14,44 0,14 23,92 0,20 12,98 0,38
Ethylacetat
3 23,72 0,80 13,50 0,58 23,60 0,28 13,68 0,84 5 23,18 0,76 13,24 0,90 23,66 0,44 14,32 0,92 7 24,80 0,72 13,34 0,52 24,00 0,16 13,12 0,26 9 23,16 0,92 12,54 0,18 24,02 0,92 13,70 0,48 11 24,24 0,30 12,44 0,32 23,70 0,16 12,92 0,56
Buthylacetat
3 21,50 0,96 13,40 0,38 22,66 0,40 12,90 0,72 5 22,88 0,90 14,32 0,54 21,22 0,42 13,42 0,42 7 21,16 0,57 14,96 0,72 20,64 0,60 13,56 0,28 9 22,60 0,20 13,98 0,74 20,94 0,96 13,60 0,24 11 20,96 0,92 14,00 0,20 21,82 0,42 13,76 0,50
Chloroform
3 21,14 0,44 21,50 0,92 20,40 0,18 17,82 0,30 5 23,70 0,20 21,30 0,50 21,60 0,44 18,44 0,74 7 24,30 0,78 19,70 0,90 21,18 0,78 17,54 0,80 9 22,10 0,60 20,30 0,74 21,00 0,96 16,72 0,70
11 22,40 0,70 20,70 0,14 20,60 0,18 16,80 0,38
Dichloro methan
3 19,80 0,32 16,10 0,14 21,70 0,46 16,80 0,80 5 19,50 0,10 16,04 0,64 20,62 0,12 18,10 0,50 7 20,30 0,24 14,06 0,50 22,44 0,78 17,58 0,30 9 20,90 0,60 15,00 0,50 22,40 0,12 16,24 0,56 11 18,38 0,32 15,32 0,96 20,72 0,56 16,54 0,22
Nhận xét: Dịch chiết dung môi ethylacetat ở pH 7 có hoạt tính kháng sinh cao nhất nhưng pha nước vẫn còn hoạt tính. Do vậy phải dùng phương pháp chiết lặp (pha nước được chiết lần 3 bằng ethylacetat) mới chiết kiệt được kháng sinh.
Kết quả chiết kháng sinh bằng ethylacetat lặp 3 lần được trình bày trong bảng 3.12.
Bảng 3.12: Chiết kháng sinh bằng ethylacetat ở pH 7, chiết lặp 3 lần
Các lần chiết
S.flexneri B.cereus
Pha dung
môi Pha nước Pha dung
môi Pha nước (mm) s
(mm) s
(mm) s
(mm) s Lần 1 24,80 0,72 13,34 0,52 24,00 0,16 13,12 0,26 Lần 2 18,92 0,43 9,67 0,09 19,87 1,32 8,50 0,87
Lần 3 11,80 1,06 0 0 10,28 0,45 0 0
Nhận xét: Khi dùng phương pháp chiết lặp thì chiết được kiệt KS trong dịch lọc. Áp dụng phương pháp này để chiết KS trong dịch lọc cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi
Mục đích: Chọn hệ dung môi có khả năng tách các thành phần trong dịch chiết tốt nhất để chạy cột, tinh chế KS. Xác định các thành phần trong dịch chiết DMHC.
Triển khai sắc ký lớp mỏng trên 4 hệ dung môi
Hệ 1: Chloroform: Methanol: Amoniac 25% (2:2:1)
Hệ 2: n-Butanol: Ethanol: Dimethylformamid (3:1:1)
Hệ 3: Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1)
Hệ 4: Ethylacetat: Propanol: Acetonitril (2:3:1) Bảng 3.13: Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi
(hiện hình VSV bằng B.cereus)
Hệ dung môi Hệ 1 Hệ 2 Hệ 3 Hệ 4
Vết 1 Vết 2 Vết 3
Rf 0,85 0,78 0,82 0,83 0,72 0,33
Nhận xét: Hiện hình VSV thấy hệ 1, hệ 2, hệ 3 có 1 vết. Hệ 4 thấy có 3 vết với Rf khác nhau nhiều, do đó hệ 4 có khả năng tách tốt hơn cả, đây là cơ sở để chọn hệ dung môi chạy cột tinh chế KS.
3.11. Kết quả sắc ký cột
Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu lấy kháng sinh tinh khiết.
Dịch lọc dịch lên men gộp lại được 2,5 lít, chiết bằng ethylacetat ở pH 7 được 220 ml dịch chiết, cất quay thu được 0,1067 g bột kháng sinh thô màu nâu đỏ.
Chạy cột toàn bộ kháng sinh thô thu được sau khi cất quay với hệ 4.
Lấy 24 phân đoạn mỗi phân đoạn 3,5 ml vào ống nghiệm sạch. Thử hoạt tính KS các phân đoạn bằng khoanh giấy lọc. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1
Các phân đoạn
S. flexneri Các phân đoạn
S. flexneri
(mm) s (mm) s
1 0 0 13 18,34 1,32
2 7,16 1,04 14 19,56 0,40
3 7,98 0,72 15 18,58 0,54
4 15,44 0,86 16 18,90 1,48
5 20,92 0,52 17 17,05 1,10
6 22, 03 1,02 18 17,60 0,52
7 20,42 0,60 19 16,53 0,60
8 19,56 0,26 20 15,66 0,74
9 20,96 0,74 21 15,42 0,30
10 19,00 0,22 22 13,05 0,82
11 18,48 0,48 23 13,52 0,50
12 18,38 0,32 24 12,76 0,18
Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 3-15 bằng hệ dung môi 4, hiện hình bằng S. flexneri ta được kết quả. (Bảng 3.15)
Bảng 3.15: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 3-15.
(Hiện hình VSV bằng S. flexneri)
Các phân đoạn Rf
Vết 1 Vết 2
3 0,83 -
4 0,83 -
5 0,83 -
6 0,83 -
7 0,83 0,72
8 0,83 0,72
9 0,83 0,72
10 0,83 0,72
11 - 0,72
12 - 0,72
13 - 0,72
14 - 0,72
15 - 0,72
Nhận xét: Từ phân đoạn 3-6 hiện trên bản mỏng chỉ duy nhất 1 vết đặt tên là vết KS1 (kháng sinh 1), ở các phân đoạn 11-15 hiện trên bản mỏng duy nhất 1 vết khác đặt tên là vết KS2 (kháng sinh 2). Các phân đoạn từ 7-10 xuất hiện 2 vết trên bản mỏng, ta gộp lại, đi cất quay thu được kháng sinh có màu đỏ tươi có m=0,048 g. Tiến hành chạy cột lần 2 lượng kháng sinh này với mục đích tách được chất 1 và chất 2.
Chạy cột lần 2 sử dụng hệ Ethylacetat:Methanol (40:1).
Bảng 3.16: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2.
Các phân đoạn
S.flexneri
(mm) s
1 21,32 0,56
2 21,18 0,76
3 20,60 0,84
4 20,00 0,56
5 18,78 1,46
6 16,84 0,60
7 15,20 0,72
8 13,40 1,02
9 12,34 1,08
10 12,44 0,50
Tiến hành sắc ký lớp mỏng 10 phân đoạn trên bằng hệ dung môi Ethylacetat:Methanol (40:1) thu được kết quả. (Bảng 3.17)
Bảng 3.17: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 1-10.
(Hiện hình VSV bằng S. flexneri)
Các phân đoạn Rf
Vết 1 Vết 2
1 0,59 -
2 0,59 -
3 0,59 -
4 0,58 -
5 0,59 0,45
6 - 0,46
7 - 0,46
8 - 0,45
9 - 0,46
10 - 0,47
Nhận xét: Từ phân đoạn 1-4 hiện trên bản mỏng chí duy nhất 1 vết là chất KS, gộp với các phân đoạn 3-6 ở lần 1, đem cất quay thu được chất KS1 tinh khiết với khối lượng là m1=0,016 g, hiệu suất tách là 15,00% so với kháng sinh thô ban đầu. Từ phân đoạn 6-10 hiện trên bản mỏng 1 vết là chất KS2, gộp với các phân đoạn 11-15 ở lần 1, đem cất quay thu được chất KS2 tinh khiết có khối lượng m2=0,009 g, hiệu suất tách 8,43% so với kháng sinh thô ban đầu.
3.12. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và sơ bộ xác định các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được
Nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh thu được là: 223oC.
Phổ IR (KBr) (hình P7) vmax cm-1: 3458,88 (-OH; =NH); 2939,11 và 2867,91 (-COOH có liên kết cầu hydroyxl); 1752,99 (ester); 1654,12 (N-H;
Amid; C=C); 1582,21 (N-H); 1309,57 (C-X fluoride; S=O; C-N); 1195,72 (C- X fluoride; C-O); 1099,85 (C-X fluoride; C-N; C-O); 668,42 (C-X: Cloride);
575,54 (C-X: Bromid, Iodide).
Phổ UV (EtOH) (hình P6) λmax: Phổ UV có 3 đỉnh hấp thụ ở các bước sóng 444 nm, 288 nm và 250 nm chứng tỏ trong cấu trúc của kháng sinh có thể có nhân thơm, có các liên kết bội dị hợp hoặc có các dị tố N, O, halogen…
Phổ khối (ESI-MS) (hình P8): m/z = 1291 [M-Na]+. Từ đó suy ra khối lượng phân tử dự kiến là 1268 đvC.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết Luận
Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã cơ bản hoàn thành các mục tiêu của khóa luận tốt nghiệp , kết quả thu được như sau:
Streptomyces 183.224 có 12/14 (88,71%) đặc điểm giống với Streptomyces albidus. Như vậy Streptomyces 183.224 gần giống với S.
albidus.
Chủng Streptomyces 183.224 đã được chọn lọc ngẫu nhiên và gây đột biến 02 lần bằng ánh sáng UV (lần 1,2) biến chủng sau chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến có hoạt tính KS tăng lên rõ rệt so với chủng ban đầu.
Lựa chọn môi trường lên men tối thích là MT2dt ( hoạt tính của chủng sau lên men cao hơn 105,25% so với MT1dt, 128,28% so với MT7dt khi thử hoạt tính bằng VSV kiểm định S. flexneri).
Kháng sinh do Streptomyces 183.224 sinh ra được chiết kiệt bằng dung môi Ethylacetat ở pH = 7.
Kháng sinh sau tinh chế có nhiệt độ nóng chảy là 223oC, từ phổ IR, UV có thể sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh có chứa nhân thơm, có các liên kết bội liên hợp và một số nhóm chức như –OH, =NH-, -C=C, -COOH…
2. Kiến nghị
Giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của Streptomyces 183.224 để dễ dàng nghiên cứu hơn.
Tiếp tục nghiên cứu, cải tạo giống bằng nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra các biến chủng siêu tổng hợp kháng sinh.
Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men (bằng cách thay đổi điều kiện lên men, thành phần môi trường, tốc độ lắc…).
Tìm quy trình chiết tách kháng sinh để nâng cao hiệu suất tinh chế và tạo kháng sinh tinh khiết.
Tiếp tục đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của kháng sinh tổng hợp được.
Thử tác dụng sinh học trên invitro, invivo để có ứng dụng trong thực tế.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Bộ môn Hóa phân tích (2006), Hóa phân tích 2, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 23-69, 125-147, 215-219, 318.
2. Bộ môn Vi sinh – Sinh học (2005), Thực tập Vi sinh – ký sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 37-54.
3. Bộ Y tế (2007), Dược lý học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2, tr. 130- 142.
4. Bộ Y tế (2007), Hóa hữu cơ, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 1, tr. 105- 119.
5. Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.
68-82, 115-133.
6. Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tập 2, tr. 26-40, 81-93.
7. Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, tr. 22-87.
8. Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết ứng dụng trong kiểm nghiệm và độc chất, trung tâm thông tin – Thư viện Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 40-41, 50-59.
9. Kiều Hữu Ảnh (1999), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr. 167-172.
10. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr. 11-16.
11. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.
15-16, 50-56.
12. Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, tr. 38-40.
13. Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái
Nguyên Luận văn thạc sỹ sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Thái Nguyên, tr. 3-16.
14. Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở công nghệ và sản xuất dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 42-54.
15. Lê Đình Lương (2000), Cơ sở di truyền học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, tr. 40-49.
16. Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác đinh các chất bằng dung môi hữu cơ, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, tr.
9-27.
17. Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr. 185-191.
18. Nguyễn Văn Thạch (2009), Công nghệ sinh học dược, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, tr. 14-57.
19. Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, tr. 9-49.
20. Trần Thị Thịnh (2001), Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 80.259 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
Tiếng Anh
21. Braủa AF, Rodrớguez M, Pahari P, Rohr J, Garcớa LA, Blanco G (2014), Activation and silencing of secondary metabolites in Streptomyces albus and Streptomyces lividans after transformation with cosmids containing the thienamycin gene cluster from Streptomyces cattleya, Archiv für Mikrobiologie, Germany.
22. E.B. Shirling and D.Gottlieb (1996), Methods for characterization of Streptomyces species, International journal of systematic Bacteriology, Vol.16, No.3, pp 313-340.
23. Poulsen M, Oh DC, Clardy J, Currie CR (2001), Chemical analyses of waspassociated streptomyces bacteria reveal a prolific potential for natural products discovery, Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, United States of America.
24. Tomoniko Tanura, Yuumi Ishida, Misaotoguro, Kazunori Hatano and Ken-Ichiro Suzuki (2008), Classification of Streptomyces tenebrarius, Higgins and kaster as Streptoalloterichus tenebarius nom, rev, comb.. and emended description of the genus Streptoalloterichus, Biological Resource center (NBRC), National Insiture of Techology and Evaluation, 2-5-8 Kazusaka Matari, Kisarazu, Chiba, Japan [ International journal of Systematic and Evolution Microbiology].
25. Zhang P, Wu H, Chen XL, Deng Z, Bai L, Pang X (2014), Regulation of the Biosynthesis of Thiopeptide Antibiotic Cyclothiazomycin by the Transcriptional Regulator SHJG8833 in Streptomyces hygroscopicus 5008. Journal of general microbiology, England.
Phục lục
Hình P1: Hình dạng chuỗi bào tử Streptomyces 183.224
Hình P2: Hình dạng bề mặt bào tử Streptomyces 183.224
Hình P3: Thử hoạt tính KS các biến chủng sau CLNN bằng phương pháp khối thạch (VSV kiểm định B. cereus)
Hình P4: Thử hoạt tính KS các phân đoạn sau chạy cột lần 1 bằng phương pháp khoanh giấy lọc (VSV kiểm định B. cereus)